乳酸鏈球菌的發(fā)酵工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及高密度液體發(fā)酵乳酸鏈球菌的制備方法，并提供了后期處理工藝。本發(fā)明提供的乳酸鏈球菌發(fā)酵工藝采用菌種的活化、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)等步驟進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵工藝中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分為豆粕粉、玉米粉、酵母膏和番茄汁等，原料廉價易得。利用該發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時，乳酸鏈球菌生長穩(wěn)定，發(fā)酵液活菌數(shù)≥140億/mL，大大高于預(yù)期值。本發(fā)明進(jìn)一步對乳酸鏈球菌發(fā)酵液進(jìn)行了后期包埋固定處理，該工藝簡便易行，通過包埋及凍干處理，得到高產(chǎn)量、高活性的乳酸鏈球菌菌劑。本發(fā)明有效解決了傳統(tǒng)乳酸鏈球菌發(fā)酵成本高、規(guī)模小和難長久保存等問題，實(shí)現(xiàn)了中試發(fā)酵水平上，低成本制備乳酸鏈球菌菌劑產(chǎn)品的目標(biāo)。
【專利說明】乳酸鏈球菌的發(fā)酵工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及乳酸鏈球菌的發(fā)酵工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]乳酸菌是腸道益生菌，能夠促進(jìn)動物生長，調(diào)節(jié)胃腸道菌群、維持微生態(tài)平衡，從而改善胃腸道功能；提高食物消化率和生物效價；抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長，提高機(jī)體免疫力等。1989年，研究者將乳酸菌作為微生態(tài)制劑添加到仔豬飼料中，發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以預(yù)防消化道疾病，促進(jìn)仔豬生長作用；1998年，SOTokulova研究發(fā)現(xiàn)飼喂益生菌可提高巨噬細(xì)胞活性，增強(qiáng)動物的免疫力。
[0003]隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對微生態(tài)制劑的研究不斷深入。微生態(tài)制劑是通過益生菌或有益菌群的增殖來調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)宿主健康。益生菌主要通過競爭抑制和營養(yǎng)助生長兩種方式，促進(jìn)動物生長和防病治病。例如，益生菌群進(jìn)入宿主動物腸道后，通過增強(qiáng)粘膜屏障，提高對腸道病原菌的抗性，在宿主腹瀉后恢復(fù)正常的腸道微生態(tài)環(huán)境；而有些益生菌能與有害菌群競爭營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，競爭性的排斥有害菌，抑制其生長繁殖；另外一些益生菌可以產(chǎn)生乳酸、乙酸和丙酸等小分子有機(jī)酸，降低腸道pH值，改善生理生化環(huán)境。同時,益生菌群產(chǎn)生的溶菌酶、過氧化氫等抗菌物質(zhì)能夠殺死外源病原菌。此外,益生菌群代謝產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶、植酸酶等各種消化酶能幫助動物消化，增進(jìn)食欲，并能夠促進(jìn)機(jī)體對蛋白質(zhì)、維生素、鈣、鋅、鐵的吸收，有效促進(jìn)動物的生長。 [0004]目前可用于微生態(tài)制劑的微生物種類已有多種，主要包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、放線菌、光合細(xì)菌等幾大類。其中，乳酸菌是一群相當(dāng)龐雜的細(xì)菌，根據(jù)細(xì)胞呈球狀或呈桿狀，又分成乳酸桿菌族和鏈球菌族。近年來，主要側(cè)重于對鏈球菌族中乳酸菌的研究，應(yīng)用范圍由傳統(tǒng)食品、乳制品工業(yè)發(fā)展到植物原料發(fā)酵食品以及新興的微生態(tài)制劑，為人類健康，農(nóng)林牧副的發(fā)展，醫(yī)藥保健和環(huán)境保護(hù)作出了重要貢獻(xiàn)。
[0005]乳酸鏈球菌隸屬鏈球菌族，是一種專性厭氧菌，對營養(yǎng)條件要求高，由于乳酸鏈球菌大規(guī)模生產(chǎn)對發(fā)酵技術(shù)要求較高，以及后期處理工藝復(fù)雜，導(dǎo)致乳酸鏈球菌尚無法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對目前無法對乳酸鏈球菌進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的問題，提供一種中試規(guī)模的高密度液體發(fā)酵制備乳酸鏈球菌的方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種乳酸鏈球菌的發(fā)酵工藝，將乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)在改良MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后將活化后的乳酸鏈球菌接種到液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行靜止培養(yǎng)，所得種子液按2~5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)得到乳酸鏈球菌發(fā)酵液。
[0008]其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:豆柏粉15~25g/L、玉米粉10~20g/L、蔗糖5~10g/L、蛋白胨5~10g/L、酵母膏3~5g/L、番茄汁50mL/L、磷酸二氫鉀2g/L、結(jié)晶硫酸鎂0.5g/L，pH值6.2~6.9 ;發(fā)酵培養(yǎng)條件為:30~35°C (優(yōu)選30°C )，溶解氧0%，間歇式旋轉(zhuǎn)環(huán)境中培養(yǎng)20~45h。
[0009]所述改良MRS固體培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖10~20g/L、蛋白胨10~15g/L、酵母膏5~7.5g/L、牛肉膏10~15g/L、磷酸二氫鉀0.2g/L、乙酸鈉2g/L、檸檬酸三胺2g/L、結(jié)晶硫酸鎂0.5g/L、瓊脂18g/L、水lOOOmL，pH值6.2~6.9 (優(yōu)選pH值6.8)。所述傳代培養(yǎng)是指將乳酸鏈球菌菌株接種到改良MRS固體斜面培養(yǎng)基上，于30~35 V (優(yōu)選30°C )培養(yǎng)3~5天。
[0010]所述液體種子培養(yǎng)基的配方為:豆柏粉15~25g/L、玉米粉10~20g/L、蔗糖5~10g/L、蛋白胨5~10g/L、酵母膏3~5g/L、牛肉膏3~5g/L、磷酸二氫鉀0.2~2g/L、乙酸鈉2~5g/L、檸檬酸三胺2g/L、結(jié)晶硫酸鎂0.5g/L、水lOOOmL，pH值6.2~6.9 (優(yōu)選pH值
6.8);靜止培養(yǎng)的條件為:30~35°C (優(yōu)選30°C )，每隔6h搖瓶一次，靜止培養(yǎng)18~24h。[0011]配制上述培養(yǎng)基中使用的豆柏粉、玉米粉的細(xì)度為80目。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的番茄汁，其制備方法為:番茄清洗后置于90~95°C水中5~lOmin，然后將番茄剝皮后榨汁，調(diào)pH值6.2~6.9，100~110°C滅菌10~15min，即得。
[0012]前述發(fā)酵工藝中，所述擴(kuò)大培養(yǎng)是指進(jìn)行三級發(fā)酵:將種子液按2~5%的接種量接種到100L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵完成后，將該罐發(fā)酵液全部轉(zhuǎn)接入1000L發(fā)酵罐中，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng),完成后,將1000L罐中發(fā)酵液全部轉(zhuǎn)接入10000L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵產(chǎn)物；其中，各發(fā)酵罐的裝液量為60~70%。
[0013]本發(fā)明中涉及的乳酸鏈球菌為中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供的編號ACCC10295 的菌株。
[0014]本發(fā)明還提供一種乳酸鏈球菌菌劑的制備方法，將按照上述發(fā)酵工藝制備的乳酸鏈球菌發(fā)酵液與保護(hù)劑混合，然后將所述混合物用海藻酸鈉溶液進(jìn)行包埋處理，冷凍干燥后，即得乳酸鏈球菌菌劑。其中，所述保護(hù)劑為純度在99%以上的大豆粉。
[0015]前述制備方法中，將乳酸鏈球菌發(fā)酵液與滅菌后的大豆粉按1:3~6的重量比混合，以迅速吸附發(fā)酵液中的游離水。大豆粉的滅菌條件為:110°c，干熱滅菌0.5~lh。
[0016]前述制備方法中，所述包埋處理具體為:將所述混合物與3~5%的海藻酸鈉溶液按1:3~5的重量比混合均勻，然后進(jìn)行冷凍干燥，待樣品呈疏松狀態(tài)取出。
[0017]本發(fā)明進(jìn)一步提供按照上述方法制備的乳酸鏈球菌菌劑。
[0018]本發(fā)明涉及高密度液體發(fā)酵乳酸鏈球菌的制備方法，并提供了后期處理工藝。本發(fā)明提供的乳酸鏈球菌發(fā)酵工藝采用菌種的活化、種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)等步驟進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵工藝中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分為豆柏粉、玉米粉、酵母膏和番茄汁，其中豆柏粉、玉米粉、酵母膏為菌株的生長提供碳、氮源，而酵母膏、番茄汁可為菌株生長提供所需的氨基酸、維生素和生長因子。采用本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時，乳酸鏈球菌生長穩(wěn)定，發(fā)酵液活菌數(shù)> 140億/mL，大大高于預(yù)期值。本發(fā)明進(jìn)一步對乳酸鏈球菌發(fā)酵液進(jìn)行了后期包埋固定處理，該工藝簡便易行，旨在減少游離水，瞬間抑制乳酸鏈球菌的新陳代謝，將發(fā)酵液與保護(hù)劑按1:3~6的重量比充分混合，然后用載體(海藻酸鈉)進(jìn)行包埋凍干處理，得到高產(chǎn)量、高活性的乳酸鏈球菌菌劑。
[0019]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0020](一)本發(fā)明中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分簡單，原料來源廣泛，價格低廉，如豆柏粉、玉米粉、番茄均可在市場采購，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0021](二）本發(fā)明提供的乳酸鏈球菌的發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)了在中試發(fā)酵水平上，低成本制備乳酸鏈球菌菌劑產(chǎn)品的目標(biāo)。
[0022](三）本發(fā)明的乳酸鏈球菌發(fā)酵液后期處理工藝簡便易行，與其他益生菌的包埋處理相比,大大降低了生產(chǎn)成本。
[0023](四）本發(fā)明有效解決了乳酸鏈球菌發(fā)酵成本高，發(fā)酵工藝復(fù)雜，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，保質(zhì)期短等問題。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。[0025]以下實(shí)施例中使用的改良MRS固體培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下：
[0026]改良MRS固體培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸鈉2g/L、檸檬酸三胺2g/L、磷酸二氫鉀O. 2g/L、結(jié)晶硫酸鎂O. 5g/L、瓊脂18g/L、水1000mL, pH 值6. 8。
[0027]發(fā)酵培養(yǎng)基：豆柏粉20g/L、玉米粉10g/L、蔗糖5g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L、番茄汁50mL/L、磷酸二氫鉀2g/L、結(jié)晶硫酸鎂O. 5g/L，pH值6. 8。
[0028]液體種子培養(yǎng)基：豆柏粉20g/L、玉米粉10g/L、蔗糖10g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、牛肉膏3g/L、乙酸鈉2g/L、檸檬酸三胺2g/L、磷酸二氫鉀2g/L、結(jié)晶硫酸鎂0. 5g/L、水1000mL, pH 值 6. 8。
[0029]實(shí)施例I乳酸鏈球菌的發(fā)酵工藝
[0030]將乳酸鏈球菌菌株（ACCC10295)經(jīng)改良MRS固體斜面培養(yǎng)基傳代活化（35°C培養(yǎng)3~5天）至活力恢復(fù)后，挑取2環(huán)，接種到液體種子培養(yǎng)基中，35°C靜止培養(yǎng)18h左右（每隔6h搖瓶一次),作為種子液。按2%的接種量將種子液接種到盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐(發(fā)酵罐的裝液量為60%)中發(fā)酵培養(yǎng)40h。發(fā)酵條件為：pH值6. 2-6. 4，溫度35°C，溶氧量0%,轉(zhuǎn)速150r/min。
[0031]實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：發(fā)酵結(jié)束后，用無菌三角瓶取200mL發(fā)酵液進(jìn)行活菌數(shù)檢測，平行取樣3次，檢測采用平板菌落計(jì)數(shù)法，稀釋倍數(shù)為ΙΟ7、108、IO9共3個梯度，每個梯度設(shè)3個平行，取菌落數(shù)為30~300個的平板(平板直徑為90mm)計(jì)數(shù)，計(jì)算3個平板的平均值。
[0032]結(jié)果表明：乳酸鏈球菌在100L發(fā)酵罐中，生長狀態(tài)良好，活菌數(shù)(表1)達(dá)到預(yù)期值，表明乳酸鏈球菌可以按照該發(fā)酵工藝進(jìn)行100L罐發(fā)酵生產(chǎn)。
[0033]表1乳酸鏈球菌100L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果
[0034]
【權(quán)利要求】
1.乳酸鏈球菌的發(fā)酵工藝，其特征在于，將乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis)在改良MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后將活化后的乳酸鏈球菌接種到液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行靜止培養(yǎng)，所得種子液按2~5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)得到乳酸鏈球菌發(fā)酵液； 其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:豆柏粉15~25g/L、玉米粉10~20g/L、蔗糖5~10g/L、蛋白胨5~10g/L、酵母膏3~5g/L、番茄汁50mL/L、磷酸二氫鉀2g/L、結(jié)晶硫酸鎂0.5g/L，pH值6.2~6.9 ;發(fā)酵培養(yǎng)條件為:30~35°C，溶解氧0%，間歇式旋轉(zhuǎn)環(huán)境中培養(yǎng)20 ~45h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述改良MRS固體培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖10~20g/L、蛋白胨10~15g/L、酵母膏5~7.5g/L、牛肉膏10~15g/L、磷酸二氫鉀0.2g/L、乙酸鈉2g/L、檸檬酸三胺2g/L、結(jié)晶硫酸鎂0.5g/L、瓊脂18g/L、水lOOOmL，pH值6.2~6.9 ;所述傳代培養(yǎng)是指將乳酸鏈球菌菌株接種到改良MRS固體斜面培養(yǎng)基上，于30~35°C培養(yǎng)3~5天。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述液體種子培養(yǎng)基的配方為:豆柏粉15~25g/L、玉米粉10~20g/L、鹿糖5~10g/L、蛋白胨5~10g/L、酵母膏3~5g/L、牛肉膏3~5g/L、磷酸二氫鉀0.2~2g/L、乙酸鈉2~5g/L、檸檬酸三胺2g/L、結(jié)晶硫酸鎂0.5g/L、水lOOOmL，pH值6.2~6.9 ;靜止培養(yǎng)的條件為:30~35°C，每隔6h搖瓶一次，靜止培養(yǎng)18~24h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述擴(kuò)大培養(yǎng)是指進(jìn)行三級發(fā)酵:將種子液按2~5%的接種量接種到100L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵完成后,將該罐發(fā)酵液全部轉(zhuǎn)接入1000L發(fā)酵罐中，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，完成后，將1000L罐中發(fā)酵液全部轉(zhuǎn)接入10000L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵產(chǎn)物；其中，各發(fā)酵罐的裝液量為60~70%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的番茄汁，其制備方法為:番茄清洗后置于90~95°C水中5~lOmin，然后將番茄剝皮后榨汁，調(diào)pH值6.2~6.9,100~IlCTC高壓蒸汽滅菌10~15min,即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述乳酸鏈球菌為ACCC10295。
7.乳酸鏈球菌菌劑的制備方法，將根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述發(fā)酵工藝制備的乳酸鏈球菌發(fā)酵液與保護(hù)劑混合，然后將所述混合物用海藻酸鈉溶液進(jìn)行包埋處理，冷凍干燥后，即得乳酸鏈球菌菌劑； 其中，所述保護(hù)劑為純度在99%以上的大豆粉。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，將乳酸鏈球菌發(fā)酵液與滅菌后的大豆粉按1:3~6的重量比混合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述包埋處理具體為:將所述混合物與3~5%的海藻酸鈉溶液按1:3~5的重量比混合。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述方法制備的乳酸鏈球菌菌劑。
【文檔編號】C12R1/46GK103540541SQ201310297621
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】豐來, 呂黎, 羅志威, 徐麗媛, 嚴(yán)征 申請人:湖南泰谷生物科技股份有限公司