玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是檢測用品領(lǐng)域內(nèi)的一種玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒，由引物組合和膜芯片組成，其特征在于引物組合為7重PCR引物組合，各對引物為Pat、Bar、Cry1Ab、Cry105、EPSPS、P35S和玉米內(nèi)源基因序列Zein，膜芯片為順序固定在支持膜表面的7組探針序列和一組陽性對照探針序列，分別為Pat探針、Bar探針、Cry1Ab探針、Cry105探針、EPSPS探針、P35S探針、Zein探針和Positive探針，引物組合中有非對稱PCR擴(kuò)增引物，為5’端帶生物素標(biāo)志（biotin）的Tag引物。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)費(fèi)時費(fèi)力成本高的缺陷，提供的玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結(jié)果可視化，成本低廉。
【專利說明】玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒
所屬【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測用品領(lǐng)域，具體為一種玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)基因玉米和轉(zhuǎn)基因大豆是目前全球最主要的轉(zhuǎn)基因糧食作物。從1996年開始，抗蟲和耐除草劑玉米開始在美國商業(yè)化種植，根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)資料顯示，到2011年已有16個國家種植轉(zhuǎn)基因玉米，其中5個國家種植面積超過100萬公頃。2011年全球轉(zhuǎn)基因玉米總種植面積已達(dá)到5100萬公頃，占玉米總種植面積的32%。由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在全球市場中的大量涌現(xiàn)，其環(huán)境和食品安全問題也引起國際性的高度關(guān)注。各國相繼制定并出臺了相應(yīng)的法律法規(guī)，對轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境釋放和產(chǎn)品銷售采取嚴(yán)格的管理措施。目前已有超過40個國家要求對轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識管理。我國于2001年5月23日發(fā)布了國務(wù)院第304號令《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，實(shí)現(xiàn)了對轉(zhuǎn)基因生物的規(guī)范管理，并于2002年3月20日起施行《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》，要求對包括轉(zhuǎn)基因玉米和轉(zhuǎn)基因大豆在內(nèi)的5類轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識。因此，快速、準(zhǔn)確、靈敏、廉價和相應(yīng)通量的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)是非常關(guān)鍵的。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術(shù)主要包括基于蛋白的檢測方法和基于核酸的檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫試紙條和Western雜交等方法是目前主要的基于蛋白的檢測方法，其共同特點(diǎn)是需要通過一定的處理步驟從樣品中釋放出目標(biāo)蛋白(抗原)，然后利用抗體特異性的結(jié)合抗原蛋白，最后通過酶標(biāo)或金屬標(biāo)偶聯(lián)抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，從而產(chǎn)生可檢測的信號，該類方法的缺點(diǎn)是檢測靈敏度相對較低，并且需要制備高特異性抗體，同時檢測容易受到多種因素的影響，出現(xiàn)假陽性。而基于核酸的檢測方法是目前最普遍、最準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)，檢測方法主要包括PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)和基于分子雜交的基因芯片技術(shù)。目前仍以PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，·其常用的技術(shù)方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、熒光定量PCR等方法。普通定性PCR方法檢測效率低，尤其檢測多基因?qū)ο髸r更加費(fèi)時費(fèi)力；巢式PCR雖然提高了檢測的靈敏度，但同樣存在檢測效率的問題；多重PCR方法可以在一個反應(yīng)中同時檢測多個基因，但常規(guī)的電泳檢測結(jié)果很難判斷，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果；熒光定量PCR方法靈敏度高，但其成本高，并且需要特殊檢測儀器?；蛐酒彩浅Ｓ玫霓D(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)，目前一般采用玻璃片作為固相支持物，實(shí)驗(yàn)過程需要相應(yīng)的點(diǎn)樣儀和芯片識讀儀，同樣成本較高。因此研發(fā)一種快速、方便、靈敏、廉價、可視化和高通量的檢測方法將具有非常好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)費(fèi)時費(fèi)力成本高的缺陷，提供一種操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結(jié)果可視化，成本低廉的玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒。
[0004]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明的玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒由引物組合和膜芯片組成，其特征在于引物組合為7重PCR引物組合，各對引物的堿基序列5’ -3’如下:
【權(quán)利要求】
1.一種玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒由引物組合和膜芯片組成，其特征在于引物組合為7重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物組合，各對引物的堿基序列5’ -3’如下:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒，其特征在于所述引物組合中有非對稱PCR擴(kuò)增引物，為5’端帶生物素標(biāo)志(biotin)的Tag引物，其堿基順序如下所示: Tag 引物:biotin-5，-AGACGCCACCGCCAGCGTATTATCCGAGC C-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒，其特征在于所述玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片和輔料組成，輔料為脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX-Taq聚合酶(Polymerase)和5’端帶生物素標(biāo)志的陽性寡核苷酸單鏈DNA，5’端帶生物素標(biāo)志的陽性寡核苷酸單鏈DNA的堿基順序?yàn)閎iotin-5’ -CTGGTACTTTGGAC
ACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒，其特征在于所述玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片、輔料和配液組成，配液為IOXPCR緩沖液、預(yù)雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈酶親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒，其特征在于所述預(yù)雜交液為5XSSC,0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉和10XDenhardtJ s液，其中，SSC為0.75M氯化鈉，0.075M檸檬酸鈉，DenhardtJ s液為1% Ficoll聚蔗糖，1%聚乙烯吡咯烷酮，1%牛血清白蛋白；雜交液為5XSSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉，5XDenhardt’ s液，50%重量百分比去離子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分別為洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液I為2XSSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉，洗液2為0.5XSSC和 0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉，洗液3為100 mM(毫摩爾/升)Tris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl,洗液 4 為 100 mMTris-HCl, PH9.5，100 mMNaCl 和 100 mM MgCl2 ;封閉液為 3% 重量百分比牛血清白蛋白，100 mMTris-HCl,PH7.5,150 mMNaCl ;四甲基聯(lián)苯胺顯色液由四甲基聯(lián)苯胺顯色液A液和四甲基聯(lián)苯胺顯色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基聯(lián)苯胺顯色液A液為200mM檸檬酸鈉，PH5.4,0.2mg/ml四甲基聯(lián)苯胺，四甲基聯(lián)苯胺顯色液B液為3%重量百分比的H2O2用800體積的雙蒸水稀釋液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒，其特征在于所述支持膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
【文檔編號】C12Q1/68GK103589781SQ201310271719
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月2日
【發(fā)明者】黃廣平, 王勇強(qiáng), 秦子蘇 申請人:黃廣平