分子標記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法及其使用的pcr引物組的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物生物【技術領域】，尤其涉及一種分子標記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法。分子標記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的PCR引物組，該引物組的序列為上游引物：5'-TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC-3'；下游引物：5'-CCATTCCAAGAACGATTTGGCT-3'。本發(fā)明的優(yōu)點是，1.苗期鑒定，減少工作量，節(jié)約成本；2.提高了選擇的準確性。
【專利說明】分子標記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法及其使用的PCR
引物組
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物【技術領域】，尤其涉及一種分子標記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法。
【背景技術】
[0002]長紅豆unguiculatassp.sesquipedalis (L.) Verd.)隸屬蝶形花亞科
菜豆族(Trib.Phasoleae DC.) 5[豆屬(San'),是我國重要的夏季豆類
蔬菜之一。由于主要食用部分為嫩莢，莢壁肥厚、種籽小、條莢均勻一致成為長豇豆商品嫩莢最重要的經濟指標之一。然而長豇豆生產實際中常常遇到嫩莢發(fā)育過程中由于莢壁和種子的不均衡發(fā)育，特別是種子發(fā)育過早過快導致嫩莢在種子著生處凸起而其它區(qū)域凹陷的現象，稱之為鼓粒(附圖1)。嫩莢鼓粒嚴重影響嫩莢的外觀品質，降低商品價值。豇豆嫩莢鼓粒的實質是豆莢中種子發(fā)育過早過快，導致種子占整個豆莢的比例過高。育種和生產實踐表明，不同豇豆品種嫩莢鼓粒程度不同，選育和應用不易鼓粒的品種對豇豆生產具有重要意義。
[0003]種子和果實的發(fā)育尤其是膨大和營養(yǎng)積累主要受光合產物的分配與利用所調控。蔗糖是植物光合產物在植物組織間運輸和分配的主要形式，它作為養(yǎng)分和信號分子在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮著至關重要的作用。研究表明，豆類作物嫩莢莢壁和種子對蔗糖的吸收和利用存在著顯著的競爭關系，蔗糖在莢壁和種子間的分配、積累與代謝決定著種子在豆莢中所占的比例。蔗糖代謝與分配，包括韌皮部蔗糖卸載、蔗糖轉化為己糖，以及己糖積累的過程受到蔗糖合成酶、蔗糖轉化酶及蔗糖、己糖膜轉運蛋白等眾多因素的調控。蔗糖在植物體內必須先經蔗糖合成酶和轉化酶分解為己糖后，才能用于植物的生長和發(fā)育。
[0004]生理學研究發(fā)現易鼓粒豇豆品種在嫩莢發(fā)育早期比不易鼓粒品種具有更高的種皮細胞壁蔗糖轉化酶(CWIN)活性和較高的胚細胞分裂活性。隨后，由于易鼓粒品種種皮CWIN活性和胚己糖/蔗糖比值的快速下降導致其胚更早結束細胞分裂期和更早進入細胞膨大期，這是造成易鼓粒品種胚細胞具有更大體積的重要原因。因此，種皮CWIN在長豇豆嫩莢鼓粒中發(fā)揮著重要的作用，可以作為耐鼓粒育種的靶標。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對豇豆耐鼓粒育種常規(guī)方法中單純依靠在田間進行豆莢鼓粒性的目測或工具測量鑒定所存在的主觀性強、易受環(huán)境影響、耗時費力、需要大量土地和人力資源等缺陷，本發(fā)明的一個目的是分子標記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的PCR引物組，本發(fā)明的另外一個目的是提供采用上述引物組分子標記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法。本發(fā)明的方法具有準確、快捷的特點。
[0006]為了實現上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案:
分子標記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的PCR引物組，該引物組的序列為上游引物:5’_TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3’ ；下游引物:5’_ CCATTCCAAGAACGATTTGGCT -3，。
[0007]為了實現上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案:
分子標記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法，其特征在于按以下步驟進行:
1)豇豆基因組DNA的提取:將各待檢測豇豆樣品用CTAB法提取基因組DNA后，分別保存，備用； 2)基因組DNA的PCR擴增:將豇豆各樣品基因組DNA20 ng，分別加入各PCR管中，并在各管中依次加入PCR引物組至終濃度各0.2 μ Μ, dNTP至終濃度0.25 mM,MgC12至終濃度2.0 mM,PCR緩沖液至終濃度為I倍，并加入Taq DNA聚合酶I單位，最后加無菌重蒸水補足體積至20 μ I后，在94°C預變性2 min，94°C變性30 sec，58°C退火30 sec，72°C延伸30sec，36個循環(huán)，72°C延伸5min下進行擴增，產物4°C保存；所述的引物組的序列為上游引物:5’_ TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3’ ；下游引物:5’_ CCATTCCAAGAACGATTTGGCT -3’ ；
3)酶切產物的凝膠電泳分析:擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，上進行電泳分離，然后銀染進行顯色，數碼相機照相記錄結果；所述的非變性聚丙烯酰胺凝膠為丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺=29:1 ；
4)豇豆樣品耐鼓粒性的鑒定:依據PCR產物在凝膠上條帶的模式，凡擴增產物為ISObp片段的材料即為含豇豆耐鼓?；蛐偷牟牧希膊荒塬@得PCR擴增產物的材料即為含豇豆不耐鼓?；蛐偷牟牧?；
5)耐鼓粒表型復選:對上述經分子標記篩選的植株進行正常水肥管理，待植株開花期每株選10朵花蕾進行掛牌，掛牌10天后用游標卡尺測量每條嫩莢的鼓粒程度，以每株10個嫩莢的平均值作為該株的鼓粒性程度值，去除由于標記選擇誤差造成的假陽性，并選留耐鼓粒性得到改善且農藝性狀好的后代新株系。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:
1.苗期鑒定，減少工作量，節(jié)約成本:本發(fā)明獲得了根據豇豆細胞壁蔗糖轉化酶基因上小片段缺失設計的PCR分子標記，該標記與豇豆耐鼓粒性關聯(lián)，可應用于耐鼓?；虻妮o助轉育檢測；該方法具有檢測方便、揭示多態(tài)性能力穩(wěn)定、費用低廉等優(yōu)點；用此標記可在苗期檢測耐鼓?；虻拇嬖谂c否從而預測植株的耐鼓粒性，能在早期淘汰大量的不耐鼓粒分離后代，可以將后續(xù)移栽、管理、鑒定等的工作量壓力減少到最低限度。常規(guī)育成豇豆品種需6-8年的周期，應用分子標記輔助選擇育種，可以在同一時間內分析多個品種，對給定世代的材料只需在苗期取樣1-2周時間就可以明確分離后代中目標基因的存在與否，使新品種的選育能在3-4年內完成，大大節(jié)省了人力和物力；
2.提高了選擇的準確性:傳統(tǒng)育種方法需要對雜交后代的耐鼓粒性進行田間或溫室逐個鑒定，由于嫩莢鼓粒表型易受環(huán)境的影響，表型鑒定常有一定的誤差，利用分子標記進行實驗室檢測可以避免環(huán)境對嫩莢鼓粒表型的影響，準確性得到較大提高。本方法在苗期應用分子標記檢測進行初篩后又對中選植株在成株期進行一次表型復查，進一步提高了選擇的準確性。
[0009]本發(fā)明特點(優(yōu)點或創(chuàng)新點)是:
利用DNA序列小片段缺失與嫩莢鼓粒程度表型值間的顯著關聯(lián)開發(fā)分子標記。苗期采用分子標記選擇，檢測需DNA量少而方便快速，能在早期剔除大多數非目標株，大大減少了后續(xù)田間工作量。分子標記方法可以對大量種質資源及其雜交、回交后代進行分析，較快地從大量目標株中選出育種親本材料，縮短育種的世代和時間。所有具有與“之121”細胞壁
蔗糖轉化酶基因上小片段缺失位點完全相同的耐鼓粒豇豆品系都可以用引物進
行標記輔助選擇。
[0010]
[0011]【具體實施方式】
[0012]本發(fā)明通過以下實施例作進一步的詳細說明，但應該理解本發(fā)明并不受以下內容所限止。
[0013]實施例1:
特異區(qū)分豇豆耐鼓粒性的分子標記及基于分子標記的豇豆耐鼓粒性篩選方法，該方法包括以下的步驟:
(1)與豇豆耐鼓粒性關聯(lián)的分子標記位點的篩選:用Qiagen公司的植物DNA小量提取試劑盒依說明書所述方法提取耐鼓粒程度各異的36份豇豆品系的DNA ;利用引物5’ -CACTTCAGAGGATGGTTGG -3’和 5’- CCTTTCTATCTTATCACTAAACTACC -3’擴增豇豆細胞壁蔗糖轉化酶基因片段并進行常規(guī)測序。對從各品系擴增所獲序列進行比對鑒定出長度為4bp的小片段多態(tài)性位點P-VuCWIN ；
(2)將上述P-CWIN位點的基因型數據與同上所述36份豇豆品系在歷年田間調查中獲得的鼓粒程度值用Tassel軟件的MLM的混合線性模型進行關聯(lián)分析，獲得該位點與鼓粒性狀的關聯(lián)性P值為0.04，符合P〈0.05的統(tǒng)計閾值，表明該標記位點與豇豆耐鼓粒性顯著關聯(lián)。
[0014](3)特異性檢測引物產-Κ?Ο?ν的設計:根據擴增出的豇豆細胞壁蔗糖轉化酶基因片段設計跨越Indel-CWIN位點的上下游引物，序列如下:
上游引物:5’-TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3’ ；
下游引物:5’-CCATTCCAAGAACGATTTGGCT -3’。
[0015](4)特異引物的PCR擴增與電泳檢測:擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺=29:1)上進行電泳分離，然后銀染進行顯色，數碼相機照相記錄結果。凡擴增產物為ISObp片段的材料即為含豇豆耐鼓?；蛐偷牟牧?；凡含豇豆不耐鼓?；蛐偷牟牧希捎谄浠蛐蛄信c上游引物3’端末尾4個堿基中的3個不匹配，因此均不能獲得擴增產物。
[0016]實施例2
利用標記-OSV輔助篩選“之121”和‘之豇282’耐鼓粒雜交后代(O不耐鼓粒主栽品種與耐鼓粒資源的雜交和回交:挑選飽滿的非耐鼓粒輪回親本(‘之豇282’，農藝性狀好，易鼓粒)和耐鼓粒供體親本(“夕121，，’嫩莢不易鼓粒，但農藝性狀較差)播于大田。待開花后進行雜交，莢成熟后收取種子，即為Ei。次年將F1 (5粒左右即可)和輪回親本種子播于大田，待開花后進行雜交，莢成熟后收取種子，即為SS1Ep第三年將BC1F1 (30粒左右)和輪回親本種子播于大田，待開花后進行雜交，莢成熟后按株系收取種子，即為Se2-E1，每株系收20粒左右種子。
[0017](2)苗期分子標記選擇:將上步獲得的600粒左右BC2F1分離后代種子，分單株播種于大田并逐一掛牌。種子發(fā)芽20天后取葉片樣0.1克，液氮中研磨成粉末，用CTAB法提取 DNA。首先配制 CTAB 緩沖液:100 mL I mo 1.171 Tris pH 7.5，140 mL 5 mo 1.171 NaCl,20 mL 0.5 mo 1.171 EDTA pH 8.0,740 mL MiliQ H2O, 20 g CTAB。DNA 提取時取 IOmg 的新鮮葉片放入研缽中，加入150 μ? CTAB緩沖液，用缽杵輕輕研磨，然后再加入150 μ? CTAB緩沖液混勻；65.?水浴40min ;加入300 ? 24:1氯仿/異戍醇,上下混勻5 min,使樣品與氯仿充分混和；13000 r.min—1離心5min ;取上清液150 μ?，加入在_20°C預冷的異丙醇200ML,輕輕上下顛倒混勻；10000-?2000 r.mirT1離心3~4 min,棄上清液；讓異丙醇揮發(fā)干凈，加入50-100 μ?含RNase的ddH20溶解DNA ;然后用1%的瓊脂糖電泳檢測。用本發(fā)明中的分子標記講行PCR擴增，反應體積為25微升，其中IOXbuffer 2.5微升，25mM MgCl2 1.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶(5單位/微升)0.2微升，模板DNA 10納克，加水至25微升。PCR反應體系為DNA 94°C預變性3min后，94°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸展30sec，循環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。在PTC-225擴增儀上進行PCR擴增。擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺=29:1)上進行電泳分離，然后銀染進行顯色，數碼相機照相記錄結果。凡擴增產物為ISObp片段的材料即為含豇豆耐鼓?；蛐偷牟牧嫌枰员Ａ?，凡不能獲得擴增產物的材料即為含豇豆不耐鼓?；蛐偷牟牧嫌枰詠G棄。
[0018](3)成株期表型復選:對經上步分子標記篩選的植株進行正常水肥管理。植株開花期每株選10朵花蕾進行掛牌，掛牌10天后用游標卡尺測量每條嫩莢的鼓粒程度，以每株10個嫩莢的平均值作為該株的鼓粒性程度值。結合各株農藝性狀，選擇耐鼓粒性強且農藝性狀優(yōu)異的單株，自交獲得BC3F2，即為理論上農藝性狀較優(yōu)、耐鼓粒性得到改善且基因型較為純合的新品系。
[0019](4)結果與分析:通過對14株經分子標記分析提示所攜細胞壁轉化酶基因為耐鼓粒基因型的分離后代進行田間鼓粒程度的鑒定 ，按公式:鼓粒程度(%) = (LI L2)/L2 X100%計算鼓粒程度；結果表明有11株鼓粒程度〈30%為耐鼓粒，3株為不耐鼓粒，表明分子標記檢測的準確率在78%以上。再通過耐鼓粒表型復選和農藝性狀篩選以彌補標記輔助選擇的誤差，最后獲得了 I個耐鼓粒優(yōu)良新品系，命名為“FK3-1”。
【權利要求】
1.分子標記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的PCR引物組，其特征在于:該引物組的序列為上游引物:5’- TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3’ ；下游引物:5’-CCATTCCAAGAACGATTTGGCT-3'。
2.分子標記輔助選育豇豆耐鼓粒品種的方法，其特征在于按以下步驟進行: .1)豇豆基因組DNA的提取:將各待檢測豇豆樣品用CTAB法提取基因組DNA后，分別保存，備用; . 2)基因組DNA的PCR擴增:將豇豆各樣品基因組DNA20 ng，分別加入各PCR管中，并在各管中依次加入權利要求1所述的PCR引物組至終濃度各0.2 μ Μ, dNTP至終濃度0.25mM，MgCl2至終濃度2.0 mM，PCR緩沖液至終濃度為I倍，并加入Taq DNA聚合酶I單位，最后加無菌重蒸水補足體積至20 μ I后，在94°C預變性2 min，94°C變性30 sec，58°C退火:30 sec，72°C延伸30sec，36個循環(huán)，72°C延伸5min下進行擴增，產物4°C保存； . 3)酶切產物的凝膠電泳分析:擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，上進行電泳分離，然后銀染進行顯色，數碼相機照相記錄結果；所述的非變性聚丙烯酰胺凝膠為丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺=29:1 ； . 4)豇豆樣品耐鼓粒性的鑒定:依據PCR產物在凝膠上條帶的模式，凡擴增產物為ISObp片段的材料即為含豇豆耐鼓?；蛐偷牟牧?，凡不能獲得PCR擴增產物的材料即為含豇豆不耐鼓?；蛐偷牟牧希?. 5)耐鼓粒表型復選:對上述經分子標記篩選的植株進行正常水肥管理，待植株開花期每株選10朵花蕾進行掛牌，掛牌10天后用游標卡尺測量每條嫩莢的鼓粒程度，以每株10個嫩莢的平均值作為該株的鼓粒性程度值，去除由于標記選擇誤差造成的假陽性，并選留耐鼓粒性得到改善且農藝性狀好的后代新株系。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468791SQ201310287714
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年7月10日 優(yōu)先權日:2013年7月10日
【發(fā)明者】汪寶根, 吳曉花, 魯忠富, 徐沛, 李國景, 劉永華, 胡耀文 申請人:浙江省農業(yè)科學院