楊樹CesAs基因內(nèi)與木材品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能SSR標記、其應用及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種楊樹CesAs基因內(nèi)與木材品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能SSR標記、其應用及試劑盒。其中，該功能SSR標記包括7A-SSR2和7B-SSR1，7A-SSR2位于楊樹CesA7-A外顯子3區(qū)域，為(TGA)n；7B-SSR1位于CesA7-B內(nèi)含子4區(qū)域，為(TTAA)m。本發(fā)明確定的這些功能標記位點為早期篩選優(yōu)異種質(zhì)，縮短林木育種周期提供了新的技術(shù)手段，同時也為改良木材品質(zhì)性狀的分子研究提供遺傳學證據(jù)，對于提高我國林木遺傳育種工程的發(fā)展，以及當前林木育種戰(zhàn)略實施具有重要的意義。
【專利說明】楊樹CesAs基因內(nèi)與木材品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能SSR標 記、其應用及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物分子育種領(lǐng)域，具體而言，涉及一種楊樹CesAs基因內(nèi)與木材品 質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能SSR標記、其應用及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 楊樹生長迅速、輪伐期短、種間雜交與無性繁殖比較容易和便于遺傳操作，在 北半球被認為是最具前途的纖維質(zhì)能源樹種（Li et al. ,2008，The Plant Journal, 54:569-581)。特別是隨著我國經(jīng)濟的迅猛發(fā)展，當前的林木產(chǎn)量及質(zhì)量已遠不能滿足工業(yè) 的需求，因此選育優(yōu)良用材新種質(zhì)，發(fā)展優(yōu)良工業(yè)用材人工林，提高林地單位面積產(chǎn)量是解 決該問題的重要應對策略.然而，傳統(tǒng)的以表型性狀標準或雜交常規(guī)育種選擇方式進行優(yōu) 良種質(zhì)選育，具有育種周期長、穩(wěn)定性差、片面注重生長性狀而忽略木材品質(zhì)性狀、無法消 除環(huán)境效應影響等缺點，嚴重限制了林木的遺傳改良進程，因此，深入研究木材生物合成途 徑，闡明木材纖維性狀形成的分子機制是加速木材品質(zhì)遺傳改良的基礎(chǔ)。
[0003] 在常見的分子標記技術(shù)中，簡單序列重復（Simple Sequence Repeats, SSRs)也稱 微衛(wèi)星DNA，由于具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、重復性強、檢測容易且結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，在分 子標記輔助育種研究中被認為是一種理想的分子標記類型。先前開發(fā)的SSR位點多來自基 因組的隨機區(qū)域，而這些SSR多呈中性進化，與物種表型性狀的形成連鎖不太緊密。與此不 同，基因內(nèi)的SSR由于在進化過程中，一般會受到較強烈的選擇壓，造成與物種的表型性狀 緊密連鎖（Li et al·，2004 ;Molecular Biology and Evolution，21:991-1007·)，被認為 具有功能重要性。因此，建立楊樹纖維素合酶基因內(nèi)功能SSR標記的鑒定技術(shù)，開發(fā)木材形 成相關(guān)候選基因內(nèi)SSR位點，發(fā)掘候選基因內(nèi)與重要性狀顯著關(guān)聯(lián)的等位變異位點，并進 行基因型效應分析，可直接應用于分子標記定向輔助育種。
[0004] 開發(fā)出在楊樹生長的早期就能夠高效、準確地鑒定出木材品質(zhì)好的單株的分子標 記是本領(lǐng)域技術(shù)人員一直努力的方向。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一種楊樹CesAs基因內(nèi)與木材品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能SSR標 記、其應用及試劑盒，以在楊樹生長的早期就能夠高效、準確地鑒定出木材品質(zhì)優(yōu)良的單 株。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種楊樹CesAs基因內(nèi)與木 材品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能SSR標記。該功能SSR標記包括7A-SSR2和7B-SSR1，7A-SSR2 位于楊樹CesA7-A外顯子3區(qū)域，為（TGA)n ;7B-SSR1位于CesA7-B內(nèi)含子4區(qū)域，為（TTAA) m，η和m為正整數(shù)。
[0007] 進一步地，7A-SSR2 為（TGA) 3 或（TGA) 4 ;7B-SSR1 為（TTAA) 3,（TTAA) 4 或（TTAA) 5。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種篩選楊樹木材品質(zhì)性狀的方法。該方法包括 以下步驟：SI，提取毛白楊的基因組DNA ;S2,測定毛白楊CesAs基因內(nèi)的功能SSR標記，功 能SSR標記包括7A-SSR2和7B-SSR1，7A-SSR2位于楊樹CesA7-A外顯子3區(qū)域，為（TGA) n ; 7B-SSR1位于CesA7-B內(nèi)含子4區(qū)域，為（TTAA)m ;S3,根據(jù)步驟S2的測定結(jié)果進行篩選。
[0009] 進一步地，7A-SSR2含有（TGA) 4的楊樹個體木質(zhì)素含量高，7B-SSR1含有（TTAA) 5 的楊樹個體α-纖維素含量和綜纖維素含量高。
[0010] 進一步地，7A-SSR2含有純合基因型（TGA) V(TGA)3的楊樹個體木質(zhì)素含量 低，7B-SSR1含有（TTAA)V(TTAa)3或（TTAA)V(TTAa) 4的楊樹個體α -纖維素含量和綜纖 維素含量低。
[0011] 進一步地，步驟S2中在測定7A-SSR2用的引物為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ; 在測定7B-SSR1用的引物為SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面,提供一種篩選楊樹生長和木材品質(zhì)性狀的試劑盒。該 試劑盒包括堿基序列為SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的引物。
[0013] 進一步地，引物的PCR擴增體系為：引物對濃度為0·3πιο1/μ 1，2·0μ 12XPCR擴增 混合液，1. 〇 μ 1基因組DNA，無菌水補至10 μ 1。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供一種位于楊樹CesA7_A外顯子3區(qū)域的（TGA)1^P 位于CesA7-B內(nèi)含子4區(qū)域的（TTAA)m功能SSR標記在楊樹分子標記輔助選擇育種中的應 用。
[0015] 本發(fā)明采用連鎖-連鎖不平衡（Linkage-Linkage disequilibrium)作圖策略在 楊樹纖維素合酶基因（CesAs)內(nèi)確定了與木材品質(zhì)性狀(木質(zhì)素含量、α-纖維素含量、綜 纖維素含量）顯著關(guān)聯(lián)的功能SSR標記（7A-SSR2和7B-SSR1)，為研究該候選基因的功能機 制及其大規(guī)模開展林木關(guān)聯(lián)作圖研究提供了重要的理論研究基礎(chǔ)。本發(fā)明確定的這些功能 標記位點為早期篩選優(yōu)異種質(zhì)，縮短林木育種周期提供了新的技術(shù)手段，同時也為改良木 材品質(zhì)性狀的分子研究提供遺傳學證據(jù)，對于提高我國林木遺傳育種工程的發(fā)展，以及當 前林木育種戰(zhàn)略實施具有重要的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示 意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：
[0017] 圖1示出了 7A-SSR2標記在關(guān)聯(lián)作圖群體的木質(zhì)素含量上的基因型效應；
[0018] 圖2示出了 7A-SSR2標記在雜交作圖群體的木質(zhì)素含量上的基因型效應；
[0019] 圖3示出了 7B-SSR1標記在關(guān)聯(lián)作圖群體的綜纖維素含量上的基因型效應；
[0020] 圖4示出了 7B-SSR1標記在雜交作圖群體的綜纖維素含量上的基因型效應；
[0021] 圖5示出了 7B-SSR1標記在關(guān)聯(lián)作圖群體的α -纖維素含量上的基因型效應；以 及
[0022] 圖6示出了 7B-SSR1標記在雜交作圖群體的α -纖維素含量上的基因型效應。

【具體實施方式】
[0023] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明。
[0024] 鑒于樹木高度雜合、周期長、異交體系等特點，在作物遺傳學研究中開發(fā)的一些方 法難以在林木中實施，因此，目前在林木分子遺傳學方面的主要進展是通過分子標記輔助 選擇策略將影響木材纖維性狀的多個基因剖分開來，可以像研究質(zhì)量性狀基因位點一樣， 對這些數(shù)量性狀基因位點進行研究，研究這些基因在染色體上的位置，并尋找與其緊密連 鎖的分子標記，以此來對林木進行遺傳改良。其主要應用方法為基于家系群體遺傳連鎖圖 譜的數(shù)量性狀定位，及其基于自然群體的連鎖不平衡作圖方法。但家系連鎖作圖的QTL分 析雖然可以確定功能區(qū)域位置，但分辨率較低，群體遺傳信息僅限于父母本的分離組合。相 比而言，基于關(guān)聯(lián)群體的連鎖不平衡作圖涵蓋了該物種所有歷史進化事件，在等位位點變 異方面具有較高的分辨率，但群體結(jié)構(gòu)、樣本群體規(guī)模等因素易造成關(guān)聯(lián)結(jié)果的假陽性。
[0025] 本發(fā)明針對傳統(tǒng)以表型性狀標準或雜交常規(guī)育種選擇方式進行優(yōu)良種質(zhì)選育周 期長、穩(wěn)定性差、片面注重生長性狀而忽略木材品質(zhì)性狀、無法消除環(huán)境效應影響等缺點， 組合利用連鎖-連鎖不平衡（Linkage-Linkage disequilibrium)作圖策略，確定與重要木 材品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能變異位點，首次系統(tǒng)的對楊樹纖維素合酶基因家族（CesAs)內(nèi) 的SSR標記進行了與生長及其木材品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析，最終確定了與木材品質(zhì)性狀(木 質(zhì)素含量、α -纖維素含量、綜纖維素含量)顯著連鎖的功能SSR標記（7A-SSR2和7B-SSR1 )， 為改良木材纖維質(zhì)的數(shù)量及其質(zhì)量以及優(yōu)良種質(zhì)資源的早期選擇提供了科學理論依據(jù)及 1?效技術(shù)體系。
[0026] 分別包含功能SSR標記7A-SSR2和7B-SSR1的CesA7-A及CesA7-B基因?qū)儆谂c楊 樹木材形成中纖維素合成直接相關(guān)的纖維素合酶基因家族成員，上述序列分別命名為SEQ ID NO. 5 及 SEQ ID NO. 6。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種楊樹CesAs基因內(nèi)與木材品質(zhì)性狀 顯著關(guān)聯(lián)的功能SSR標記。該功能SSR標記包括7A-SSR2和7B-SSR1，7A-SSR2位于楊樹 CesA7-A外顯子3區(qū)域，為（TGA)n;7B-SSRl位于CesA7-B內(nèi)含子4區(qū)域，為（TTAA) 111,!!和m 為正整數(shù)。應用本發(fā)明確定的這些功能標記位點為早期篩選優(yōu)異種質(zhì)，縮短林木育種周期 提供了新的技術(shù)手段，同時也為改良木材品質(zhì)性狀的分子研究提供遺傳學證據(jù)，對于提高 我國林木遺傳育種工程的發(fā)展，以及當前林木育種戰(zhàn)略實施具有重要的意義。
[0028] 其中，7A-SSR2 為（TGA) 3 或（TGA) 4 ;7B-SSR1 為（TTAA) 3,（TTAA) 4 或（TTAA) 5。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種篩選楊樹木材品質(zhì)性狀的方法。該方 法包括以下步驟：S1，提取毛白楊的基因組DNA ;S2，測定毛白楊CesAs基因內(nèi)的功能SSR標 記，功能SSR標記包括7A-SSR2和7B-SSR1，7A-SSR2位于楊樹CesA7-A外顯子3區(qū)域，為 (TGA) n ; 7B-SSR1位于CesA7-B內(nèi)含子4區(qū)域，為（TTAA)m ;S3,根據(jù)步驟S2的測定結(jié)果進 行篩選。應用本發(fā)明確定的這些功能標記位點為早期篩選優(yōu)異種質(zhì)，能夠縮短林木育種周 期。
[0030] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當7A-SSR2含有（TGA) 4的楊樹個體木質(zhì)素含量高，7B-SSR1 含有（TTAA)5的楊樹個體α -纖維素含量和綜纖維素含量高。當7A-SSR2含有純合基因 型（TGA)V(TGA)3的楊樹個體木質(zhì)素含量低，7B-SSR1含有（TTAA)V(TTAa) 3或（TTAA)3/ (TTAA)4的楊樹個體α -纖維素含量和綜纖維素含量低。
[0031] 優(yōu)選地，步驟S2中在測定7A-SSR2用的引物為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ;在 測定7B-SSR1用的引物為SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4,引物的具體信息見表1。
[0032] 表 I
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種楊樹CesAs基因內(nèi)與木材品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能SSR標記，其特征在于，所述 功能SSR標記包括7A-SSR2和7B-SSR1，所述7A-SSR2位于楊樹CesA7-A外顯子3區(qū)域，為 (TGA) n ;所述7B-SSR1位于CesA7-B內(nèi)含子4區(qū)域，為（TTAA)m，η和m為正整數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能SSR標記，其特征在于，所述7A-SSR2為（TGA)3* (TGA) 4 ;所述 7B-SSR1 為（TTAA)3,（TTAA)4 或（TTAA)5。
3. -種篩選楊樹木材品質(zhì)性狀的方法，其特征在于，包括以下步驟： S1，提取毛白楊的基因組DNA ; S2，測定毛白楊CesAs基因內(nèi)的功能SSR標記，所述功能SSR標記包括7A-SSR2和 7B-SSR1，所述7A-SSR2位于楊樹CesA7-A外顯子3區(qū)域，為（TGA)n ;所述7B-SSR1位于 CesA7-B內(nèi)含子4區(qū)域，為（TTAA)m，η和m為正整數(shù)； S3,根據(jù)所述步驟S2的測定結(jié)果進行篩選。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述7A-SSR2含有（TGA)4的楊樹個體木 質(zhì)素含量高，所述7B-SSR1含有（TTAA)5的楊樹個體α -纖維素含量和綜纖維素含量高。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述7A-SSR2含有純合基因型（TGA)3/ (TGA) 3的楊樹個體木質(zhì)素含量低，所述7B-SSR1含有（TTAA) V(TTAA)3或（TTAA) V(TTAA)4 的楊樹個體α-纖維素含量和綜纖維素含量低。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟S2中在測定7A-SSR2用的引物 為SEQIDN(λl和SEQIDN(λ2;在測定7B-SSRl用的引物為SEQIDN(λ3和SEQIDN0·4。
7. -種篩選楊樹生長和木材品質(zhì)性狀的試劑盒，其特征在于，包括用于擴增權(quán)利要求 1所述的功能SSR標記的堿基序列為SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的引物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述引物的PCR擴增體系為：引物對濃 度為0. 3πιο1/μ 1，2. Ομ 12XPCR擴增混合液，Ι.Ομ 1基因組DNA，無菌水補至10μ 1。
9. 位于楊樹CesA7-A外顯子3區(qū)域的（TGA)n和位于CesA7-B內(nèi)含子4區(qū)域的（^心^功 能SSR標記在楊樹分子標記輔助選擇育種中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104293774SQ201310298732
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】張德強, 杜慶章, 徐煲鏵 申請人:北京林業(yè)大學