一種早期篩選柑橘胞質(zhì)雜種的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種早期篩選柑橘胞質(zhì)雜種的方法。根據(jù)柑橘細(xì)胞對(duì)稱融合可以再生二倍體葉肉親本型胞質(zhì)雜種的現(xiàn)象及其分子水平上的組成特征，以及外源基因一般僅整合在細(xì)胞核基因組而不是整合在胞質(zhì)基因組的特點(diǎn)，將GFP標(biāo)記用于柑橘胞質(zhì)雜種的安全高效早期篩選，以提高胞質(zhì)雜種細(xì)胞的篩選和再生效率。通過將轉(zhuǎn)GFP基因的國慶1號(hào)溫州蜜柑與中國特色有核或多核柑橘類型對(duì)稱融合的思路，根據(jù)胞質(zhì)雜種細(xì)胞不帶有GFP標(biāo)記這一特點(diǎn)，在培養(yǎng)再生的早期挑選胞質(zhì)雜種細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)，從而實(shí)現(xiàn)胞質(zhì)雜種的早期篩選，提高其再生效率，同時(shí)去除了GFP標(biāo)記基因，為柑橘胞質(zhì)雜種篩選提供了安全高效的新方法及新種質(zhì)。
【專利說明】一種早期篩選柑橘胞質(zhì)雜種的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物新品種選育【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種早期篩選柑橘胞質(zhì)雜種的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 柑橘細(xì)胞融合一般采用"懸浮系原生質(zhì)體+葉肉原生質(zhì)體"的模式，利用柑橘葉 肉原生質(zhì)體在目前體系下單獨(dú)培養(yǎng)或者共培養(yǎng)都不能分裂再生植株的特點(diǎn)，是一種半篩選 體系。但部分融合組合中，再生植株除預(yù)期的異源四倍體體細(xì)胞雜種和懸浮系親本再生類 型外，還再生了葉片形態(tài)類似葉肉親本的二倍體植株(鄧秀新，郭文武，余桂紅，2000,柑橘 細(xì)胞融合再生9個(gè)組合二倍體葉肉親本類型植株。園藝學(xué)報(bào)，27(1) :1_5)。這類植株已在 近40例融合組合中出現(xiàn)，而且絕大多數(shù)是種間融合組合。部分融合組合的葉肉親本型植 株經(jīng)分子雜交、CAPS (cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites, 限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)）或SSR (simple sequence repeat,簡單重復(fù)序 列）分析鑒定，表明其核DNA來自葉肉親本，mtDNA (mitochondrial DNA，線粒體DNA)來 自懸浮系親本，cpDNA (chloroplast DNA，葉綠體DNA)隨機(jī)遺傳，即葉肉親本型植株實(shí) 際上是雜種起源的，為胞質(zhì)雜種（Bassene JB等，2011，Influence of mitochondria on gene expression in a citrus cybrid.Plant Cell Rep30:1077-1085;Cai XD 等，2009， Cybrid/hybrid plants regenerated from somatic fusions between male sterile Satsuma mandarin and seedy tangelos. Scientia Hortl22:323-327 ；Fanciullino AL 等，2005, Effects of nucleo-cytoplasmic interactions on leaf volatile compounds from citrus somatic diploid hybrids. J. Agric. Food Chem53:4517-4523 ;Guo Wff 等， 2006, Molecular analysis revealed autotetraploid, diploid and tetraploid cybrid plants regenerated from an interspecific somatic fusion in Citrus.Scientia Horticulturael08:162-166)。
[0003] 柑橘細(xì)胞對(duì)稱融合可以再生二倍體葉肉親本型胞質(zhì)雜種的現(xiàn)象以及其分子水平 上的組成特征為有針對(duì)性地選配融合組合、轉(zhuǎn)移由線粒體基因組控制的胞質(zhì)雄性不育性 狀、從而改良多籽柑橘品種提供了很好的實(shí)驗(yàn)體系。即將雄性不育品種的懸浮系原生質(zhì)體 與有籽品種的葉肉原生質(zhì)體融合，再生出有籽品種的二倍體胞質(zhì)雜種，其細(xì)胞核基因組來 自葉肉親本但帶有了無籽品種的雄性不育胞質(zhì)基因，有望改良有籽品種，使其不育，從而生 產(chǎn)無籽果實(shí)，實(shí)現(xiàn)二倍體水平上的無籽。
[0004] 大量有性雜交研究表明，溫州蜜柑的雄性不育性由核質(zhì)基因互作引起，為細(xì) 胞質(zhì)雄性不育類型（Yamamoto 等 1997. Aborted anthers of Citrus result from gene-cytoplasmic ale sterility. Sci Hortic70:9_14)。因此，有針對(duì)性地開展溫州蜜柑 與其它多籽柑橘類型間的融合研究，具有重要意義?；谠撍悸?，本專利 申請(qǐng)人:已獲得溫州 蜜柑與HB柚等融合再生的二倍體葉肉親本型胞質(zhì)雜種，且表現(xiàn)出雄性不育和果實(shí)無核；但 胞質(zhì)雜種創(chuàng)制的效率偏低。本發(fā)明旨在以GFP (綠色熒光蛋白）標(biāo)記負(fù)選擇，早期篩選不含 GFP標(biāo)記的柑橘胞質(zhì)雜種細(xì)胞，建立其安全、高效的早期篩選體系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)的不足，提供一種早期篩選柑橘胞質(zhì)雜種的方 法。通過將來自轉(zhuǎn)GFP基因柑橘愈傷組織細(xì)胞系的原生質(zhì)體與另一親本的葉肉原生質(zhì)體融 合，在離體培養(yǎng)的早期，在倒置熒光顯微鏡下篩選不帶GFP標(biāo)記的雜種細(xì)胞系進(jìn)一步培養(yǎng) 再生胞質(zhì)雜種，從而增強(qiáng)胞質(zhì)雜種創(chuàng)制的針對(duì)性，減少工作量，提高胞質(zhì)雜種創(chuàng)制的效率。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0007] 本發(fā)明的發(fā)明思路是：轉(zhuǎn)GFP基因柑橘愈傷組織細(xì)胞系的原生質(zhì)體與另一親本的 葉肉原生質(zhì)體融合,在離體培養(yǎng)的再生產(chǎn)物中，愈傷親本再生細(xì)胞系含有GFP標(biāo)記，體細(xì)胞 雜種融合雙親細(xì)胞核也含有來自愈傷親本的GFP標(biāo)記，而胞質(zhì)雜種的細(xì)胞核來自葉肉親本 不含GFP標(biāo)記；因此可在離體培養(yǎng)的早期，通過倒置熒光顯微鏡篩選不帶GFP標(biāo)記的雜種細(xì) 胞系進(jìn)一步培養(yǎng)再生得到胞質(zhì)雜種，從而增強(qiáng)胞質(zhì)雜種創(chuàng)制的針對(duì)性，減少工作量，提高胞 質(zhì)雜種創(chuàng)制的效率。
[0008] -種早期篩選柑橘胞質(zhì)雜種的方法，其步驟是：
[0009] 1)雙親材料的選擇：以轉(zhuǎn)GFP基因的國慶1號(hào)溫州蜜柑愈傷組織為懸浮系親本， 取保存于MT固體基本培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)有GFP基因的國慶1號(hào)溫州蜜柑愈傷組織于液體懸浮 培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，以14天為1個(gè)繼代培養(yǎng)周期，暗培養(yǎng)，溫度為28°C，搖床轉(zhuǎn)速控制在 110 - 120rpm ;繼代培養(yǎng)3個(gè)周期后進(jìn)行原生質(zhì)體分離；以有核柑橘為葉肉親本，將所述的 轉(zhuǎn)GFP基因國慶1號(hào)溫州蜜柑愈傷組織或有核柑橘葉肉分別用緩沖液A+酶液A或緩沖液 B+酶液B進(jìn)行原生質(zhì)體分離和純化，得到原生質(zhì)體；
[0010] 2)將步驟1)的原生質(zhì)體用電融合法融合，得到融合產(chǎn)物；
[0011] 3)將步驟2)的融合產(chǎn)物離心，去掉上清，將沉淀轉(zhuǎn)入MAl液體培養(yǎng)基，之后與 35-40°C的M2固體培養(yǎng)基等體積混合進(jìn)行固體包埋培養(yǎng)，待細(xì)胞團(tuán)長到直徑為0. 5-1. Ocm 時(shí)，在倒置熒光顯微鏡下觀察，篩選無熒光的再生細(xì)胞系轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培 養(yǎng)，使其分化出球形胚或心形胚，及時(shí)將所述的球形胚或心形胚轉(zhuǎn)移到胚狀體增殖培養(yǎng)基 上使其轉(zhuǎn)綠和進(jìn)一步發(fā)育成子葉形胚狀體；選取子葉形胚狀體轉(zhuǎn)入生芽培養(yǎng)基誘導(dǎo)生芽， 將獲得的叢芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根；將生根的雜種植株移栽入溫室，得到胞質(zhì)雜種材 料；
[0012] 4)對(duì)步驟3)的胞質(zhì)雜種材料，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性鑒定；以SSR和CAPS分 子標(biāo)記方法進(jìn)行細(xì)胞核基因組和線粒體基因組分析；以PCR和Southern blot方法鑒定是 否含有GFP基因。
[0013] 在本發(fā)明中：
[0014] 步驟（1)所述的葉肉親本選自早金甜橙。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下：
[0016] 1)本發(fā)明將轉(zhuǎn)GFP基因的柑橘愈傷組織細(xì)胞系用于胞質(zhì)雜種的安全高效早期篩 選，與采用不帶有GFP基因的柑橘愈傷組織細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞融合相比，胞質(zhì)雜種的離體篩 選效率大大提高：所挑選的無熒光細(xì)胞團(tuán)再生出的植株中胞質(zhì)雜種率將達(dá)到100%，且這些 植株100%不含GFP基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)胞質(zhì)雜種的安全高效篩選；
[0017] 2)與非對(duì)稱方法相比，方法簡單、易再生；
[0018] 3)與有性雜交相比，胞質(zhì)雜種在1年內(nèi)可創(chuàng)造再生，可顯著縮短育種周期。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為一種本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
[0020] 圖2為一種融合細(xì)胞培養(yǎng)早期突光觀察不意圖。
[0021] 圖2說明觀察的融合細(xì)胞在培養(yǎng)第6天時(shí)GFP熒光消失，此類細(xì)胞后期可能再 生為無熒光的細(xì)胞團(tuán)即胞質(zhì)雜種：a-b為細(xì)胞培養(yǎng)0天的情況，c-d為細(xì)胞培養(yǎng)6天的情 況；GFP模式激發(fā)波長為460-480nm，發(fā)射波長為495-540nm ;Bars=10 μ m。
[0022] 圖3為一種再生的愈傷組織示意圖。
[0023] 圖4為一種再生細(xì)胞團(tuán)的熒光觀察示意圖。
[0024] 圖中：a，b為無 GFP熒光的細(xì)胞團(tuán)（a明場(chǎng)；b GFP);c，d為有GFP熒光的細(xì)胞團(tuán)（c 明場(chǎng)；d GFP) ;Bars=40 μ m

【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明所涉及培養(yǎng)基或溶液，其配方如下：
[0026] 緩沖液A :MT基本培養(yǎng)基+0· 7mol/L蔗糖+500mg/L麥芽提取物，調(diào)pH至5. 8 ;
[0027] 緩沖液B :MT基本培養(yǎng)基+0· 6mol/L蔗糖+500mg/L麥芽提取物，調(diào)pH至5. 8 ;
[0028] 酶液A :0· 6%纖維素酶R-10+0. 6%離析酶R-10+12. 8%甘露醇 +0. 011%NaH2P04+0. 12% 嗎啉乙磺酸 +0. 36%CaCl2. 2H20,調(diào) pH 至 5. 8,酶液通過 0. 22 μ m 醋酸 纖維微孔濾膜過濾滅菌；
[0029] 酶液B :0· 75%纖維素酶R-10+0. 75%離析酶R-10+12. 8%甘露醇 +0. 011%NaH2P04+0. 12% 嗎啉乙磺酸 +0. 36%CaCl2. 2H20,調(diào) pH 至 5. 8,酶液通過 0. 22 μ m 醋酸 纖維微孔濾膜過濾滅菌；
[0030] MT固體培養(yǎng)基：MT基本培養(yǎng)基+40g/L蔗糖，調(diào)pH至5. 8 ;
[0031] MT播種培養(yǎng)基：MT基本培養(yǎng)基+30g/L蔗糖，調(diào)pH至5. 8 ;
[0032] 液體懸浮培養(yǎng)基：MT基本培養(yǎng)基+500mg/L麥芽提取物+1. 5g谷氨酰胺+40g/L蔗 糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L，調(diào)pH至5. 8 ;
[0033] MAl液體培養(yǎng)基：MT基本培養(yǎng)基+51. 34g/L蔗糖+81. 98g/L甘露醇+80mg/L腺嘌 呤，補(bǔ)充蒸餾水至1L，調(diào)pH至5. 8 ;
[0034] MA2固體培養(yǎng)基：MT基本培養(yǎng)基+51. 34g/L蔗糖+81. 98g/L甘露醇+12g/L低熔點(diǎn) 瓊脂糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L，調(diào)pH至5. 8 ;
[0035] 胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MT基本培養(yǎng)基+50g/L蔗糖+500mg/L麥芽提取物，補(bǔ)充蒸餾 水至1L，調(diào)pH至5. 8 ;
[0036] 乳糖固體培養(yǎng)基：MT基本培養(yǎng)基+50g/L乳糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L，調(diào)pH至5. 8 ;
[0037] 甘油固體培養(yǎng)基：MT基本培養(yǎng)基+20mL/L甘油，補(bǔ)充蒸餾水至1L，調(diào)pH至5. 8 ;
[0038] 胚狀體增殖培養(yǎng)基：MT基本培養(yǎng)基+50g/L蔗糖+1500mg/L麥芽提取物，補(bǔ)充蒸餾 水至1L，調(diào)pH至5. 8 ;
[0039] 生芽培養(yǎng)基：MT基本培養(yǎng)基+0. 5mg/L激動(dòng)素+0. 5mg/L6-芐基腺嘌呤+0. lmg/L吲 哚乙酸+30g/L蔗糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L，調(diào)pH至5. 8 ;
[0040] 生根培養(yǎng)基：1/2MT基本培養(yǎng)基+0· 5mg/L萘乙酸+0· lmg/L吲哚丁酸+0· 5g/L活 性炭+20g/L蔗糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L，調(diào)pH至5. 8 ;
[0041] 實(shí)施例1 :
[0042] 一種早期篩選柑橘胞質(zhì)雜種的方法，其步驟是：
[0043] 1、雙親材料的準(zhǔn)備：
[0044] 柑橘胚性懸浮系建立：挑選保存于MT固體培養(yǎng)基上生長旺盛、顆粒細(xì)小、顏色淡 黃及組織疏松的轉(zhuǎn)GFP基因國慶1號(hào)溫州蜜柑愈傷組織于液體懸浮培養(yǎng)基中進(jìn)行液體懸浮 培養(yǎng)。繼代周期為14d，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度控制在28°C，搖床轉(zhuǎn)速控制在110_120rpm。 繼代3次后用于親本原生質(zhì)體分離。
[0045] 葉肉親本制備：取早金甜橙有核柑橘品種成熟種子，先用1% (w/v)NaOH浸泡 5-10min，中間用玻璃棒攪拌多次以除去果膠，用蒸餾水洗凈NaOH后，經(jīng)1-3% (w/v) NaClO 表面消毒lOmin，無菌蒸餾水清洗3-5次，去種皮，接種于MT播種培養(yǎng)基，播種25天后，取充 分展開的葉片分離原生質(zhì)體。
[0046] 2、柑橘原生質(zhì)體的分離與純化：
[0047] 柑橘親本原生質(zhì)體分離參見郭文武等報(bào)道的方法(郭文武，鄧秀新，史永忠.柑橘 細(xì)胞電融合參數(shù)選擇及種間體細(xì)胞雜種植株再生.植物學(xué)報(bào)，1998,40 (4) :417-424)。具體 方法是：（1)轉(zhuǎn)GFP基因國慶1號(hào)溫州蜜柑愈傷組織原生質(zhì)體的酶解：在轉(zhuǎn)GFP基因國慶1 號(hào)溫州蜜柑愈傷組織懸浮系繼代的4-7天內(nèi)，用長吸管吸取約Ig愈傷組織于60mmX 15mm 小培養(yǎng)皿中，將此培養(yǎng)皿中的液體懸浮培養(yǎng)基吸干后，加入I. 5mL左右的緩沖液A，再加入 等體積的酶液A，培養(yǎng)皿用Parafilm封口后在暗培養(yǎng)箱（28°C)中靜置酶解16-20h。
[0048] 葉肉原生質(zhì)體的酶解：取MT播種培養(yǎng)基上充分展開的有核柑橘品種葉片，用 無菌手術(shù)刀片將葉片切成l_2mm的條狀，然后放入預(yù)先加入了 I. 5mL左右的緩沖液B的 60mmX 15mm培養(yǎng)皿中，最后加入等體積的酶液B，其后操作同于酶解愈傷組織原生質(zhì)體。
[0049] 酶解完成后的兩種原生質(zhì)體均通過孔徑為45 μ m的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，以除去殘留 材料和大細(xì)胞團(tuán)，然后用CPW13 (配方見表1)洗滌篩網(wǎng)以充分收集原生質(zhì)體；將濾液倒入 IOmL的離心管中960rpm(100g)離心7_8min，棄上清液，將沉淀物與I. OmL的CPW13混勻， 然后將此混合液用吸管輕輕地轉(zhuǎn)移到預(yù)先加入了 3mL CPW26 (配方見表1)的IOmL離心管 中，經(jīng)CPW13/CPW26界面密度梯度離心（960rpm(100g) ) 2-3min后，用吸管將兩液面間的原 生質(zhì)體帶吸出，用電融合液重懸后960rpm(100g)離心洗漆1-2次，每次6-8min。純化后的 原生質(zhì)體懸浮于電融合液（〇.7mol/L甘露醇+ 0.25m mol/L CaCl2)中，用血球計(jì)數(shù)板將愈 傷組織原生質(zhì)體密度調(diào)整為IX IO6個(gè)/mL，葉肉原生質(zhì)體調(diào)整到2 X IO6個(gè)/mL。
[0050] 表ICPW鹽配方

【權(quán)利要求】
1. 一種早期篩選柑橘胞質(zhì)雜種的方法，步驟如下： 1) 轉(zhuǎn)GFP基因國慶1號(hào)溫州蜜柑愈傷組織于液體懸浮培養(yǎng)基中進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)；繼 代周期為14 d，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度控制在28°C，搖床轉(zhuǎn)速110_120rpm ;繼代3次后用 于原生質(zhì)體分離；取早金甜橙有核柑橘品種成熟種子，用1% w/vNaOH浸泡5-10 min,中間 用玻璃棒攪拌以除去果膠，用蒸餾水洗凈NaOH，1-3% w/v NaClO表面消毒10 min，無菌蒸餾 水清洗3-5次，去種皮，接種于MT播種培養(yǎng)基，播種25天后，取充分展開的葉片分離原生質(zhì) 體，進(jìn)行葉肉原生質(zhì)體分離； 2) 將步驟1)的原生質(zhì)體用電融合法融合，得到融合產(chǎn)物； 3) 將步驟2)的融合產(chǎn)物離心，去掉上清，將沉淀轉(zhuǎn)入MAl液體培養(yǎng)基，之后與35-40°C的MA2固體培養(yǎng)基等體積混合進(jìn)行固體包埋培養(yǎng)，待細(xì)胞團(tuán)長到直徑為0.5-1. 0 cm 時(shí)，在倒置熒光顯微鏡下觀察，篩選無熒光的再生細(xì)胞系轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培 養(yǎng)，使其分化出球形胚或心形胚，及時(shí)將所述的球形胚或心形胚轉(zhuǎn)移到胚狀體增殖培養(yǎng)基 上使其轉(zhuǎn)綠和進(jìn)一步發(fā)育成子葉形胚狀體；選取子葉形胚狀體轉(zhuǎn)入生芽培養(yǎng)基誘導(dǎo)生芽， 將獲得的叢芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根；將生根的雜種植株移栽入溫室，得到胞質(zhì)雜種材 料； 4) 對(duì)步驟3)的胞質(zhì)雜種材料，采用以下方式進(jìn)行鑒定： 流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性鑒定：由無熒光細(xì)胞團(tuán)再生的植株中大部分為二倍體，有少量四 倍體； SSR，cpSSR和CAPS分子標(biāo)記方法進(jìn)行細(xì)胞核基因組和胞質(zhì)基因組分析：SSR結(jié)果表明 由無熒光細(xì)胞團(tuán)再生的植株其核基因組來自葉肉親本早金甜橙，CAPS結(jié)果表明其線粒體基 因組來自愈傷組織親本國慶1號(hào)溫州蜜柑，cpSSR結(jié)果表明其葉綠體基因組可能來自雙親 之一或者同時(shí)具有雙親的葉綠體基因組，即所有再生植株均為胞質(zhì)雜種； PCR和Southern blot方法鑒定是否含有GFP基因：所有由無熒光細(xì)胞團(tuán)再生的植株 將不含GFP基因，即再生植株100%去除了 GFP標(biāo)記基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)胞質(zhì)雜種的安全篩選。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104212878SQ201310221676
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月5日
【發(fā)明者】郭文武, 肖詩鑫 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)