一種高效分泌表達異源蛋白的載體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領域中表達載體，具體地說，涉及一種高效分泌表達異源蛋白的載體及其應用。高效分泌表達異源蛋白的編碼信號肽為SEQID NO.1中堿基序列所示。高效分泌表達異源蛋白的載體，含有一條特定的核苷酸序列，該序列為啟動子和編碼信號肽的核苷酸序列；結構圖示為：啟動子序列、編碼信號肽的核苷酸序列、6×His標簽序列和PmaCI酶切位點；所述啟動子為T7啟動子，編碼信號肽為微桿菌（Microbacterium sp.OU01）的殼聚糖酶信號肽。本發(fā)明載體在高效分泌表達外源基因的同時有效地提高表達產物的水溶性，利用親和層析一步純化即可以得到具有生物活性的重組蛋白。
【專利說明】一種高效分泌表達異源蛋白的載體及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域中表達載體，具體地說，涉及一種高效分泌表達異源蛋 白的載體及其應用。

【背景技術】
[0002] 隨著分子生物學技術的發(fā)展和大規(guī)模測序技術的進步，大量具有重要應用前景的 功能基因被挖掘出來。利用基因工程對功能基因進行重組表達，可以獲得具有生物學活性 的功能蛋白。蛋白的體外重組表達系統(tǒng)包括原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)，以大腸桿菌為 代表的原核表達系統(tǒng)具有操作簡單、表達迅速、高效等優(yōu)點，成為最受關注的表達系統(tǒng)。
[0003] 在大腸桿菌體外重組表達系統(tǒng)中，包涵體的形成、重組蛋白分離純化過程中的蛋 白變性和復性等問題嚴重制約了功能基因產品的規(guī)?；苽?。分泌表達作為一種重要的表 達方式被廣泛采用。分泌表達指重組異源蛋白通過一定的方式(運輸或者分泌)定位于細胞 周質，甚至穿過細胞外膜進入培養(yǎng)基中。重組蛋白的分泌表達一般通過將一段信號肽序列 嵌合到目的基因上游，在基因翻譯過程中將表達產物整合到新生肽鏈的N端序列上，進而 與細菌細胞膜的特異性受體識別并結合，引導生成的目的多肽分泌到細胞外周質空間或發(fā) 酵培養(yǎng)基中；在穿膜過程中，信號肽被宿主編碼的信號肽酶切除，從而更有利于形成目的蛋 白的天然N-末端。此外，大腸桿菌細胞周質是一個氧化還原的環(huán)境，存在一系列的酶，有利 于重組蛋白內-硫鍵的形成以及增強含有疏基蛋白的正確折置，并減少重組蛋白對宿主菌 的毒性，增加宿主菌的適應性。此外，細胞周質空間和胞外培養(yǎng)基中的宿主蛋白含量很低， 也有利于目的蛋白的分離純化。目前，制約重組蛋白分泌表達一個重要因素是高效分泌表 達信號肽的欠缺，在前期研究中，人們也陸續(xù)發(fā)現了包括大腸桿菌外膜蛋白信號肽ompA在 內的許多可以實現異源蛋白分泌表達的信號肽，但是在實際應用中，其分泌表達效率較低， 導致規(guī)?；苽浞置诒磉_蛋白的得率低，目的蛋白的生產成本高。因此，尋找更為高效的信 號肽對于分泌表達蛋白的規(guī)?；苽渚哂兄匾饬x。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現有分泌表達載體所用的信號肽分泌效率低的不足，提供 一種高效分泌表達異源蛋白的信號肽，以及含有該信號肽的重組表達載體及其應用。
[0005] 為了實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：
[0006] -種高效分泌表達異源蛋白的編碼信號肽，高效分泌表達異源蛋白的編碼信號肽 為SEQIDNO. 1中堿基序列所示。
[0007] 高效分泌表達異源蛋白的載體，含有一條特定的核苷酸序列，該序列為啟動子和 編碼信號肽的核苷酸序列；結構圖示為：啟動子序列、編碼信號肽的核苷酸序列、6XHis標 簽序列和PmaCI酶切位點；所述啟動子為17啟動子，編碼信號肽為微桿菌（Microbacterium sp.OUOl)的殼聚糖酶信號肽。所述載體帶有PmaCI的單酶切位點，所述復制起點為pUC。所 述載體的受體菌的復制原點及高拷貝復制原點為florigin和pUCorigin。
[0008] 高效分泌表達異源蛋白載體的構建方法，
[0009] 1)以CHISP-F/CHISP-R為引物對，Microbacteriumsp. 0U01 的基因組DNA為模板， 擴增所得產物如SEQIDNO. 1中堿基序列所示，PCR產物再經限制性內切酶NdeI和EcoR I進行雙酶切，回收含有雙酶切位點的片段；

【權利要求】
1. 一種高效分泌表達異源蛋白的編碼信號肽，其特征在于：高效分泌表達異源蛋白的 編碼信號肽為SEQ ID NO. 1中堿基序列所示。
2. -種權利要求1所述的高效分泌表達異源蛋白的載體，其特征在于：含有一條特定 的核苷酸序列，該序列為啟動子和編碼信號肽的核苷酸序列；結構圖示為：啟動子序列、編 碼信號肽的核苷酸序列、6XHis標簽序列和PmaCI酶切位點；所述啟動子為17啟動子，編 碼信號肽為微桿菌（Microbacterium sp. 0U01)的殼聚糖酶信號肽。
3. 按權利要求2所述的高效分泌表達異源蛋白的載體，其特征在于：所述載體帶有 PmaCI的單酶切位點，所述復制起點為pUC。
4. 按權利要求2所述的高效分泌表達異源蛋白的載體，其特征在于：所述載體的受體 菌的復制原點及高拷貝復制原點為florigin和pUC origin。
5. -種權利要求2所述的高效分泌表達異源蛋白載體的構建方法，其特征在于： 1) 以 CHISP-F/CHISP-R 為引物對，Microbacterium sp. OUOl 的基因組 DNA 為模板，擴 增所得產物如SEQ ID NO. 1中堿基序列所示，PCR產物再經限制性內切酶Nde I和EcoR I 進行雙酶切，回收含有雙酶切位點的片段；
2) 以MIH/pCR T7/NT T0P0 T質粒為基礎質粒，利用限制性內切酶NdeI和EcoR I進行 雙酶切，回收大片段；將回收的片段與步驟1)回收的含有雙酶切位點的片段利用T4DNA連 接酶連接后進行轉化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，篩選得到陽性克隆含有的高效分泌表達 異源蛋白重組載體，即為PCT7-CHISP6H。
6. -種權利要求2所述的高效分泌表達異源蛋白載體的應用，其特征在于：所述載體 在微桿菌(Microbacterium sp. 0U01)與芽孢桿菌（Bacillus sp. S-I)的殼聚糖酶成熟肽分 泌表達中的應用。
【文檔編號】C12N15/66GK104342445SQ201310314724
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月24日 優(yōu)先權日:2013年7月24日
【發(fā)明者】張繼泉, 孫玉英, 相建海 申請人:中國科學院海洋研究所