一種用熒光sybr方法檢測黃斑變性基因位點(diǎn)的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用熒光SYBR方法檢測黃斑變性基因位點(diǎn)的試劑盒。包括同時(shí)檢測CFH基因上rs1061170號SNP位點(diǎn)、ARMS2基因上rs10490924號SNP位點(diǎn)、C3基因上rs2230199號SNP位點(diǎn)、SKIV2L基因上rs429608號SNP位點(diǎn)、TIMP3基因上rs9621532號SNP位點(diǎn)的特異性引物對及SYBRGreenⅠ熒光染料、用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時(shí)檢測與黃斑變性相關(guān)的CFH、ARMS2、C3、SKIV2L和TIMP3基因上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來評估個(gè)體發(fā)生黃斑變性風(fēng)險(xiǎn)性。
【專利說明】一種用熒光SYBR方法檢測黃斑變性基因位點(diǎn)的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測黃斑變性基因位點(diǎn)的試劑盒，通過同時(shí)檢測與黃斑變性密切相關(guān)的基因CFH、ARMS2、C3、SKIV2L和--ΜΡ3上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來評估個(gè)體發(fā)生黃斑變性風(fēng)險(xiǎn)性。

【背景技術(shù)】
[0002]黃斑變性是與年齡相關(guān)的視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜中心區(qū)域(黃斑區(qū))的光感受器一視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)-Bruch膜一脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體的進(jìn)展性病變，可導(dǎo)致中心視力的喪失。
[0003]黃斑變性通常發(fā)生于50歲以上人群，部分患者侵及雙眼，是美國和其他發(fā)達(dá)國家老年人群中的首位致盲原因，在全世界范圍內(nèi)大約有5千萬患者，其發(fā)生率隨著人口的老化迅速上升。在美國，75歲以上人群中大約有6?8%患有能導(dǎo)致嚴(yán)重視力損害的晚期黃斑病變。在中國，北京地區(qū)調(diào)查結(jié)果顯示75歲以上人群黃斑變性患病率早期和晚期分別為
2.99%和0.90%。國人黃斑變性患病率雖然遠(yuǎn)低于歐美國家，但由于中國人口結(jié)構(gòu)的老齡化趨勢，其造成的危害依然不能忽視。
[0004]目前，研究者們從分子遺傳學(xué)研究黃斑變性，已定位出五個(gè)與黃斑變性密切相關(guān)的基因，它們分別是Ci7H基因、ARMS2基因、C3基因、SKIV2L基因和--ΜΡ3基因。
[0005]補(bǔ)體是由存在于人或脊椎動物血清與組織液中的一組可溶性蛋白以及存在于白細(xì)胞與其他細(xì)胞表面的一組膜結(jié)合蛋白和補(bǔ)體受體所組成的。在機(jī)體免疫系統(tǒng)中擔(dān)負(fù)抗感染和免疫調(diào)節(jié)作用，并參與免疫病理反應(yīng)。補(bǔ)體主要通過經(jīng)典途徑、旁路途徑以及凝集素途徑等三種方式被激活后發(fā)揮免疫防御功能，三條激活途徑均可產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶，促使C3活化為C3a和C3b，進(jìn)而導(dǎo)致膜攻擊復(fù)合體C5 b_9生成，使細(xì)胞溶解從而發(fā)揮免疫學(xué)作用。
[0006]CFH是補(bǔ)體旁路激活途徑的調(diào)節(jié)因子，定位于染色體lq32。它由20個(gè)短共有重復(fù)區(qū)域(short consensus repeats, SCRs)組成,每個(gè)SCR由大約60個(gè)氨基酸組成,形成球狀結(jié)構(gòu)。CFH能夠選擇性阻斷C3活化為C3b，并可以降解C3b，從而調(diào)控補(bǔ)體通路的激活過程。經(jīng)研究指出CFH對炎癥反應(yīng)的控制作用對某些老年人的眼睛來說是必不可少的。
[0007]位于染色體10q26的ARMS2是第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)與黃斑變性發(fā)病機(jī)理相關(guān)的位點(diǎn)，在視網(wǎng)膜和胎盤均有表達(dá)。ARMS2是假定的人類基因，編碼一個(gè)假定的蛋白，含107個(gè)氨基酸，除了 9個(gè)已知的磷酸化位點(diǎn)以外，其功能未知。改變靈長類特有ARMS2的編碼序列，等位基因T的突變使69號氨基酸由丙氨酸變?yōu)榻z氨酸，在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)時(shí)產(chǎn)生一種線粒體蛋白。相關(guān)的線粒體功能紊亂可導(dǎo)致能量代謝和動態(tài)平衡的破壞，產(chǎn)生反應(yīng)性氧化物，線粒體DNA的體細(xì)胞突變產(chǎn)物堆積，凋亡通路被激活。黃斑變性患者視網(wǎng)膜的線粒體數(shù)目和體積減少，線粒體ARMS2蛋白出現(xiàn)A69S替代，導(dǎo)致功能改變使黃斑區(qū)光感受器的年齡相關(guān)性變性的易感姓增加。Kanda等通過翻譯了人類視網(wǎng)膜的ARMS2cDNA克隆，表明ARMS2編碼真實(shí)的蛋白。
[0008]SKIV2L基因編碼的DEAD box蛋白被認(rèn)為在參與胚胎，精子，細(xì)胞生長和分裂的過程中起到重要作用。
[0009]HMPs家族是一個(gè)多基因家族的編碼蛋白，是MMPs活性的特異性抑制因子?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4種，分別命名為:--ΜΡ-1、--ΜΡ-2、--ΜΡ-3、--ΜΡ-4。--ΜΡ-3的分子量為28kD，可以促進(jìn)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)化表現(xiàn)的表達(dá)。TIMP-3可抑制ΜΜΡ-1、ΜΜΡ-2、ΜΜΡ-9和MMP-13的活性。
[0010]在HMPs家族中，--ΜΡ-3與其他成員不同，可以與ECM緊密結(jié)合，這種結(jié)合需借助于--ΜΡ-3的C末端功能區(qū)。--ΜΡ-3的C末端如果在156位、166位、167位、168位氨基酸發(fā)生點(diǎn)突變，或是在第4內(nèi)含子與第5外顯子之間插入異常堿基，可以造成Sorsby黃斑變性，一種常染色體遺傳性視覺障礙疾病，此病的一個(gè)重要特征是脈絡(luò)膜新血管生成的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]基于era、ARMS2、C3、SKIV2L和--ΜΡ3基因上的5個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性可用來評估葉酸代謝遺傳能力的基礎(chǔ)，本發(fā)明提供一種檢測個(gè)體葉酸代謝障礙的試劑盒。
[0012]該試劑盒包括:
檢測CFH基因上rsl061170號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對；
檢測ARMS2基因上rsl0490924號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對；
檢測C3基因上rs2230199號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對；
檢測SKIV2L基因上rs429608號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對；
檢測--ΜΡ3基因上rs9621532號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對；
實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)組件(包括ddH20、Buffer、MgCl2溶液、dNTPs、Taq酶、SYBR染料等)
本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對CFH基因上rsl061170號SNP位點(diǎn)、ARMS2基因上rs 10490924號SNP位點(diǎn)、C3基因上rs2230199號SNP位點(diǎn)、SKIV2L基因上rs429608號SNP位點(diǎn)、TIMP3基因上rs9621532號SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能使用SYBR Green熒光PCR技術(shù)特異性檢測出這五個(gè)SNP位點(diǎn)基因型的引物對。設(shè)計(jì)這類引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的，并可用常規(guī)的引物合成技術(shù)進(jìn)行合成。
[0013]優(yōu)選的，檢測CFH基因上rsl061170號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對為:
有義引物 1-1:AAATGGATATAATCAAAGTC (SEQ ID NO:1)
有義引物 1-2:AAATGGATATAATCAAAGTT (SEQ ID NO:2)
反義引物 1:AGATTTACCCTGTACAAACT (SEQ ID NO:3)
優(yōu)選的，檢測ARMS2基因上rsl0490924號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對為:
有義引物 2-1:ACACTCCATGATCCCAGCAG (SEQ ID N0:4)
有義引物 2-2:ACACTCCATGATCCCAGCAT (SEQ ID NO:5)
反義引物 2:TGGTAAGCAGAGCTCAGTGT (SEQ ID NO:6)
優(yōu)選的，檢測C3基因上rs2230199號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對為:
有義引物 3-1:GTTCAAGTCAGAAAAGGGTC (SEQ ID NO:7)
有義引物 3-2:GTTCAAGTCAGAAAAGGGTG (SEQ ID NO:8)
反義引物 3:GCCTGCACGGTCACGAACTT (SEQ ID NO:9)
優(yōu)選的，檢測SKIV2L基因上rs429608號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對為: 有義引物 4-1:GGTGGAGACGAGCCACTTGA (SEQ ID NO: 10)
有義引物 4-2:GGTGGAGACGAGCCACTTGG (SEQ ID NO: 11)
反義引物 4:GCTGGGGAGAAGAGGCCAAG (SEQ ID NO: 12)
優(yōu)選的，檢測--ΜΡ3基因上rs9621532號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對為:
有義引物 5-1:GGTGGAGACGAGCCACTTGA (SEQ ID NO: 13)
有義引物 5-2:GGTGGAGACGAGCCACTTGG (SEQ ID NO: 14)
反義引物 5:GCTGGGGAGAAGAGGCCAAG (SEQ ID NO: 15)
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:
溶液單份體積終濃度
ddH2030.2μ1
Buffer5 M-1IX
MgCl24μ12mM
dNTPs4M-1200nM each
Primer (SP+AP) 1M-1+1M-1 0.4uM each
Taq0.3μ11.5U in all
SYBR Green 熒光染料 2.5μ1I X
本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
[0014]
熱循環(huán)參數(shù):
94 0C 2min
94 °C 45sec
60 °C 45sec
72 °C Imin
72 °C 7min
40循環(huán)
【具體實(shí)施方式】:
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，
通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。
[0015]
實(shí)施例1.檢測試劑盒的使用步驟1:DNA模板的提取
用真空采血管采集人體外周血，提取血液中的基因組DNA。
[0016]步驟2:如果要做N管，在一個(gè)1.5ml或更大體積的管子中，一次加入從ddH20到
SYBR每個(gè)試劑，體積為:NX單份體積。
[0017]在冰上操作，保持試劑的活性。
[0018]因?yàn)镾YBR熒光染料的緣故，要避免中強(qiáng)光照射。
[0019]在移液準(zhǔn)確的前提下，盡量縮短操作時(shí)間，減少非特異擴(kuò)增。
[0020]充分振蕩，使成分均勻。
[0021]步驟3:在PCR管中加入模板DNA和步驟2已配置完成的混合溶液，振蕩，離心。
[0022]步驟4:實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)
使用可檢測與黃斑變性相關(guān)的基因的實(shí)時(shí)定量PCR檢測試劑盒，其中，包含下列引物對:
有義引物 1-1:AAATGGATATAATCAAAGTC (SEQ ID NO:1)
有義引物 1-2:AAATGGATATAATCAAAGTT (SEQ ID NO:2)
反義引物 1:AGATTTACCCTGTACAAACT (SEQ ID NO:3)
有義引物 2-1:ACACTCCATGATCCCAGCAG (SEQ ID N0:4)
有義引物 2-2:ACACTCCATGATCCCAGCAT (SEQ ID NO:5)
反義引物 2:TGGTAAGCAGAGCTCAGTGT (SEQ ID NO:6)
有義引物 3-1:GTTCAAGTCAGAAAAGGGTC (SEQ ID NO:7)
有義引物 3-2:GTTCAAGTCAGAAAAGGGTG (SEQ ID NO:8)
反義引物 3:GCCTGCACGGTCACGAACTT (SEQ ID NO:9)
有義引物 4-1:GGTGGAGACGAGCCACTTGA (SEQ ID NO: 10)
有義引物 4-2:GGTGGAGACGAGCCACTTGG (SEQ ID NO: 11)
反義引物 4:GCTGGGGAGAAGAGGCCAAG (SEQ ID NO: 12)
有義引物 5-1:GGTGGAGACGAGCCACTTGA (SEQ ID NO: 13)
有義引物 5-2:GGTGGAGACGAGCCACTTGG (SEQ ID NO: 14)
反義引物 5:GCTGGGGAGAAGAGGCCAAG (SEQ ID NO: 15)
有義引物1-1、有義引物1-2、反義引物I特異地針對檢測CFH基因上rsl061170號SNP位點(diǎn)多態(tài)性；
有義引物2-1、有義引物2-2、反義引物2特異地針對檢測ARMS2基因上rs 10490924號SNP位點(diǎn)多態(tài)性；
有義引物3-1、有義引物3-2、反義引物3特異地針對檢測C3基因上rs2230199號SNP位點(diǎn)多態(tài)性；
有義引物4-1、有義引物4-2、反義引物4特異地針對檢測SKIV2L基因上rs429608號SNP位點(diǎn)多態(tài)性；
有義引物5-1、有義引物5-2、反義引物5特異地針對檢測--ΜΡ3基因上rs9621532號SNP位點(diǎn)多態(tài)性；
將反應(yīng)管放入儀器上進(jìn)行熱學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)過程94°C、2min，94°C、45sec，60°C、45sec，72°C、45sec，40 循環(huán)。
[0023]62 °C?92 V緩慢升溫，產(chǎn)生熔點(diǎn)曲線(melting curve,或稱解離曲線，dissociat1n curve)。
[0024]步驟5:SNP基因型分析
熟悉實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識實(shí)時(shí)定量PCR儀上顯示的熒光定量曲線，根據(jù)不同序列引物和SYBR熒光染料結(jié)合的信號強(qiáng)弱即可確定所檢測的SNP位點(diǎn)的基因型。
[0025]
實(shí)施例2.對受檢者進(jìn)行黃斑變性基因位點(diǎn)檢測的服務(wù)步驟1:DNA提取由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師對被檢者進(jìn)行外周血的采集，采用真空采血管采集外周血，并提取出其中的基因組DNA。
[0026]步驟2:基因分型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢者基因組DNA的CFH基因上rsl061170號SNP位點(diǎn)、ARMS2基因上rs 10490924號SNP位點(diǎn)、C3基因上rs2230199號SNP位點(diǎn)、SKIV2L基因上rs429608號SNP位點(diǎn)、--ΜΡ3基因上rs9621532號SNP位點(diǎn)分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測，確定這五個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。
[0027]步驟3:個(gè)體罹患黃斑變性風(fēng)險(xiǎn)性的分析
通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具個(gè)體發(fā)生黃斑變性風(fēng)險(xiǎn)性的分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說明了被檢測者的基因狀況，并由醫(yī)師向被檢測者詳細(xì)說明和解讀個(gè)體發(fā)生黃斑變性風(fēng)險(xiǎn)性的分析報(bào)告單。
【權(quán)利要求】
1.一種用熒光SYBR方法檢測黃斑變性基因位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于:包括同時(shí)檢測Ci7H基因上rsl061170號SNP位點(diǎn)、ARMS2基因上rs 10490924號SNP位點(diǎn)、C3基因上rs2230199 號 SNP 位點(diǎn)、SKIV2L 基因上 rs429608 號 SNP 位點(diǎn)、TIMP3 基因上 rs9621532 號SNP位點(diǎn)的特異性引物對及SYBR Green I熒光染料、ddH20、Buffer、MgCl2溶液、dNTPs、Taq酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所含的特異性引物對選自具有SEQIDNO:1,2,3,SEQ ID NO:4,5,6,SEQ ID NO:7,8,9,SEQ ID NO:10、11、12，SEQ ID NO:13、14、15所示序列的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:試劑盒的組分和含量包括30.2μ1的(ΜΗ20、5μ1 的Buffer、濃度 1Χ4μ1 的MgCl2溶液、濃度200nM each 4μ1 的 dNTPs、濃度0.4uMeach ?μ?+?μ? 的 Primer (SP+AP)、濃度 1.5U in all 0.3μ1 的 Taq 酶、濃度 1X2.5μ1 的SYBR Green I熒光染料，本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293886SQ201310297732
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】任峻, 張華忠, 張路遙 申請人:浙江愛易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司