一種檢測生長素類農(nóng)藥或其結(jié)構(gòu)類似物殘留的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測生長素類農(nóng)藥或其結(jié)構(gòu)類似物殘留的方法，其特征在于，該方法包括：（1）摘取苗期大豆葉片，立即把葉柄浸入液體樣本中1小時(shí)，從液體樣本中取出大豆葉片用于總RNA的提?。煌瑫r(shí)取清水處理大豆葉片作對(duì)照；（2）以SKIP16基因?yàn)閮?nèi)參，以GH3.6為標(biāo)志基因，檢測GH3基因在步驟1處理過的大豆體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量；如果相對(duì)表達(dá)量大于5以上，則說明液體樣本中含有生長素類農(nóng)藥或與生長素農(nóng)藥類似結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥殘留。利用該方法可以高靈敏度的檢測液體樣本中的農(nóng)藥殘留。
【專利說明】一種檢測生長素類農(nóng)藥或其結(jié)構(gòu)類似物殘留的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)藥殘留檢測方法，特別屬于一種生長素類或結(jié)構(gòu)類似物殘留的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問題日益受到人們廣泛的關(guān)注，而生長素類農(nóng)藥，尤其是二氯喹啉、2，4-D等除草劑在水稻等作物田連年大量使用，造成這類除草劑在農(nóng)產(chǎn)品中殘留超標(biāo)。加強(qiáng)和建立對(duì)這類農(nóng)藥殘留的檢測方法和監(jiān)測技術(shù)研究對(duì)保障人們健康，保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。
[0003]目前農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測方法，大體上可分為兩類。一類是理化檢測法，它利用農(nóng)藥獨(dú)特理化性質(zhì)作為指標(biāo)來確定農(nóng)藥的種類和濃度。如分光光度法、原子吸收光譜法、薄層層析法、氣相色譜法、液相色譜法、同位素標(biāo)記法、核磁共振波譜法、毛細(xì)管電脈儀技術(shù)(CZE )，色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GC-MS、HPLC-MS )，超臨界流體色譜技術(shù)(SFC)，直接光譜分析技術(shù)等。但是，這些技術(shù)方法中最常用的是氣相色譜法和液相色譜法，具有靈敏高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，但是一些缺點(diǎn)使其應(yīng)用受到限制，如儀器昂貴、檢測成本高、儀器操作需專業(yè)人員，前處理要求較高，檢測同期長等缺點(diǎn)。
[0004]另外一類是生物檢測方法，其原理是利用農(nóng)藥獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)作為檢測農(nóng)藥的指標(biāo)。首先，在個(gè)體或組織水平上，利用農(nóng)藥對(duì)敏感生物的獨(dú)特的生長發(fā)育影響、如造成變色、畸形等表觀的改變?yōu)橹笜?biāo)來確定農(nóng)藥的種類和殘留量。如用玉米或其它指示植物根長受抑制來檢測土壤中磺酰脲類除草劑等。此法不需要儀器和前處理，對(duì)各種毒物都可以測定，但敏感生物不易獲得且敏感性不易保持，不能精確定量分析。其次蛋白質(zhì)水平上。如，根據(jù)有機(jī)磷類農(nóng)藥或氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿堿酯酶(AChE)的抑制效應(yīng)，開發(fā)的速測卡和速測儀，但該方法只能用于有 機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑檢測，其靈敏度受溫度影響，結(jié)果需用標(biāo)準(zhǔn)儀器檢驗(yàn)方法進(jìn)一步確認(rèn)。再如，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合的免疫分析法:酶聯(lián)免疫法(ELISA法)，特異性強(qiáng)，靈敏度高，但抗體制備比較困難，不能肯定試樣中的農(nóng)藥品種時(shí)，有一定的盲目性，易出現(xiàn)假陰，假陽性現(xiàn)象。
[0005]生物檢測方法比理化檢測方法更簡單環(huán)保，所以應(yīng)該大力發(fā)展生物檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明小組驚訝的發(fā)現(xiàn),利用植物中GH3 (Gretchen Hagen3)基因可以靈敏的檢測植物中生長素類農(nóng)藥或其結(jié)構(gòu)類似物殘留。
[0007]本發(fā)明選擇苗期剛離體的大豆葉片(來自3-5葉期植株)作為檢測對(duì)象，以離體葉片的葉柄部接觸吸收被檢樣品的水溶液，I小時(shí)后，提取大?葉片的總RNA,反轉(zhuǎn)錄后用PCR擴(kuò)增GH3基因，檢測處理大豆葉片中GH3表達(dá)量變化量。
[0008]一方面，本發(fā)明提供一種檢測液體樣本中是否含有生長素類農(nóng)藥或其結(jié)構(gòu)類似物殘留的方法，該方法包括:[0009](I)、摘取苗期大豆葉片，立即把葉柄侵入液體樣本中I小時(shí)，從藥液中取出大豆葉片用于總RNA的提??；同時(shí)取清水處理大豆葉片作對(duì)照；
[0010](2)、以SKIP16基因?yàn)閮?nèi)參，以GH3.6為標(biāo)志基因；檢測GH3基因在步驟I處理過的大豆體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量；如果相對(duì)表達(dá)量大于5以上，則說明書樣本中含有生長素類農(nóng)藥或與生長素農(nóng)藥類似的結(jié)構(gòu)。
[0011]在一些優(yōu)選的方式中，內(nèi)參SKIP16基因的序列為⑶397253 ；GH3基因的序列為XM_003543231.1 ;檢測內(nèi)參基因的引物序列為GAGCCCAAGACATTGCGAGAG和CGGAAGCGGAAGAACTGAACC ;檢測 GH3 基因的引物序列為:CTCCACCAAAGACTATGTTCTTGAAGA 和CTCTTGAAGGTGTCAGGGTCGA。
[0012]在一些優(yōu)選的方式中，相對(duì)表達(dá)量大于10-15。優(yōu)選的,相對(duì)表達(dá)量為10或15.[0013]在另一些優(yōu)選的方式中，所述的生長素農(nóng)藥為苯氧羧酸類，二氯喹啉酸或多菌靈中的一種或幾種。在另一些優(yōu)選的方式中，所述的生長素農(nóng)藥為二氯喹啉酸。
[0014]在一些優(yōu)選的方式中，相對(duì)表達(dá)量的檢測采用Real-Time PCR，其條件如下:
[0015]內(nèi)參基因的反應(yīng)體系如下:總體積為25ul，其中ddH20:10.5ul ;SYBR Premixex TaqTM(2X):12.5ul ;PCR_F(IOuM):0.5ul ；PCR-R(IOuM):0.5ul ；模板 cDNA:1.0ul ；標(biāo)志基因的反應(yīng)體系如下:總體積為25ul，其中ddH20:10.5ul ；SYBR Premix exTaqTM(2 X):12.5ul ；PCR-FI (IOuM):0.5ul ；PCR-R1 (IOuM):0.5ul ;模板 cDNA:1.0ul ;反應(yīng)條件:95°C，lmin ;45個(gè)循環(huán):95°C，IOsec ；62°C，在25sec收集熒光熔點(diǎn)曲線分析，55°Cto95°C。
[0016]在另一些優(yōu)選的方式中，所述的液體樣本來自植物組織的提取液，或者環(huán)境土壤、水、或者其他組織的提取液體。
[0017]在另一方面，本發(fā)明提供一種GH3基因的新用途，一種把GH3基因作為檢測生長素類農(nóng)藥或其結(jié)構(gòu)類似物殘留的用途。
[0018]優(yōu)選的方式中，根據(jù)所述的用途，其中，檢測GH3基因的表達(dá)量來檢測液體樣本中是否含有生長素類農(nóng)藥或其結(jié)構(gòu)類似物殘留，其中檢測方法如下:
[0019](I)、摘取苗期大豆葉片，立即把葉柄浸入液體樣本中I小時(shí)，從液體樣本中取出大豆葉片用于總RNA的提?。煌瑫r(shí)取清水處理大豆葉片作對(duì)照；
[0020](2)、以SKIP16基因?yàn)閮?nèi)參，以GH3.6為標(biāo)志基因，檢測GH3基因在步驟I處理過的大豆體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量；如果相對(duì)表達(dá)量大于5以上，則說明書液體樣本中含有生長素類農(nóng)藥或與生長素農(nóng)藥類似結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥殘留。
[0021]有益效果
[0022]標(biāo)志基因法檢測農(nóng)產(chǎn)品中殘留農(nóng)藥具有一定的優(yōu)勢(shì)，首先它可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量的樣品量檢測，檢測周期短、出結(jié)果快，只需要幾個(gè)小時(shí)便可得結(jié)果。本發(fā)明的方法可迅速排除絕大多數(shù)非生長素類農(nóng)藥，確定被測樣品中是否含有生長素類農(nóng)藥，可大幅度縮小盲樣的檢測范圍，基本上可定性決斷存在生長素類農(nóng)藥，因而可以作為儀器檢測前的補(bǔ)充方法?？蓽p少儀器檢測的盲目性。另外，本發(fā)明的方法可以極大的提高檢測的靈敏度，那些依靠液相色譜儀器不能檢測的農(nóng)藥殘留，通過本發(fā)明的方法也可以檢測得出來。
【專利附圖】

【附圖說明】[0023]圖1為標(biāo)志基因只被激素類農(nóng)藥或其結(jié)構(gòu)類似物誘導(dǎo)10倍以上的比較圖，其中1.清水對(duì)照；2.草甘膦；3.2甲4氯；4.乙草胺；5.二甲戊靈；6.甲磺隆；7.莠去津；8.蓋草能；9.百草枯；10.二氯喹啉酸；11.氟蟲腈；12.毒死蜱；13.阿維菌素；14.吡蟲啉；15.氯氟氰菊酯；16代森錳鋅；17.戊唑醇；18.多抗霉素；19.井網(wǎng)霉素；20.百菌清；21.多菌靈。
[0024]圖2為標(biāo)志基因GH3的相對(duì)表達(dá)量與目標(biāo)農(nóng)藥二氯喹啉酸濃度之間的關(guān)系。濃度O為清水對(duì)照，濃度I為最高濃度(常規(guī)濃度0.5g/L)，8為最低渡，6為二氯喹啉酸的HPLC的檢出限。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1
[0026]此部分的材料與方法用于證明，GH3基因只受生長素類農(nóng)藥或其類似物的誘導(dǎo)表達(dá)量達(dá)10倍以上。證明GH3基因表達(dá)與生長素類農(nóng)藥或其類似物的定性關(guān)系，也就是要證明GH3基因可以作為檢測生長素類農(nóng)藥或其類似物的標(biāo)志基因。
[0027]1.1 材料
[0028]植物:3-5葉期大豆植株(浙春3號(hào))。
[0029]農(nóng)藥:根據(jù)作用機(jī)理不同，市購20種生產(chǎn)上常用農(nóng)藥。其中包括9種除草劑、5種殺蟲劑和6種殺菌劑(表1)。
[0030]表1本實(shí)驗(yàn)中使用的農(nóng)藥
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測生長素類農(nóng)藥或其結(jié)構(gòu)類似物殘留的方法，其特征在于，該方法包括: (1)、摘取苗期大豆葉片，立即把葉柄浸入液體樣本中I小時(shí)，從液體樣本中取出大豆葉片用于總RNA的提??；同時(shí)取清水處理大豆葉片作對(duì)照； (2)、以SKIP16基因?yàn)閮?nèi)參，以GH3.6為標(biāo)志基因，檢測GH3基因在步驟I處理后的大豆體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量； 如果相對(duì)表達(dá)量大于5以上，則說明書液體樣本中含有生長素類農(nóng)藥或與生長素農(nóng)藥類似結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥殘留。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的內(nèi)參SKIP16基因的序列為在基因庫中編號(hào)為⑶397253所示的序列；GH3基因的序列為在基因庫中編號(hào)為XM_003543231.1所示的序列；內(nèi)參基因的引物序列為GAGCCCAAGACATTGCGAGAG和CGGAAGCGGAAGAACTGAACC ；GH3 基因的引物序列為:CTCCACCAAAGACTATGTTCTTGAAGA 和 CTCTTGAAGGTGTCAGGGTCGA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，相對(duì)表達(dá)量為10-15。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，相對(duì)表達(dá)量為10或15。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，所述的生長素農(nóng)藥為苯氧羧酸類，二氯喹啉酸或多菌靈中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5之一所述的方法，其特征在于，所述的生長素農(nóng)藥為二氯喹啉酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一所述的方法，其特征在于，相對(duì)表達(dá)量的檢測采用Real-TimePCR，其中，內(nèi)參基因的反應(yīng)體系如下:總體積為25ul，其中ddH20: 10.5ul ；SYBR Premix exTaqTM (2X): 12.5ul ；PCR-F (IOuM): 0.5 ul ；PCR-R (IOuM): 0.5 ul ;模板 cDNA:1.0ul ;標(biāo)志基因的反應(yīng)體系如下:總體積為25ul，其中ddH20: 10.5ul ；SYBR Premix ex TaqTM(2X): 12.5ul ；PCR-FI (IOuM): 0.5 ul ；PCR-R1 (IOuM): 0.5 ul ;模板cDNA:1.0 ul ;反應(yīng)條件:95°C，Imin ;45 個(gè)循環(huán):95°C，IOsec ;62°C 25sec,在 55°C to 95°C 內(nèi)收集熒光熔點(diǎn)曲線進(jìn)行分析。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，所述的液體樣本來自植物組織的提取液，或者環(huán)境土壤、水。
9.一種把GH3基因作為檢測生長素類農(nóng)藥或其結(jié)構(gòu)類似物殘留的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中，檢測GH3基因的表達(dá)量來檢測液體樣本中是否含有生長素類農(nóng)藥或其結(jié)構(gòu)類似物殘留，其中檢測方法如下: (1)、摘取苗期大豆葉片，立即把葉柄浸入液體樣本中I小時(shí)，從液體樣本中取出大豆葉片用于總RNA的提?。煌瑫r(shí)取清水處理大豆葉片作對(duì)照； (2)、以SKIP16基因?yàn)閮?nèi)參，以GH3.6為標(biāo)志基因，檢測GH3基因在步驟I處理過的大豆體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量；如果相對(duì)表達(dá)量大于5以上，則說明書液體樣本中含有生長素類農(nóng)藥或與生長素農(nóng)藥類似結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥殘留。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103468795SQ201310340704
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月7日
【發(fā)明者】李崗, 王強(qiáng), 蔡磊明, 吳聲敢, 趙學(xué)平, 吳長興 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院