一種利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香料的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香料的方法，該方法使用的酶為一種克隆酶，具有脂氧合酶和氫過氧化物裂解酶樣雙功能，能利用單酶一步完成對亞麻酸、花生四烯酸、DHA、EPA等多不飽和脂肪酸的酶解反應，獲得不同碳數(shù)的短鏈天然烯醛類香料化合物。與現(xiàn)有技術相比，該方法反應條件溫和易控，反應效率高，無有害物質產(chǎn)生，反應成本低，且能與多種底物反應，獲得多種純天然的香料化合物。
【專利說明】一種利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香料的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及烯醛類香料的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香料 的方法。

【背景技術】
[0002] 烯醛類物質是天然香料和芳香劑的重要組成成分，微量存在于許多植物的揮發(fā) 性物質中，在植物的果實、葉、莖等組織以及海洋藻類中都能夠檢測到其存在。如：1-辛 烯-3-醇，又稱松蕈醇，是一種帶有強烈愉悅感的土壤香香氣、蘑菇香氣和甘草香氣融合的 化合物，自然界中主要存在于薄荷類、百里香以及鮮蘑菇中，屬于天然等同香料，在飲料、糖 果、冰制食品、烘烤食品、調味品及煙用香精中應用廣泛，是香料行業(yè)中一種有價值的香料。 2-壬烯醛是一種可以賦予一些食物以淡淡的木香香味的食用香料，自然界中主要存在于甜 瓜、桃子、葡萄、西紅柿、胡蘿卜、黃豆、芝麻等植物中，可以加到天然或合成增香的食物中， 如肉、咖啡冰淇淋、糖果以及其他飲料中，使食物的香味和香氣比天然物還濃厚，廣泛用于 調配日化香精和食用香精。3-已烯醛具有獨特優(yōu)雅的青香香氣，廣泛存在于綠色植物的葉 和果實中，是賦予植物葉子及果實等新鮮青香香氣的組分，目前廣泛用于調配香料。
[0003] 目前這類烯醛類香料主要以天然提取和化學合成為主，其中天然提取主要通過從 植物組織或植物精油中提取，但植物組織或植物精油中烯醛類物質含量非常低，不易分離， 且相關植物資源少，提取成本高，不能滿足市場的需求；而化學合成法也有諸多限制，如： 起始原料難于獲得、合成路線較長、副產(chǎn)物多、產(chǎn)品的精致和純化過程程序多、收率低，且?guī)?有嚴重的環(huán)境污染，因此許多開發(fā)研究工作僅停留在實驗階段，僅有少數(shù)國外企業(yè)投入生 產(chǎn)。
[0004] 近年來，人們開始嘗試通過酶法來合成烯醛類物質，如中國專利CN1563310A公開 了一種酶催化生產(chǎn)烯醛類香料的方法，該法以C 18?C2tl多元不飽和脂肪酸為原料，以從天然 植物組織中提取的"不飽和脂肪酸氧化酶與過氧化氫物裂解酶"組成的酶系為催化劑，在室 溫15?25°氧存在的條件下，使多元不飽和脂肪酸專一地酶催化裂解成烯醛類香料。中國 專利CN101225406A涉及一種利用番石榴組織中存在的酶合成天然香料的方法，該方法提 供一種以亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸等具有順、順-1，4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪 酸的底物，利用番石榴組織中存在的酶降解底物，合成具有天然風味香料的方法，其中番石 榴組織中存在的酶為番石榴果實中存在的脂肪氧化酶和過氧化氫物裂解酶。上述利用酶法 合成烯醛類物質的基本原理為：植物體內具有合成揮發(fā)性烯醛類芳香化合物的oxylipin 酶系催化合成途徑，其中脂氧合酶（LOX)以多不飽和脂肪酸為底物形成脂肪酸氫過氧化產(chǎn) 物，隨后氫過氧化脂肪酸裂解酶（HPL)以脂肪酸氫化氧化物為底物裂解形成不同碳數(shù)的烯 醛類揮發(fā)性物質。與化學合成法相比，酶法合成烯醛類物質效率高，產(chǎn)率高，且合成需要的 酶提取于自然植物對環(huán)境的污染小，但它也存在如下問題：1、植物脂氧合酶對底物具有專 一性，因此一套反應酶系，只能生產(chǎn)主要的一種烯醛類物質，不能同時獲得多種烯醛類物 質，所以產(chǎn)物單一；
[0005] 2、反應過程中需要同時控制兩種酶體系的反應條件，因此使得生產(chǎn)條件變得復雜 難控，不適合大規(guī)模生產(chǎn)；
[0006] 3、從植物中提取的反應酶以C18脂肪酸為反應底物，形成的揮發(fā)性物質主要是C6 的已烯醛，因此用該酶法不能獲得C8等來源于C20脂肪酸的揮發(fā)性香料；
[0007] 4、從植物中提取的反應酶為粗酶液，酶種類多、酶活不穩(wěn)定，導致產(chǎn)物不穩(wěn)定，不 適合生產(chǎn)化。


【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術而提供一種通過一步酶反應獲得多 種烯醛類物質的利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香料的方法。
[0009] 本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香 料的方法，其特征在于：以具有順，順-1，4-戊二烯結構的多不飽和脂肪酸為原料，利用一 種同時具有LOX和HPL樣功能的克隆酶PhLOX催化產(chǎn)生多種烯醛類香料，其包括以下步驟： [0010] 1)在所述克隆酶PhLOX純化溶液中加入游離的所述原料溶液，混勻形成反應液， 該反應液在20°C反應15min-lh ;
[0011] 2)在所述反應液中加入乙酸乙酯，4°C避光震搖萃取lh，收集上層乙酸乙酯相，然 后在下層相中再加入等量乙酸乙酯重復抽提一次后收集上層有機相，合并兩次收集液；
[0012] 3)在上述收集液中加入預冷的去離子水，震蕩混勻充分，冰浴5min，獲得的有機溶 劑相，在25°C旋轉蒸發(fā)濃縮獲得多種烯醛類物質。
[0013] 上述方案中的克隆酶PhLOX的氨基酸序列如SEQID NO. 2所述，其cDNA的核苷酸 序列如SEQID NO. 1所述；該克隆酶PhLOX的源基因來自壇紫菜，克隆過程中首先從壇紫菜 中提取總RNA，根據(jù)脂氧合酶基因序列設計引物，通過RACE技術擴增出全長cDNA序列，重組 到表達載體pET-28a，轉化大腸桿菌E. coli BL21，篩選出陽性克隆，通過誘導表達產(chǎn)生表達 量為2mg/L菌液的多功能克隆酶PhLOX。
[0014] 作為優(yōu)選，上述方案中克隆酶PhLOX溶液的反應濃度為10-30mg/L，所述原料溶液 濃度為 100-400 μ M。
[0015] 進一步，所述原料包括亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸（ΕΡΑ)、二十二碳四烯酸 (DHA)0
[0016] 所述烯醛類物質包括C-6, C-7, C-8, C-9, C-IO的醛類和醇類物質。
[0017] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明中使用的克隆酶PhLOX具有多種功 能，能通過一步反應催化裂解多不飽和脂肪酸產(chǎn)生具有天然香味的香料物質，反應條件溫 和易控，反應效率高，無有害物質產(chǎn)生，反應成本低，且能與多種底物反應，獲得多種純天然 的香料化合物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為實施例2中PhLOX催化亞麻酸的前后變化的LC示意圖；
[0019] 圖2為實施例3中PhLOX催化花生四烯酸的前后變化的LC示意圖；
[0020] 圖3為實施例4中PhLOX催化二十二碳四烯酸的前后變化的LC示意圖；
[0021] 圖4為實施例5中PhLOX催化二十碳五烯酸的前后變化的LC示意圖。

【具體實施方式】
[0022] 以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0023] 實施例1 :克隆酶PhLOX的制備
[0024] 1、以CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨法）提取壇紫菜葉狀體的基因組DNA，步驟 如下：
[0025] I) 65°C水浴預熱2%CTAB抽提液后，分裝15mL抽提液到50mL離心管中，加入0. 1% 的疏基乙醇，混勻待用；
[0026] 2)取500mg葉狀體，于無菌研缽中液氮快速研磨至粉末，后立即轉入CTAB抽提液 中；
[0027] 3)震蕩均勻后65°C水浴加熱60min，期間每IOmin反復顛倒離心管數(shù)次；
[0028] 4)放入離心機離心，離心條件為：4°C，8000rpm，lOmin，離心結束后吸上清；
[0029] 5)在上述上清液中加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液（比例為：25/24/1)，顛倒 數(shù)次，于 4°C，IOOOOrpm 離心 IOmin ;
[0030] 6)吸上清至新離心管中，重復5)抽提一次；
[0031] 7)吸上清，加 2/3體積異丙醇，輕顛倒混勻，-20°C放置3h沉淀DNA ;
[0032] 8) 4°C，lOOOOrpm，離心 lOmin，棄上清；
[0033] 9) 2mL75%酒精漂洗沉淀2次，然后于4°C，lOOOOrpm，離心10min，棄上清；
[0034] 10)在超凈工作臺上倒置離心管，至沉淀周圍水分晾干,用500 μ L無菌水溶解 DNA，-20°C保存待用。
[0035] 采用Takara RNAiso Plus kit(Takara，日本)，以trizol法提取壇紫菜葉狀體的 總 RNA。采用 Takara primescript RT reagent kit (Takara，日本)，對提取的壇紫菜葉狀 體總RNA進行反轉錄得到壇紫菜葉狀體總cDNA。
[0036] 在NCBI中搜索藻類脂氧合酶LOXs序列信息，采用Primer primer5軟件 設計可行性引物，進行壇紫菜脂氧合酶核心片段的克隆，其中特異性引物序列為 L0X-S1-5, CTCACCCGCAAGGGAGATGG3，
[0037] L0X-A1-5' TGGTAGGCCGCCGAGAAGAC3'，擴增353bp片段。分別以壇紫菜葉狀體的基 因組DNA和cDNA為模板進行PCR擴增，PCR程序見表1。
[0038] 表IPhLOX核心片段克隆的PCR程序

【權利要求】
1. 一種利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香料的方法，其特征在于：以具有順，順-1，4-戊二 烯結構的多不飽和脂肪酸為原料，利用一種同時具有LOX和HPL樣功能的克隆酶催化產(chǎn)生 多種烯醛類香料，其包括以下步驟： 1) 在所述克隆酶純化溶液中加入游離的所述原料溶液，混勻形成反應液，該反應液在 20°C反應 15min-lh ; 2) 在所述反應液中加入乙酸乙酯，4°C避光震搖萃取lh，收集上層乙酸乙酯相，然后在 下層相中再加入等量乙酸乙酯重復抽提一次后收集上層有機相，合并兩次收集液； 3) 在上述收集液中加入預冷的去離子水，震蕩混勻充分，冰浴5min，獲得的有機溶劑 相，在25°C旋轉蒸發(fā)濃縮獲得多種烯醛類物質。
2. 根據(jù)權利要求1所述的利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香料的方法，其特征在于：所述克 隆酶的氨基酸序列如SEQID NO. 2所述。
3. 根據(jù)權利要求2所述的利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香料的方法，其特征在于：所述克 隆酶的cDNA的核苷酸序列如SEQID NO. 1所述。
4. 根據(jù)權利要求3所述的利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香料的方法，其特征在于：所述克 隆酶溶液的反應濃度為10_30mg/L，所述原料溶液濃度為100-400μΜ。
5. 根據(jù)權利要求1所述的利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香料的方法，其特征在于：所述原 料包括亞麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA。
6. 根據(jù)權利要求1?5任一權利要求所述的利用單酶生產(chǎn)多種烯醛類香料的方法，其 特征在于：所述烯醛類物質包括C-6, C-7, C-8, C-9, C-10的醛類和醇類物質。
【文檔編號】C12P7/04GK104293837SQ201310299479
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權日:2013年7月16日
【發(fā)明者】陳海敏, 朱竹君, 陳娟娟, 嚴小軍 申請人:寧波大學