一種快速鑒定和定量單鏈小分子核酸組合的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速鑒定和定量單鏈小分子核酸組合的方法。具體地，本發(fā)明提供了一種使用核酸序列雜交技術(shù)，在層析介質(zhì)上通過專一性的抗原抗體反應(yīng)來快速鑒定并半定量至少一種序列專一的單鏈小分子核酸或多種序列不同的單鏈小分子核酸組合的方法。這種方法特別適合應(yīng)用在針對各種疾病相關(guān)的小分子核糖核酸(miRNA)變化的定性和半定量的測定。
【專利說明】一種快速鑒定和定量單鏈小分子核酸組合的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及核酸檢測領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種快速鑒定和定量單鏈小分 子核酸組合的方法，側(cè)流片和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 由現(xiàn)代細(xì)胞和分子生物學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)在分子水平上受到多種 因素的嚴(yán)格調(diào)控。調(diào)控分為基因轉(zhuǎn)錄前調(diào)控和基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及信使核糖核酸翻譯前調(diào) 控和信使核糖核酸翻譯后調(diào)控。其中一種重要的調(diào)控機(jī)制是通過非編碼短鏈核糖核酸專一 性結(jié)合在信使核糖核酸的3'端的互補(bǔ)序列，來抑制信使核糖核酸的蛋白質(zhì)翻譯過程。抑制 效果的產(chǎn)生一方面是通過結(jié)合后引入了核酸酶結(jié)合位點，導(dǎo)致該信使核糖核酸被核酸酶降 解，另一方面是結(jié)合產(chǎn)生的局部雙鏈結(jié)構(gòu)，阻止了核糖體對信使核糖核酸的蛋白質(zhì)翻譯過 程。這種非編碼的短鏈核糖核酸一般被稱為小分子核糖核酸（miRNA)。
[0003] miRNA是一類小分子的核糖核酸，長度按已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNA的數(shù)據(jù)庫查詢一般介 于15-30個核苷酸之間。在miRNA被發(fā)現(xiàn)后，引起眾多科學(xué)研究人員的關(guān)注，通過近10多 年來分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)方面的研究，發(fā)現(xiàn)有多種miRNA和癌癥有直接的相關(guān)性，有的 miRNA的含量在癌癥患者中升高，有的則降低，導(dǎo)致受它們調(diào)控的相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)量的降 低和升高，幫助癌細(xì)胞的生長和擴(kuò)散。另外有些miRNA在免疫應(yīng)答和心血管疾病中也產(chǎn)生 變化。
[0004] 隨著miRNA的研究的深入，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)，越來越多的miRNA與各類疾 病的相關(guān)性被確認(rèn)。miRNA在疾病的診斷和治療方面顯示出越來越大的重要性。目前已知 的miRNA檢測方法有：反轉(zhuǎn)錄實時鏈?zhǔn)綌U(kuò)增法（RT-Realtime PCR)，應(yīng)用雜交原理的微陣列 法（microarray)，以及傳統(tǒng)的雜交法。
[0005] 依照目前已知的技術(shù)，在檢測miRNA的時候都是針對一種序列專一的miRNA分子， 由于單一種類的miRNA在樣品中的含量比較少，為了提高檢測的靈敏度一般要在雜交法中 應(yīng)用較為靈敏的多點熒光標(biāo)記技術(shù)，或者核酸連接標(biāo)記熒光基團(tuán)技術(shù)，這種技術(shù)的應(yīng)用往 往不會使用miRNA全核酸序列進(jìn)行雜交，雖然靈敏度有提高，但是其雜交專一性就有所下 降，導(dǎo)致準(zhǔn)確性降低。
[0006] 另外一種方法是通過核糖核酸反轉(zhuǎn)錄實時鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)來提高檢測的靈敏度，但 是由于核酸合成酶的準(zhǔn)確性不是1〇〇%，在擴(kuò)增過程中引入一個錯誤的核苷酸，就會導(dǎo)致檢 測準(zhǔn)確性的下降。而且上述的方法檢測的成本都比較高，都需要價格比較高的熒光檢測設(shè) 備并進(jìn)行較為復(fù)雜的標(biāo)記反應(yīng)，這樣可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果和人為導(dǎo)入的誤差。
[0007] 綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要一種準(zhǔn)確度高，檢測效率高，低成本的miRNA檢測方 法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確度高，檢測效率高，低成本的miRNA檢測方法。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測樣品中單鏈小分子核酸的方法，所述方法包 括步驟：
[0010] ⑴將待測樣品與檢測溶液混合，形成檢測混合物；
[0011] 其中，所述檢測溶液含有檢測探針、捕獲探針和報告探針，并且所述檢測探針具 有：分別位于側(cè)翼的捕獲探針結(jié)合區(qū)和報告探針結(jié)合區(qū)，以及位于所述捕獲探針結(jié)合區(qū)和 所述報告探針結(jié)合區(qū)之間的目標(biāo)核酸分子結(jié)合區(qū)；
[0012] α υ使所述檢測混合物進(jìn)行雜交反應(yīng)，從而形成含"目標(biāo)核酸分子-捕獲探針-報 告探針-檢測探針"四元復(fù)合物的、雜交后的檢測混合物；
[0013] (iii)將所述雜交后的檢測混合物在層析介質(zhì)上進(jìn)行層析，其中所述的層析介質(zhì) 設(shè)有一個或多個復(fù)合物捕獲區(qū)，從而將所述四元復(fù)合物捕獲于所述的復(fù)合物捕獲區(qū)，形成 一條或多條層析帶；以及
[0014] (iv)檢測所述層析帶中所述四元復(fù)合物的存在與否和/或數(shù)量，從而確定所述樣 品中小分子核酸的存在與否和/或數(shù)量。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針結(jié)合區(qū)、報告探針結(jié)合區(qū)和miRNA結(jié)合區(qū)是緊 鄰的。（間隔區(qū)的堿基數(shù)為〇或1個）。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測方法為定量或半定量檢測。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的樣品中包含至少一種序列專一的單鏈小分子核酸 (miRNA)。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的樣品中包含多種序列不同的單鏈小分子核酸組合。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的層析介質(zhì)是纖維素膜。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針、檢測探針和報告探針為脫氧核糖核酸寡聚核 苷酸，且所述各探針的序列為外源性序列。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述捕獲區(qū)的數(shù)量為1-20個，較佳地2-10個，更佳地2-5個，最 佳地設(shè)有2-4個捕獲區(qū)。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針帶有或連有結(jié)合基團(tuán)，而所述的復(fù)合物捕獲區(qū) 固定有捕獲基團(tuán)，所述的捕獲基團(tuán)特異性捕獲或結(jié)合于所述的結(jié)合基團(tuán)。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述捕獲探針的結(jié)合基團(tuán)標(biāo)記在5'端或3'端。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合基團(tuán)選自下組：生物素（biotin)、熒光素、Cyanine染 料、抗原、配基。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述捕獲基團(tuán)選自下組：親和素、熒光素抗體、Cyanine染料抗 體、抗體、配體。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合基團(tuán)選自下組：生物素（biotin)、熒光素 (fluorescein)、熒光染料 Cy3 (C31H37KN2O8S2)，或其組合。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合基團(tuán)通過化學(xué)修飾共價交聯(lián)于捕獲探針。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，捕獲探針的結(jié)合基團(tuán)與捕獲探針的5'端核苷酸形成專一性結(jié) 合，通過其中的報告探針的報告基團(tuán)產(chǎn)生顯色反應(yīng)。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述捕獲探針的5'末端的結(jié)合基團(tuán)與層析介質(zhì)特定位置上的 結(jié)合蛋白或抗體相結(jié)合，從而使層析介質(zhì)上產(chǎn)生可見的色帶。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的報告探針帶有或連有報告基團(tuán)或可檢測標(biāo)記。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述報告探針與所述報告基團(tuán)或可檢測標(biāo)記通過共價交聯(lián)方式 連接。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述報告基團(tuán)為可以產(chǎn)生顯色反應(yīng)的基團(tuán)，較佳地選自下組：納 米金顆粒、堿性磷酸酯酶，或其組合。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述報告基團(tuán)可以標(biāo)記在3'端或5'端。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，當(dāng)報告基團(tuán)標(biāo)記在3'端時，所述雜交檢測反應(yīng)配合使用在5'端 標(biāo)記有結(jié)合基團(tuán)的捕獲探針，以及報告探針的互補(bǔ)序列在5'端，捕獲探針序列在3'端的檢 測探針。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，當(dāng)報告基團(tuán)標(biāo)記在5'端時，所述雜交檢測反應(yīng)配合使用在3'端 標(biāo)記有結(jié)合基團(tuán)的捕獲探針，以及報告探針的互補(bǔ)序列在3'端，捕獲探針序列在5'端的檢 測探針。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測探針具有選自下組的一個或多個特征：
[0037] 所述捕獲探針結(jié)合區(qū)是捕獲探針的互補(bǔ)序列；
[0038] 所述報告探針結(jié)合區(qū)是報告探針的互補(bǔ)序列；和
[0039] 所述的目標(biāo)核酸分子結(jié)合區(qū)是待檢測目標(biāo)核酸分子的互補(bǔ)序列。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測探針具有位于的3'端的捕獲探針的互補(bǔ)序列，位于5' 端的報告探針的互補(bǔ)序列，以及位于捕獲探針互補(bǔ)序列和報告探針互補(bǔ)序列之間的目標(biāo)核 酸分子的互補(bǔ)序列。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測探針具有位于5'端的捕獲探針的互補(bǔ)序列，位于3'端 的報告探針的互補(bǔ)序列，以及位于捕獲探針互補(bǔ)序列和報告探針互補(bǔ)序列之間的目標(biāo)核酸 分子的互補(bǔ)序列。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述檢測探針為上述探針時，所述的捕獲探針是3'端標(biāo)記有 結(jié)合基團(tuán)的捕獲探針；且所述的報告探針是5'端標(biāo)記有報告基團(tuán)的報告探針。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述方法具有以下的一個或多個特征：
[0044] 捕獲探針結(jié)合區(qū)的長度Nl = 10-30個核苷酸；和/或
[0045] 報告探針結(jié)合區(qū)的長度N2 = 10-30個核苷酸；和/或
[0046] miRNA結(jié)合區(qū)的長度N3 = 10-30個核苷酸；和/或
[0047] 檢測探針序列的總長度M = 32-90個核苷酸。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)合物捕獲區(qū)上連接有用于檢測小分子核酸分子的結(jié)合 蛋白或抗體。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述的用于檢測小分子核酸分子的結(jié)合蛋白或抗體選自下組： 生物素結(jié)合蛋白，抗熒光素抗體，抗熒光染料Cy3抗體，或其組合。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合蛋白或抗體是標(biāo)記捕獲探針的結(jié)合基團(tuán)的抗體。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合蛋白或抗體用于結(jié)合捕獲探針序列。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述層析介質(zhì)上還設(shè)有陽性對照區(qū)域，所述陽性對照區(qū)域上連 接有用于直接檢測報告基團(tuán)的結(jié)合蛋白或抗體。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述的直接檢測報告基團(tuán)的結(jié)合蛋白或抗體選自下組：納米金 顆粒結(jié)合蛋白、抗納米金抗體、堿性磷酸酯酶結(jié)合蛋白、抗堿性磷酸酯酶抗體，或其組合。
[0054] 在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合蛋白或抗體與報告基團(tuán)結(jié)合，從而使層析介質(zhì)上產(chǎn)生 陽性對照條帶。
[0055] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種側(cè)流片，所述側(cè)流片包括層析介質(zhì)、位于層析介質(zhì) 一端的加樣區(qū)、和位于層析介質(zhì)另一端的任選的吸水片，以及用于固定層析介質(zhì)的夾持和 固定材料，其特征在于，
[0056] 所述層析介質(zhì)上設(shè)有一個或多個連接有捕獲基團(tuán)的捕獲區(qū)，用于捕獲結(jié)合基團(tuán)；
[0057] 所述層析介質(zhì)上設(shè)有連接有直接檢測報告基團(tuán)的陽性對照區(qū)，用于結(jié)合報告基 團(tuán)；和
[0058] 所述層析介質(zhì)上還設(shè)有加樣區(qū)，用于加入待測樣品。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述捕獲基團(tuán)為抗結(jié)合基團(tuán)的抗體。
[0060] 在另一優(yōu)選例中，所述直接檢測報告基團(tuán)為抗報告基團(tuán)的抗體。
[0061] 在另一優(yōu)選例中，所述捕獲區(qū)的數(shù)量為1-20個，較佳地2-10個，更佳地2-5個，最 佳地設(shè)有2-4個捕獲區(qū)。
[0062] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測包含單鏈小分子核酸的樣品的試劑盒，其特 征在于，包括：
[0063] 檢測溶液，所述檢測溶液中包含捕獲探針、檢測探針和報告探針；
[0064] 一個或多個容器，用于盛放檢測溶液；
[0065] 如本發(fā)明第二方面所述的側(cè)流片；
[0066] 任選的加樣裝置；和
[0067] 說明書。
[0068] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有加樣裝置；較佳地，加樣裝置是滴管或毛細(xì) 管。
[0069] 在另一優(yōu)選例中，所述的層析介質(zhì)是纖維素膜。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒通過如本發(fā)明第一方面所述的方法檢測單鏈小分子 核酸。
[0071] 本發(fā)明的第四方面，提供了如本發(fā)明第一方面所述的側(cè)流片或如本發(fā)明第二方面 所述的試劑盒用于檢測待測樣品中的單鏈小分子核酸的用途。
[0072] 在另一優(yōu)選例中，所述待測樣品為生物樣品，較佳地選自下組：全血樣品、血清樣 品、體液樣品、唾液樣品、尿液樣品。
[0073] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種疾病預(yù)檢裝置，所述裝置包括本發(fā)明第二方面所 述的側(cè)流片，以及用于檢測所述側(cè)流片的檢測信號的檢測設(shè)備（或檢測器）。
[0074] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測設(shè)備檢測檢測所述層析帶中所述四元復(fù)合物的存在 與否和/或數(shù)量，從而確定所述樣品中小分子核酸的存在與否和/或數(shù)量。
[0075] 在另一優(yōu)選例中，所述側(cè)流片的層析介質(zhì)上設(shè)有1-5個捕獲區(qū)，較佳地設(shè)有2-4個 捕獲區(qū)，且所述側(cè)流片的層析介質(zhì)上還設(shè)有陽性對照區(qū)。
[0076] 在另一優(yōu)選例中，所述裝置可用于檢測與小分子核酸相關(guān)的疾病。
[0077] 在另一優(yōu)選例中，所述裝置可用于檢測選自下組的疾病：癌癥、心血管疾病、外源 性微生物感染。
[0078] 本發(fā)明第六方面，提供了一種檢測包含單鏈小分子核酸的樣品的方法，所述方法 包括：使用捕獲探針，檢測探針和報告探針，在層析介質(zhì)上通過專一性的抗原抗體反應(yīng)和/ 或蛋白質(zhì)和其專一性結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)的結(jié)合來快速鑒定單鏈小分子核酸含量。
[0079] 本發(fā)明的第七方面，提供了一種疾病的預(yù)檢方法，所述方法包括使用如本發(fā)明第 二方面所述的側(cè)流片或如本發(fā)明第三方面所述的試劑盒進(jìn)行檢測。
[0080] 在另一優(yōu)選例中，所述的疾病選自下組：癌癥、心血管疾病、外源性微生物感染。
[0081] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0082] 圖1顯示了本發(fā)明方法所用的探針和目標(biāo)核酸分子，其中，結(jié)合基團(tuán)（如結(jié)合基團(tuán) A、B 和 C)可選用生物素（biotin)，熒光素（fluorescein)或熒光燃料 Cy3 (C31H37KN2O8S2 ;Ex : 548nm，Em:562nm);報告基團(tuán)可選用納米金顆粒，熒光基團(tuán)或者酶標(biāo)記（如堿性磷酸酯酶）。
[0083] 圖2顯示了本發(fā)明的檢測方法示意圖，其中，捕獲探針與結(jié)合基團(tuán)結(jié)合后，與待檢 測的miRNA序列形成核苷酸，miRNA序列的另一端與一端連接有報告基團(tuán)的報告探針相連 接，形成與檢測探針互補(bǔ)的核酸序列，并與檢測探針經(jīng)過雜交后形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，且所 述結(jié)合基團(tuán)能夠被相應(yīng)條帶上的捕獲基團(tuán)捕獲。
[0084] 圖3顯示了本發(fā)明實施例2中的實際檢測效果圖。
[0085] 圖4顯示了本發(fā)明實施例3中的實際檢測效果圖。

【具體實施方式】
[0086] 本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，采用檢測探針、末端修飾的捕獲探 針和末端標(biāo)記的報告探針與樣品在合適條件下進(jìn)行雜交，并在層析介質(zhì)上進(jìn)行捕獲和顯 色，可非常高效和簡便地定性或定量地檢測樣品中的單鏈小分子核酸?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，發(fā)明 人完成了本發(fā)明。
[0087] 術(shù)語
[0088] 如本文所用，術(shù)語"外源性序列"指在目標(biāo)組織中不含有相同的序列的人工設(shè)計序 列。
[0089] 術(shù)語"結(jié)合基團(tuán)"指用于標(biāo)記捕獲探針的基團(tuán)，所述基團(tuán)與位于層析介質(zhì)上的用于 檢測小分子核酸分子的結(jié)合蛋白或抗體相結(jié)合從而將雜交的核酸分子固定在層析介質(zhì)上。 所述結(jié)合基團(tuán)可以是（但并不限于）生物素（biotin)、抗原或配基等能夠與特定基團(tuán)特異 性結(jié)合的基團(tuán)。
[0090] 術(shù)語"捕獲基團(tuán)"指用于與結(jié)合基團(tuán)特異性結(jié)合的基團(tuán)，所述基團(tuán)設(shè)置于層析介質(zhì) 上，與標(biāo)記在捕獲探針上的結(jié)合蛋白或抗體特異性結(jié)合，從而將雜交的核酸分子固定在層 析介質(zhì)上。所述的捕獲基團(tuán)可以是（但并不限于）生物素結(jié)合蛋白、抗原或配體等能夠與 特定基團(tuán)特異性結(jié)合的基團(tuán)。
[0091] 捕獲探針
[0092] 如圖1所示，捕獲探針是一條由10-30個核苷酸組成的脫氧核糖核酸寡聚核苷酸 鏈。它的一端標(biāo)記有結(jié)合基團(tuán)，較佳地為5'端。這個結(jié)合基團(tuán)可以是生物素（biotin)，熒 光素（fluorescein)或突光燃料 Cy3 (C31H37KN2O8S2 ;Ex :548nm, Em :562nm)其中的任意一種 或其組合。
[0093] 所述的結(jié)合基團(tuán)用于與層析介質(zhì)上的捕獲基團(tuán)相結(jié)合，從而使"目標(biāo)核酸分 子-捕獲探針-報告探針-檢測探針"四元復(fù)合物被層析介質(zhì)上的特定捕獲區(qū)捕獲。
[0094] 捕獲基團(tuán)為固定在層析介質(zhì)上的與捕獲探針專一性結(jié)合的基團(tuán)。捕獲基團(tuán)的 選取取決于捕獲探針的種類，通常可選用生物素結(jié)合蛋白（streptavidin, avidin或 neutravidin)，抗突光素抗體或抗突光染料Cy3的抗體，它們通過吸附交聯(lián)在層析介質(zhì)的 特定位點，并通過結(jié)合捕獲探針上的結(jié)合基團(tuán)捕獲經(jīng)過該位點的捕獲探針。
[0095] 當(dāng)4種核酸分子通過堿基配對形成的復(fù)合物達(dá)到一定濃度時，相應(yīng)的色帶就產(chǎn)生 顯色反應(yīng)，濃度的高低可以通過顯色條帶的深淺度和寬度在一定的范圍內(nèi)來進(jìn)行準(zhǔn)定量的 分析（如圖4所示）。
[0096] 在針對不同的目標(biāo)核酸分子檢測中，需要在層析介質(zhì)上分別設(shè)置不同的捕獲探針 序列。捕獲探針序列都是在目標(biāo)組織中并不含有的外源性人工設(shè)計的序列，通過常規(guī)方法， 如NIH(美國國立衛(wèi)生院）的基因數(shù)據(jù)庫的Blast程序進(jìn)行檢驗。
[0097] 報告探針
[0098] 如圖1所示，報告探針是一條由10-30個核苷酸組成的脫氧核糖核酸寡聚核苷酸 鏈。在針對不同的目標(biāo)核酸分子檢測中，報告探針的序列一般保持不變，它的序列是一個在 目標(biāo)組織中并不含有的外源性人工設(shè)計的序列，可通過NIH(美國國立衛(wèi)生院）的基因數(shù)據(jù) 庫的Blast程序檢驗（圖1)。
[0099] 報告探針的一端標(biāo)記有報告基團(tuán)，較佳地為3'端。當(dāng)報告基團(tuán)聚合到一定程度 時，會產(chǎn)生肉眼可以觀察到的顏色。報告基團(tuán)可以是納米金顆粒，也可以是熒光基團(tuán)或者酶 標(biāo)記，比如堿性磷酸酯酶。
[0100] 檢測探針
[0101] 如圖1所示，檢測探針是一條由32-90個核苷酸組成的脫氧核糖核酸寡聚核苷酸 鏈。它的一端側(cè)翼具有報告探針結(jié)合區(qū)，所述報告探針結(jié)合區(qū)為報告探針的互補(bǔ)序列，較佳 地位于5'端；它的另一端側(cè)翼具有捕獲探針結(jié)合區(qū)，所述捕獲探針結(jié)合區(qū)為捕獲探針的互 補(bǔ)序列，較佳地位于3'端，介于這兩個序列之間的是目標(biāo)核酸分子結(jié)合區(qū)，所述目標(biāo)核酸 分子結(jié)合區(qū)為目標(biāo)核酸分子（如miRNA)的互補(bǔ)序列。
[0102] 本發(fā)明的檢測探針用于與捕獲探針序列，目標(biāo)miRNA序列以及報告探針序列雜交 形成雙鏈結(jié)構(gòu)四元復(fù)合物。
[0103] 目標(biāo)核酸分子
[0104] 如圖1所示，目標(biāo)核酸分子是一條較短的核酸分子，長度介于12-30個核苷酸之 間。它可以是脫氧核糖核酸，也可以是核糖核酸。它可以是天然或生物體自由的核酸分子， 也可以是通過化學(xué)方法或生物工程方法人工合成的核酸分子。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，目標(biāo) 核酸分子為miRNA。
[0105] 層析介質(zhì)
[0106] 層析介質(zhì)是指一種介質(zhì)，它可以是不同孔徑的層析材料，如纖維素膜或者經(jīng)過一 定化學(xué)處理的纖維素膜，在介質(zhì)的另一端有吸取溶液的吸水片，當(dāng)樣品溶液在介質(zhì)的一端 的加樣孔加入，樣品溶液經(jīng)過虹吸現(xiàn)象向介質(zhì)的另一端擴(kuò)散。
[0107] 如圖4所示，在本發(fā)明的一個實施例中，使用時在層析介質(zhì)上依次設(shè)置一條或多 條檢測條帶（目標(biāo)核酸分子捕獲區(qū)），并在各條檢測條帶后設(shè)置一條陽性對照條帶。
[0108] 其中，所述的檢測條帶含有或固定有分別與待檢測序列的捕獲探針結(jié)合的相應(yīng)捕 獲基團(tuán)的抗體或結(jié)合蛋白，從而特異性地與相應(yīng)的捕獲基團(tuán)相結(jié)合，使與待檢測序列相應(yīng) 的條帶顯色。
[0109] 所述的陽性對照條帶為直接結(jié)合報告基團(tuán)的結(jié)合蛋白或抗體，如納米金顆粒結(jié)合 蛋白、抗納米金抗體、堿性磷酸酯酶結(jié)合蛋白或抗堿性磷酸酯酶抗體。所述結(jié)合蛋白或抗體 與報告基團(tuán)相結(jié)合，從而使陽性對照條帶顯色。
[0110] 核酸序列的雜交
[0111] 術(shù)語"雜交"是指單鏈的核糖核酸或脫氧核糖核酸和另一條或另一條其中的一段 完全互補(bǔ)的單鏈核糖核酸或脫氧核糖核酸中堿基配對，其堿基之間形成氫鍵的過程。
[0112] 所述的堿基配對可以是傳統(tǒng)的華生-克里克配對，也可以是擺動配對。一個典型 的擺動配對是鳥嘌呤和尿嘧啶的配對，它們之間形成2對氫鍵。
[0113] 雜交是在一定的反應(yīng)條件下進(jìn)行，對雜交的準(zhǔn)確性有影響的因素有雜交使用的溫 度，雜交液中的鹽濃度，在雜交溶液中探針分子的濃度以及在雜交溶液中摻入的其他化學(xué) 物質(zhì)，如聚乙醇6000, Formamid等。雜交的條件是依據(jù)要檢測的目標(biāo)核酸分子的長度和 其各類核苷酸的含量進(jìn)行調(diào)整，以達(dá)到專一，靈敏的要求。在本發(fā)明中，所述的雜交過程在 65-80°C下，或40?65°C下進(jìn)行。
[0114] 在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明方法所述核酸雜交的過程包括：
[0115] 捕獲探針的3'末端核苷酸與目標(biāo)miRNA的5'末端核苷酸形成相鄰的核苷酸；
[0116] 目標(biāo)miRNA的3'末端核苷酸和報告探針的5'末端核苷酸形成相鄰的核苷酸；和
[0117] 檢測探針與上述三個單鏈核酸分子進(jìn)行雜交配對。
[0118] 單鏈小分子核酸的檢測
[0119] 本發(fā)明提供的檢測樣品中單鏈小分子核酸的方法，包括：
[0120] (i)將待測樣品與檢測溶液混合，形成檢測混合物，其中所述檢測溶液含有檢測探 針、捕獲探針和報告探針，并且所述檢測探針的具有分別位于側(cè)翼的捕獲探針結(jié)合區(qū)和報 告探針結(jié)合區(qū)以及位于所述捕獲探針結(jié)合區(qū)和所述報告探針結(jié)合區(qū)之間的目標(biāo)核酸分子 結(jié)合區(qū)；
[0121] α υ進(jìn)行雜交反應(yīng)，從而形成含"目標(biāo)核酸分子-捕獲探針-報告探針-檢測探 針"四元復(fù)合物的檢測混合物；
[0122] (iii)將雜交后的檢測混合物在層析介質(zhì)上進(jìn)行層析，其中所述的層析介質(zhì)設(shè)有 一個或多個復(fù)合物捕獲區(qū)，從而將所述四元復(fù)合物捕獲于所述的復(fù)合物捕獲區(qū)，形成一條 或多條層析帶；
[0123] (iv)檢測所述層析帶中四元復(fù)合物的存在與否和/或數(shù)量，從而確定所述樣品中 小分子核酸的存在與否和/或數(shù)量。
[0124] 本發(fā)明檢測方法可作為定性檢測，也可作為定量或半定量檢測。
[0125] 如圖2所示，從介質(zhì)的加樣端到另一端的吸水片之間依次分別有針對一個或多個 捕獲探針的結(jié)合基團(tuán)的專一性的結(jié)合蛋白或免疫抗體條帶和一條能與報告基團(tuán)結(jié)合的捕 獲區(qū)（抗體條帶）。在擴(kuò)散過程中，所述探針與檢測樣品中的小分子核酸進(jìn)行雜交，使報 告基團(tuán)產(chǎn)生顯色反應(yīng)，并被結(jié)合基團(tuán)捕獲，使層析介質(zhì)上顯示出條帶，從而檢測目標(biāo)核酸分 子。
[0126] 當(dāng)捕獲探針、檢測探針、報告探針或目標(biāo)核糖核酸缺乏時，就不能形成穩(wěn)定的由4 個核酸分子構(gòu)成的四元復(fù)合物。尤其當(dāng)目標(biāo)核酸分子缺乏時，不能形成只有捕獲探針，報告 探針和檢測探針組成的3個核酸分子的復(fù)合物。當(dāng)這個含有由4個核酸分子形成的雙鏈結(jié) 構(gòu)四元復(fù)合物的溶液加在一個層析介質(zhì)上，向一定的方向擴(kuò)散。在層析介質(zhì)上有一條或多 條分別能和捕獲探針的結(jié)合基團(tuán)形成專一性結(jié)合的條帶，當(dāng)由4個核酸分子形成的雙鏈結(jié) 構(gòu)四元復(fù)合物分子經(jīng)過能和其中捕獲探針的結(jié)合基團(tuán)專一性結(jié)合的條帶，就結(jié)合在該條帶 上，當(dāng)此類分子富集時，就能通過其中的報告探針的報告基團(tuán)產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過這三個條 帶的顯色反應(yīng)的強(qiáng)弱，就可以用肉眼或儀器半定型地測算出所含的目標(biāo)核酸分子的含量。
[0127] 當(dāng)檢測多個miRNA分子時，根據(jù)各個條帶的顯色強(qiáng)弱程度，還可對待檢測序列進(jìn) 行半定量檢測。
[0128] 疾病預(yù)檢
[0129] 把針對一種疾病的相關(guān)miRNA進(jìn)行分類，分為（a)含量上升的miRNA，（b)含量下 降的miRNA和（c)作為對照含量不變或基本不變的miRNA。針對含量上升的miRNA使用同 一種捕獲探針，針對含量不變的miRNA使用同一種捕獲探針，針對含量降低的miRNA使用同 一種捕獲探針，通過以含量不變的miRNA做為對照，半定量含量上升或下降的miRNA，并和 健康組（或正常人群）對照，可以快速，準(zhǔn)確地判斷樣品是否患有此類疾病，是否需要做更 深入的檢查或長期觀察。這樣可以解決單一 miRNA含量過低以及出現(xiàn)的檢測誤差。
[0130] 使用本發(fā)明的檢測方法，可對各種不同類型的疾病進(jìn)行預(yù)檢。代表性的疾病包括 (但并不限于）：癌癥、心血管疾病、外源性微生物感染等。
[0131] 本發(fā)明的主要優(yōu)點：
[0132] (1)能夠更快速，半定量，更準(zhǔn)確地檢測待測樣品中的miRNA，實驗條件溫和，準(zhǔn)確 度高。
[0133] (2)能夠有效地用于一些與miRNA含量相關(guān)的疾病的預(yù)檢，如癌癥、心血管疾病、 外源性微生物感染。
[0134] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0135] 材料

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測樣品中單鏈小分子核酸的方法，其特征在于，包括步驟： (i) 將待測樣品與檢測溶液混合，形成檢測混合物； 其中，所述檢測溶液含有檢測探針、捕獲探針和報告探針，并且所述檢測探針具有：分 別位于側(cè)翼的捕獲探針結(jié)合區(qū)和報告探針結(jié)合區(qū)，以及位于所述捕獲探針結(jié)合區(qū)和所述報 告探針結(jié)合區(qū)之間的目標(biāo)核酸分子結(jié)合區(qū)； (ii) 使所述檢測混合物進(jìn)行雜交反應(yīng)，從而形成含"目標(biāo)核酸分子-捕獲探針-報告 探針-檢測探針"四元復(fù)合物的、雜交后的檢測混合物； (iii) 將所述雜交后的檢測混合物在層析介質(zhì)上進(jìn)行層析，其中所述的層析介質(zhì)設(shè)有 一個或多個復(fù)合物捕獲區(qū)，從而將所述四元復(fù)合物捕獲于所述的復(fù)合物捕獲區(qū)，形成一條 或多條層析帶；以及 (iv) 檢測所述層析帶中所述四元復(fù)合物的存在與否和/或數(shù)量，從而確定所述樣品中 小分子核酸的存在與否和/或數(shù)量。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的捕獲探針帶有或連有結(jié)合基團(tuán)，而 所述的復(fù)合物捕獲區(qū)固定有捕獲基團(tuán)，所述的捕獲基團(tuán)特異性捕獲或結(jié)合于所述的結(jié)合基 團(tuán)。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的報告探針帶有或連有報告基團(tuán)或可 檢測標(biāo)記。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的檢測探針具有選自下組的一個或多 個特征： 所述捕獲探針結(jié)合區(qū)是捕獲探針的互補(bǔ)序列； 所述報告探針結(jié)合區(qū)是報告探針的互補(bǔ)序列；和 所述的目標(biāo)核酸分子結(jié)合區(qū)是待檢測目標(biāo)核酸分子的互補(bǔ)序列。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的復(fù)合物捕獲區(qū)上連接有用于檢測小 分子核酸分子的結(jié)合蛋白或抗體；和/或 所述層析介質(zhì)上還設(shè)有陽性對照區(qū)域，所述陽性對照區(qū)域上連接有用于直接檢測報告 基團(tuán)的結(jié)合蛋白或抗體。
6. -種側(cè)流片，所述側(cè)流片包括層析介質(zhì)、位于層析介質(zhì)一端的加樣區(qū)、和位于層析介 質(zhì)另一端的任選的吸水片，以及用于固定層析介質(zhì)的夾持和固定材料，其特征在于， 所述層析介質(zhì)上設(shè)有一個或多個連接有捕獲基團(tuán)的捕獲區(qū)，用于捕獲結(jié)合基團(tuán)； 所述層析介質(zhì)上設(shè)有連接有直接檢測報告基團(tuán)的陽性對照區(qū)，用于結(jié)合報告基團(tuán)；和 所述層析介質(zhì)上還設(shè)有加樣區(qū)，用于加入待測樣品。
7. -種檢測包含單鏈小分子核酸的樣品的試劑盒，其特征在于，包括： 檢測溶液，所述檢測溶液中包含捕獲探針、檢測探針和報告探針； 一個或多個容器，用于盛放檢測溶液； 如權(quán)利要求6所述的側(cè)流片； 任選的加樣裝置；和 說明書。
8. 如權(quán)利要求6所述的側(cè)流片或如權(quán)利要求7所述的試劑盒的用途，其特征在于，用于 檢測待測樣品中的單鏈小分子核酸。
9. 一種疾病預(yù)檢裝置，其特征在于，所述裝置包括權(quán)利要求6所述的側(cè)流片，以及任選 的用于檢測所述側(cè)流片的檢測信號的檢測設(shè)備（或檢測器）。
10. -種檢測包含單鏈小分子核酸的樣品的方法，其特征在于，使用捕獲探針，檢測探 針和報告探針，在層析介質(zhì)上通過專一性的抗原抗體反應(yīng)和/或蛋白質(zhì)和其專一性結(jié)合的 化學(xué)基團(tuán)的結(jié)合來快速鑒定單鏈小分子核酸含量。
【文檔編號】C12M1/34GK104293897SQ201310301512
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】譚曉剛 申請人:譚曉剛