一種從鮮奶中高效提取核酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從鮮奶中高效提取核酸的方法，屬生物工程應用【技術領域】，其特征在于包括如下步驟：（1）、二次向鮮奶樣品中加入生理鹽水，經混合離心后，棄去脂肪層和上層液體，得沉淀A；（2）、向沉淀A中加入TES溶液、鹽酸胍溶液和蛋白酶K溶液；經水浴后室溫冷卻，再加入Tris飽和酚，經抽提離心后，取上清液B；（3）、向上清液B中加入乙酸鈉溶液和異丙醇，經混合離心后，棄上清，得核酸溶于雙蒸水中，-20℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明能有效地排除脂肪和蛋白質對核酸提取的影響，具有從多種鮮奶中方便有效地提取核酸、提取核酸的濃度和純度高、方法簡單的特點。
【專利說明】一種從鮮奶中高效提取核酸的方法

【技術領域】
:
[0001]本發(fā)明涉及一種從鮮奶中高效提取核酸的方法，屬生物工程應用【技術領域】。

【背景技術】
:
[0002]近年來，分子生物學的發(fā)展促進了在動物方面研究的深度和廣度。長期以來，家畜核酸的來源和提取主要源于家畜的血液，而家畜血液的采集對家畜有一定的應激反應，同時也有一定的難度，而鮮奶的采集就比較容易了。從樣品中提取的核酸是進行病原微生物檢測、物種鑒定、物種起源、物種多樣性評估及其親緣關系、物種系統(tǒng)進化等研究的必要材料。然而，在鮮奶中含有大量的脂肪和豐富的蛋白質，這對于提取鮮奶中的核酸造成了很大的困難，導致提取的核酸純度不夠和濃度很低。能否提取出高質量的核酸分子則是核酸分子生物學實驗的關鍵，提取方法的靈敏度、特異性也將直接關系到后續(xù)實驗的成敗。傳統(tǒng)的核酸抽提方法主要包括異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法、堿抽提法、溴化十六烷基三甲銨抽提法、溴化乙錠-氯化銫梯度離心法和寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸-纖維素層析法等。這些方法都難以有效去除鮮奶中的脂肪和蛋白質，以至所獲得的核酸純度不夠，致使嚴重影響后續(xù)研究的開展，甚至無法進行后續(xù)的研究。


【發(fā)明內容】

:
[0003]為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種從鮮奶中高效提取核酸的方法，能有效地排除脂肪和蛋白質對核酸提取的影響，具有從多種鮮奶中方便有效地提取核酸、提取核酸的濃度和純度高、方法簡單的特點。
[0004]本發(fā)明是通過如下技術方案來實現(xiàn)上述目的的。
[0005]本發(fā)明所提供的一種從鮮奶中高效提取核酸的方法，包括如下步驟:
[0006](I)、取鮮奶樣品，向鮮奶樣品中加入其體積50%的生理鹽水，混合均勻，13000轉/分鐘、4°C離心10分鐘，棄去脂肪層和上層液體；再向余下的液體中加入鮮奶樣品等體積的生理鹽水，混合均勻，13000轉/分鐘、4°C離心10分鐘，棄去脂肪層和上層液體，得沉淀A ；
[0007]所述的鮮奶樣品為奶牛鮮奶、水牛奶鮮奶或羊奶鮮奶；
[0008](2 )、向沉淀A中加入86%鮮奶樣品體積的TES溶液、10%鮮奶樣品體積的鹽酸胍溶液和4%鮮奶樣品體積的蛋白酶K溶液；50°C水浴12小時，室溫冷卻，再加入50%鮮奶樣品體積的Tris飽和酚，抽提10分鐘，13000轉/分鐘、4°C離心5分鐘，取上清液B，棄沉淀；
[0009]所述的TES 溶液，其 Tris-HCl 終濃度為 50mmol/L ；EDTA 終濃度為 10mmol/L ；SDS終濃度為1% ;PH值為8.0 ;
[0010]所述的鹽酸胍溶液的濃度為5mol/L ；
[0011]所述的蛋白酶K溶液的濃度為20mg/mL ；
[0012]所述的Tris飽和酚為市售成品；
[0013](3)、取上清液B，向上清液B中加入10%上清液B體積的乙酸鈉溶液和80%上清液B體積的異丙醇，混合均勻，沉淀核酸，13000轉/分鐘、4°C離心10分鐘，棄上清，得核酸溶于10%鮮奶樣品體積的雙蒸水中，-20°c保存?zhèn)溆茫?br> [0014]所述的乙酸鈉溶的濃度為3mol/L、pH值為5.2 ；
[0015]所述的異丙醇為市售成品。
[0016]本發(fā)明與現(xiàn)有的技術相比具有如下有益效果:
[0017]1、本發(fā)明采用兩次加入生理鹽水、高速冷凍離心的方法，使鮮奶中的脂肪對提取核酸過程沒有影響，提高了核酸提取的純度。
[0018]2、本發(fā)明采用鹽酸胍和蛋白酶K對蛋白質的分解消化以及Tris飽和酚對蛋白質的分離，使后續(xù)沉淀核酸的過程中只含有極其微量的蛋白質，使提取的核酸的濃度和純度都很高。
[0019]3、本發(fā)明能有效地排除脂肪和蛋白質對核酸提取的影響，具有從多種鮮奶中方便有效地提取核酸、提取核酸的濃度和純度高、方法簡單的特點。

【具體實施方式】
:
[0020]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明:
[0021]1、試劑(試劑均為分析純或生物級別)
[0022]生理鹽水；TES溶液(Tris-HCl 終濃度為 50mmol/L ；EDTA 終濃度為 10mmol/L ；SDS終濃度為1% ;pH值為8.0);鹽酸胍溶液(5mol/L);蛋白酶K溶液(20mg/mL);乙酸鈉溶液(3mol/L, pH值為5.2) ；Tris飽和酚；異丙醇。
[0023]2、儀器設備及材料
[0024]高速冷凍離心機(至少滿足13 000轉/分鐘、4°C);超純水發(fā)生器(分子生物學級另Ij);恒溫水浴鍋；冰箱(2°C~81:、-20°0;微量可調移液器及配套吸頭(1(^1~100 μ 1，50 μ I ~ 200 μ 1，100μ I ~1000 μ I);離心管(1.5mL、2mL)。
[0025]3、實驗方法
[0026](I)、取水牛奶鮮奶樣品ΙΟΟΟμ 1，加入500μ I生理鹽水，混合均勻，13000轉/分鐘、4°C離心10分鐘，棄去脂肪層和上層液體，再加入1000 μ I生理鹽水，混合均勻，13000轉/分鐘、4°C離心10分鐘，棄去脂肪層和上層液體，得沉淀A ;
[0027](2)向步驟(1)的沉淀A中加入860μ I TES溶液、100 μ I濃度為5mol/L的鹽酸胍溶液和40 μ I濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液，50°C水浴12小時，室溫冷卻，再加入500 μ ITris飽和酚，抽提10分鐘，13000轉/分鐘、4°C離心5分鐘，取上清液B，棄沉淀；
[0028](3)取步驟(2)的上清液B，加入10%上清液B體積、濃度為3mol/L、pH值為5.2的乙酸鈉溶液和80%上清液B體積的異丙醇，混合均勻，沉淀核酸，13000轉/分鐘、4°C離心10分鐘，棄上清，得核酸溶于100 μ I的雙蒸水中，-20°c保存?zhèn)溆谩?br> [0029]4、結果
[0030]水牛奶鮮奶體細胞數(shù)(SCC)以及提取核酸的純度和濃度如表1所示。
[0031]SCC 范圍:1.6 萬/ml ~193.4 萬 /ml，濃度范圍:2789.1ng/μ I ~7280.7ng/μ 1，Α260/Α280 范圍:1.56 ~2.17。
[0032]經SPSS統(tǒng)計分析，SCC與核酸的濃度之間的相關系數(shù)為0.716。
[0033]表1水牛奶鮮奶核酸提取結果
[0034][9εοο]

【權利要求】
1.一種從鮮奶中高效提取核酸的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)、取鮮奶樣品，向鮮奶樣品中加入其體積50%的生理鹽水，混合均勻，13000轉/分鐘、4°C離心10分鐘，棄去脂肪層和上層液體；再向余下的液體中加入鮮奶樣品等體積的生理鹽水，混合均勻，13000轉/分鐘、4°C離心10分鐘，棄去脂肪層和上層液體，得沉淀A ; (2)、向沉淀A中加入86%鮮奶樣品體積的TES溶液、10%鮮奶樣品體積的鹽酸胍溶液和4%鮮奶樣品體積的蛋白酶K溶液；50°C水浴12小時，室溫冷卻，再加入50%鮮奶樣品體積的Tris飽和酚，抽提10分鐘，13000轉/分鐘、4°C離心5分鐘，取上清液B,棄沉淀； (3)、取上清液B，向上清液B中加入10%上清液B體積的乙酸鈉溶液和80%上清液B體積的異丙醇，混合均勻，沉淀核酸，13000轉/分鐘、4°C離心10分鐘，棄上清，得核酸溶于10%鮮奶樣品體積的雙蒸水中，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權利要求1所述的一種從鮮奶中高效提取核酸的方法，其特征在于所述的TES溶液，其Tris-HCl終濃度為50mmol/L ；EDTA終濃度為10mmol/L ；SDS終濃度為1% ;pH值為8.0 ;所述的鹽酸胍溶液 的濃度為5mol/L ;所述的蛋白酶K溶液的濃度為20mg/mL ;所述的乙酸鈉溶液的濃度為3mol/L、pH值為5.2。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種從鮮奶中高效提取核酸的方法，其特征在于所述的鮮奶樣品為奶牛鮮奶、水牛奶鮮奶或羊奶鮮奶。
【文檔編號】C12N15/10GK104164416SQ201310181887
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月16日 優(yōu)先權日:2013年5月16日
【發(fā)明者】楊豐利, 李小杉 申請人:長江大學