麥角硫因的提取及純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生化制品、食品及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種麥角硫因的分離精制方法，尤其涉及一種從菌絲體中提取及純化麥角硫因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]麥角硫因(L-Ergoth1neine，EGT)是一種稀有的天然手性氨基酸，是生物體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì)，具有清除自由基、解毒、維持DNA的生物合成、細(xì)胞的正常生長、細(xì)胞免疫、抗福射、美白及抗衰老等功能，被認(rèn)定是一種特有的、多功能的細(xì)胞生理保護(hù)劑，尤其在抗氧化和能量調(diào)節(jié)等方面起著重要的作用，因此麥角硫因在食品、化妝品及生物醫(yī)藥等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]全球營養(yǎng)學(xué)會首席執(zhí)行官M(fèi)arvin S.Hausman MD指出:由于麥角硫因能夠抑制多種疾病對人體細(xì)胞和組織造成的傷害，可以視之為人體內(nèi)一種重要的維生素，并可以作為膳食功能食品的一種成分(Grigat S,Harlfinger S’Pal S,et al.Probing the substratespecificity of the ergoth1neine transporter with methimazole， hercynine， andorganic cat1ns.B1chemPharmacol，2007，74:309-316.)。
[0004]實(shí)驗(yàn)證明，人和動物攝入麥角硫因后不會產(chǎn)生任何毒副作用，是通常認(rèn)為安全的(generally recognized as safe, GRAS)?；邴溄橇蛞蛱厥獾纳飳W(xué)功能和藥理活性，美國OXIS國際公司推出了一款以麥角硫因制成的膳食補(bǔ)充劑ErgoFlex，具有緩解慢性關(guān)節(jié)疼痛、促進(jìn)軟骨健康、減輕炎癥、改善體質(zhì)和補(bǔ)充能量等的作用(Benson KF, AgerDM, Landes B, et al.1mprovement of joint range of mot1n(ROM)and reduct1n ofchronic pain after consumpt1n of an ergoth1neine-containing nutrit1nalsupplement.Prev Med,2012, 54:S83_S89.)。
[0005]與化學(xué)合成法和天然生物提取法相比，蕈菌深層發(fā)酵生物合成麥角硫因具有產(chǎn)量高、成本低、易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)及產(chǎn)品安全等優(yōu)勢，是合成麥角硫因的技術(shù)發(fā)展方向。蕈菌生物合成的麥角硫因絕大部分積累于菌絲體內(nèi)，因此，以蕈菌深層發(fā)酵制備麥角硫因產(chǎn)品，必須具備從菌絲體中提取和純化麥角硫因的技術(shù)。
[0006]Mitsubishi用丙酮或乙醇溶液萃取杯傘屬子實(shí)體的干燥粉末，再利用柱層析、薄層層析、離子交換層析及紙電泳技術(shù)進(jìn)一步純化麥角硫因(Mitsubishi, Chem Ind.JP58057365-A) ；Harada E利用乙酸乙酯浸提茶樹菇子實(shí)體，再通過陽離子交換樹脂和硅膠色譜層析進(jìn)一步分離提取，冷凍干燥后，經(jīng)葡聚糖凝膠過濾和反相高壓液相色譜純化得高純度的麥角硫因(Univ Nagoya, Iwade Kingaku Kenkyusho Kk, Daicel Chem.Method for producing ergoth1neine[P].JP:JP2009161498A) ；Nukina M 等從人工栽培的蘑菇子實(shí)體中提取麥角硫因，首先將蘑菇干燥粉碎，熱水浸提，過濾后再用乙醇溶解，使用陽離子交換樹脂、硅膠薄層層析分離提取，后經(jīng)高壓液相色譜和冷凍干燥制備高純度麥角硫因(Nukina M.Preparat1n of ergoth1neine useful in pharmaceuticals,by fract1nating mushroom extract containing ergoth1neine, with solvent,separating the ergoth1neine， and purifying the fract1n liquid containing theergoth1neine[P], JP JP2008110988-A);國內(nèi)未見關(guān)于麥角硫因的純化研究，僅有報導(dǎo)周念波等從雙孢菇菇柄中提取麥角硫因，先將菇柄粉碎，利用熱的NaOH溶液浸提，離心去除固形物，上清液減壓濃縮，再使用氧化鋁層析分離提取，麥角硫因回收率為91.2%，純度達(dá)25.6%。(周念波，李軼群，殷勤紅，氧化鋁柱層析從雙孢菇菇柄中提取麥角硫因[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38 (27): 14842 ?14843.)。
[0007]上述純化方法步驟多，程序復(fù)雜；浸提溶劑大多采用有機(jī)溶劑或添加化學(xué)試劑，進(jìn)一步純化時必須去除額外添加的有機(jī)溶劑或其他試劑；采用離子交換層析、氧化鋁層析等常壓層析法雖然可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備，但分離效率和產(chǎn)品純度低，操作復(fù)雜，尤其不適用于成分較復(fù)雜的樣品的分離；利用高效液相色譜法(HPLC^i)雖然能純化得到高純度的麥角硫因，但成本高，制備量小，僅能得毫克級產(chǎn)品，只限于實(shí)驗(yàn)室研究應(yīng)用。
[0008]中壓制備色譜是天然產(chǎn)物、生物制品純化和精制的新型分離純化系統(tǒng)，具有分離過程壓力恒定，中壓制備，流速快，處理量大，柱效高，產(chǎn)品純度高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)中未見有采用中壓制備色譜純化麥角硫因的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種從菌絲體中快速大量提取及純化麥角硫因的方法，從而為食品、保健、醫(yī)藥等行業(yè)提供所需純度的麥角硫因產(chǎn)品，該方法簡單易行，尤其適用于麥角硫因的規(guī)?；a(chǎn)。
[0010]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0011]1、熱水浸提:蕈菌菌絲體深層發(fā)酵結(jié)束后，菌絲體發(fā)酵液經(jīng)固液分離，收集菌絲體，按濕菌絲體重:水(g: mL)加入1: 0.5?1: 40的水，制成菌絲體的水懸液。將菌絲體水懸液升溫至70?100°C,以O(shè)?600rpm攪拌浸提I?60min,麥角硫因從菌絲體的細(xì)胞內(nèi)被浸提到細(xì)胞外的水溶液中。固液分離，分別收集菌絲體和麥角硫因水溶液，菌絲體可以按上述方法重復(fù)浸提，對于多次浸提的，合并浸提后的麥角硫因水溶液。
[0012]所述的固液分離方法可以是離心、過濾或自然沉降。
[0013]2、超濾:將步驟I所得的麥角硫因水溶液采用超濾膜過濾，去除蛋白、多糖等的大分子雜質(zhì)。收集超濾透過液，根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行干燥或濃縮，得到干燥粗品或濃縮液。麥角硫因可干燥為固體粗品或濃縮至含量高于0.1g / L0
[0014]超濾所用的超濾膜可以是陶瓷膜或高分子材料的膜。超濾膜的截留分子量選擇IkDa ?30kDa,優(yōu)選 4kDa ?6kDa。
[0015]超濾前可以先微濾。微濾膜可以是陶瓷膜、金屬膜或高分子材料的膜。微濾膜的孔徑0.01?5 μ m,優(yōu)選0.1?0.5 μ m。
[0016]所述的干燥方法可以是但不限于噴霧干燥、真空干燥或冷凍干燥，干燥后得到麥角硫因粗廣品。
[0017]所述的濃縮方法可以是但不限于蒸發(fā)或真空濃縮。
[0018]3、色譜純化:將步驟2所得的粗產(chǎn)品或濃縮液加入0.5?5倍體積的乙腈溶解，超聲處理I?30min，經(jīng)0.1?0.5 μ m孔徑的微濾膜過濾，濃縮至達(dá)到制備色譜系統(tǒng)的進(jìn)樣要求后進(jìn)行色譜純化，例如麥角硫因的濃度在6g / L?48g / L。
[0019]所述的純化色譜柱可以是但不限于Flash色譜柱、動態(tài)軸向壓縮柱等，色譜填料為HILIC(親水作用色譜)填料。色譜柱規(guī)格根據(jù)實(shí)際處理量而定。
[0020]所述的流動相組成為乙腈-水，采用等度洗脫，流動相體積比選擇80: 20?88: 12，優(yōu)選88: 12?85: 15。所述的色譜檢測波長為280nm，收集波長為254nm ;麥角硫因進(jìn)樣量為每10g填料0.0lg?0.323g，優(yōu)選0.113g?0.225g，流速根據(jù)色譜柱的規(guī)格而定。
[0021]根據(jù)紫外檢測光譜圖，對分離的每個色譜峰的對應(yīng)物進(jìn)行收集，利用高壓液相色譜(HPLC)檢測，濃縮和干燥含有麥角硫因的組分，所得樣品的麥角硫因純度達(dá)96.6?99.0%。
[0022]所述的濃縮方法可以是但不限于蒸發(fā)或真空濃縮。
[0023]所述的干燥方法可以是但不限于噴霧干燥、真空干燥或冷凍干燥，干燥后得到高純度的麥角硫因產(chǎn)品。
[0024]麥角硫因的檢測方法:
[0025]高壓液相色譜法(HPLC),色譜柱為HILIC分析柱(250mmX4.6mm, 5 μ m),流動相為乙腈-7jC，體積比為85: 15，使用20mmol / L乙酸-乙酸銨緩沖液調(diào)節(jié)流動相的pH至6.0，檢測波長254nm，柱溫40°C，流速ImL / min,進(jìn)樣量10 μ L。
[0026]本發(fā)明的優(yōu)勢在于:
[0027](I)步驟少，耗時短，操作簡便，得率高，產(chǎn)品的純度高，并且可以根據(jù)不同的應(yīng)用需要，制備多種純度的麥角硫因產(chǎn)品。
[0028](2)菌絲體內(nèi)麥角硫因的浸提工藝僅以水為浸提溶劑，替代了低沸點(diǎn)的有機(jī)萃取溶液，在浸提過程中不添加任何無機(jī)化學(xué)品和石油化工類試劑；浸提劑的成本最低，避免了操作過程中大量使用有機(jī)溶劑可能帶來的危險；沒有增加雜質(zhì)，后續(xù)工藝不必考慮去除人為添加的雜質(zhì)。
[0029](3)采用超濾技術(shù)實(shí)現(xiàn)了麥角硫因與大分子雜質(zhì)的分離，得到麥角硫因純度達(dá)25.2%?34.7%的產(chǎn)品，適于純度要求較低的應(yīng)用。同時避免了大分子雜質(zhì)對后續(xù)使用的色譜填料的危害，超濾工藝沒有相變，操作簡單，能耗低，成本低，不添加化學(xué)試，無污染。
[0030](4)進(jìn)一步純化采用中壓色譜，相比于常壓柱層析分離，本方法制備的麥角硫因純度高，工藝及產(chǎn)品質(zhì)量易控制，適合于成分復(fù)雜樣品中的麥角硫因的分離純化。與高壓液相色譜技術(shù)相比，本發(fā)明能夠大規(guī)模制備高純度的麥角硫因，產(chǎn)量高，設(shè)備投資小，運(yùn)行成本低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0031]圖1是實(shí)施例2中的中壓色譜分離圖譜；
[0032]圖2是實(shí)施例2中色譜純化后的麥角硫因HPLC檢測圖譜；
[0033]圖3是實(shí)施例3中的中壓色譜分離圖譜；
[0034]圖4是實(shí)施例3中色譜純化后的麥角硫因HPLC檢測圖譜；
[0035]圖5是實(shí)施例4中的中壓色譜分離圖譜；
[0036]圖6是實(shí)施例4中色譜純化后的麥角硫因HPLC檢測圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明