納豆激酶高產(chǎn)枯草芽孢桿菌株的篩選及液態(tài)發(fā)酵的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中一種納豆激酶高產(chǎn)枯草芽孢桿菌株篩選及液態(tài)發(fā)酵的方法。該發(fā)明篩選出一株納豆激酶高產(chǎn)菌株YBNK-1，經(jīng)廣東省微生物分析檢測中心檢測為枯草芽孢桿菌，檢測報告編號為粵微檢2012ZD0175。經(jīng)液態(tài)發(fā)酵配方及發(fā)酵工藝優(yōu)化，所得平均納豆激酶活性為每毫升2000尿激酶活性以上。為納豆激酶產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】納豆激酶高產(chǎn)枯草芽孢桿菌株的篩選及液態(tài)發(fā)酵的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中一種納豆激酶高產(chǎn)枯草芽孢桿菌株篩選及液態(tài)發(fā)酵 的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 今后30年，我國老年人口將越來越多，老年人的身體健康問題越來越受到人們的 關(guān)注和重視。心腦血管栓塞性疾病是危害老年人健康最嚴重而又常見的疾病之一。目前， 血栓癥已逐漸成為死亡率最高的疾病之一，而溶解血栓是治療這一類疾病的一種重要手 段。因此，對溶栓藥物的研究已被廣為重視。當前作為第一代溶栓藥物鏈激酶（SK)、尿激酶 (UK)在臨床上廣為應(yīng)用，但它們均為激活人體內(nèi)血液中血纖維酶原，從而降解纖維蛋白，容 易引起全身性纖溶激活并伴有出血傾向。同時SK還具有抗原性并有過敏性反應(yīng)。而作為 第二代纖溶藥物的t-PA盡管對纖維蛋白有很高的選擇性，但臨床上為了取得較好的溶栓 效果而應(yīng)用大劑量（l〇〇mg)從而部分失去了對纖維蛋白的選擇性，因此依舊會導致出血等 副作用，并且具有纖維蛋白特異性差、體內(nèi)半衰期短、生產(chǎn)成本高、需大劑量連續(xù)用藥等缺 點。鑒于此，開發(fā)新型溶栓藥物已成為重要的研究熱點之一。目前，納豆激酶（NK)作為來 自于食品、高效安全并可直接由消化道吸收、起到溶解纖維蛋白作用的纖溶酶，具有安全性 好，體內(nèi)作用時間長，藥效時間長等優(yōu)點。正在成為當今溶栓藥研究的焦點。
[0003] 當今影響納豆激酶產(chǎn)業(yè)化的最主要原因是，生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)周期長。因此篩選出 一株高產(chǎn)納豆激酶的菌株，以及建立一種合適的發(fā)酵工藝，對納豆激酶的產(chǎn)業(yè)化具有重要 意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種用于納豆激酶液態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括：大豆蛋白胨，可溶 性淀粉，Na 2HP04 · 12H20, KH2P04, CaCl2, MgS04 · 7H20。
[0005] 根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：大豆蛋白胨1. 0-2. 5%，可溶性淀粉2. 0-4%， Na2HP04 ·12Η200· 4-0. 5%，ΚΗ2Ρ040· 15-0. 25%，CaCl20. 01-0. 03%，MgS04 ·7Η200· 05-007%。
[0006] 本發(fā)明還提供一種納豆激酶液態(tài)發(fā)酵的方法，其特征在于，所述方法包括以下步 聚：
[0007] (1)取保存于固體培養(yǎng)基上的菌種（優(yōu)選半環(huán)），接種在種子培養(yǎng)基中（pH優(yōu)選為 6. 8-7. 2),
[0008] (2)恒溫培養(yǎng)（優(yōu)選10-14小時），之后接種到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明，步驟（1)在已消毒的超凈工作臺上進行。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明，其中接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量為2-10%，優(yōu)選2-4%。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明，步驟⑴所述接種在種子培養(yǎng)基中的操作條件：優(yōu)選的溫度為 34-37°C，優(yōu)選的轉(zhuǎn)速為 160-300rpm。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，步驟（2)中的發(fā)酵為液態(tài)發(fā)酵，優(yōu)選上述液態(tài)發(fā)酵可以在搖瓶中發(fā) 酵，也可以在發(fā)酵罐中發(fā)酵，例如5L的發(fā)酵罐。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，在搖瓶中發(fā)酵，培養(yǎng)基pH優(yōu)選為6.9-7. 1，溫度優(yōu)選33-18°C，160rpm 恒溫培養(yǎng)48-54小時。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，在發(fā)酵罐中發(fā)酵，采取隨著發(fā)酵罐的溶解氧（D0)的變化而提高發(fā)酵 罐攪拌子的轉(zhuǎn)速，即隨著發(fā)酵時間的延長而調(diào)大攪拌速度，優(yōu)選攪拌速度從300rpm提高到 700rpm，更優(yōu)選從320rpm提高到700rpm。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，在發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵罐裝液量為50-70%，接種量為2-4%，通氣量 為0. 5-0. 8vvm，培養(yǎng)pH為6. 9-7. 1 (以氨水和乙酸調(diào)節(jié)pH)，溫度為35-37°C，整個發(fā)酵周期 為28-32小時。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，所述種子培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，包括蛋白胨1. 0 %，牛肉膏 0. 5%，NaClO. 5%，pH值7. 0,或者在其中加入一些緩沖液成份。
[0017] 本發(fā)明還提供一種高產(chǎn)納豆激酶的芽孢枯草桿菌株YBNK-1，經(jīng)廣東省微生物分析 檢測中心鑒定為枯草芽孢桿菌，檢測報告編號為粵微檢2012ZD0175。
[0018] 上述菌株經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)保藏，地 址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期：2013年04月 12日，保藏號為CGMCC N0. 7467,確定為枯草芽孢桿菌，Bacillus subtilis。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種所述高產(chǎn)菌株的篩選方法：通過劃線反復(fù)純化及紫外誘變， 從市售納豆中純化出8株納豆菌，選擇經(jīng)纖維平板檢測活性最強的菌株YBNK-1。
[0020] 該技術(shù)方案的優(yōu)點
[0021] 本技術(shù)方案所用的納豆菌種經(jīng)發(fā)酵罐液態(tài)發(fā)酵后，所得納豆激酶活性達到每毫升 1800-2100尿激酶單位。經(jīng)過多批次發(fā)酵試驗，本技術(shù)方案具有操作簡單，原料易得，發(fā)酵周 期短，酶活高，滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為不同時間點納豆激酶在兩種碳源SDS-PAGE檢測結(jié)果。
[0023] 圖2為納豆激酶溶圈法檢測菌種在兩種碳源培養(yǎng)基中活性檢測結(jié)果（DF :可溶性 淀粉；PT :葡萄糖）。
[0024] 圖3為種齡為（9/10/11)納豆激酶在4%葡萄糖和4%可溶性淀粉的發(fā)酵培養(yǎng)基 中表達
[0025] SDS-PAGE檢測結(jié)果（DF :可溶性淀粉；PTT :葡萄糖）。
[0026] 圖4為種齡為（9/10/11)納豆激酶在4%葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中溶圈法活性檢測 結(jié)果（DF :可溶性淀粉；PTT :葡萄糖）。
[0027] 圖5為種齡為（9/10/11)納豆激酶在4%可溶性淀粉的發(fā)酵培養(yǎng)基中溶圈法活性 檢測結(jié)果（DF :可溶性淀粉；PTT :葡萄糖）。

【具體實施方式】
[0028] 斜面培養(yǎng)基的配方：蛋白胨1.0%，牛肉膏0. 5%，NaC10. 5%，瓊脂2%，pH值7. 0。
[0029] 發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1. 0 %，可溶性淀粉2. 0 %，Na2HP04 · 12H200. 4 %， ΚΗ2Ρ040· 15%，CaCl20. 01%，MgS04 · 7Η200· 05%。
[0030] 種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，NaCll.O%，pH值7.0，121°C下滅菌 20min〇
[0031] 實施例1 :高產(chǎn)菌株的篩選
[0032] 1)在已消毒的超凈工作臺中，取高純度納豆素膠囊，溶于已滅菌的10ml種子培養(yǎng) 基中，待其充分溶解后，取20(^1接種到3〇1111/25〇1111(三角瓶中） ；
[0033] 2) 160rpm，35°C 恒溫振蕩培養(yǎng)；
[0034] 3)培養(yǎng)10h后，在已滅菌的超凈工作臺中，取100 μ 1菌液，涂平板；
[0035] 倒置平板，35°C恒溫培養(yǎng)；
[0036] 4) 35°C恒溫培養(yǎng)24h，挑取長勢良好的單菌落，接種到已滅菌30ml/250ml (三角 瓶）種子培養(yǎng)基中；
[0037] 5)以3% (V/V)接種量接種到已滅菌的30ml/250ml (三角瓶）發(fā)酵培養(yǎng)基中；
[0038] 6) 35°C，160rpm恒溫振蕩培養(yǎng)，在不同的時間點取樣，檢測納豆激酶表達情況。
[0039] 實施例2 :納豆激酶高產(chǎn)菌株在不同碳源中表達的情況
[0040] 1)在已消毒的超凈工作臺中，取上述篩選的納豆菌高產(chǎn)菌株，接種到已滅菌的 30ml/250ml (三角瓶）種子培養(yǎng)集中；
[0041] 2)35°C，160rpm，培養(yǎng)8h后，以3%接種量分別接種到已滅菌的碳源為葡萄糖、可 溶性淀粉的發(fā)酵培養(yǎng)基中；
[0042] 3) 35°C，160rpm 恒溫振蕩培養(yǎng)；
[0043] 4)每隔一段時間取樣，待用。
[0044] 結(jié)果如下：
[0045] 由圖1、圖2可知納豆激酶在以淀粉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，標準曲線為y = 0. 2724x+l. 4852(R2 = 0. 983)，最大活性為693U/ml，此時的碳源是可溶性淀粉。
[0046] 實施例3 :納豆激酶高產(chǎn)菌株不同種齡菌種在4%可溶性淀粉基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中 表達情況
[0047] 1)在已消毒的超凈工作臺中，取上述篩選的納豆菌高產(chǎn)菌株，接種到已滅菌的 30ml/250ml (三角瓶）種子培養(yǎng)基中；
[0048] 2)35°C，160rpm，培養(yǎng)9h，10h，llh后，以3%接種量分別接種到已滅菌的碳源為 4%可溶性淀粉和4%葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中；
[0049] 3) 35°C，160rpm 恒溫振蕩培養(yǎng)；
[0050] 4)每隔一段時間取樣，待用。
[0051] 由圖3、圖4、圖5可知，種齡為10h，在表達后48h活性能接近2000U/ml，并且進一 步說明以可溶性淀粉作為碳源比以葡萄糖作為碳源更有利于納豆激酶的表達。
[0052] 實施例4 :納豆激酶500ml搖瓶試驗
[0053] 取保存于斜面培養(yǎng)基上的YBNK-1菌種，接種于30毫升種子培養(yǎng)基中。37°C恒溫 160-200印111培養(yǎng)12小時，以3%接種量卜八）接入裝有601111發(fā)酵培養(yǎng)基的5001111三角瓶 中，160rpm恒溫培養(yǎng)48-54小時。平均酶活達每毫升2000尿激酶單位。
[0054] 實施例5 :納豆激酶在5L發(fā)酵罐中的表達情況
[0055] 取保存于斜面培養(yǎng)基上的YBNK-1菌種，接種于30毫升種子培養(yǎng)基中。37°C恒溫 160-200rpm培養(yǎng)12小時。5L發(fā)酵罐中裝入3L發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌20分鐘，攪拌轉(zhuǎn)速 為300rpm，通氣量為0. 5vvm，發(fā)酵罐溫度降至37°C時，用氨水調(diào)pH為7. 0,然后以3% (v/ v)接種量，將菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵周期為28-32小時，其中攪拌速度隨著發(fā)酵時 間的延長而增大，從初始攪拌速度為300rpm增加到700rpm。所得納豆激酶的平均活性為每 毫升2000尿激酶單位。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于納豆激酶液態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括：大豆蛋白胨，可溶性淀粉， Na2HP04 · 12H20, KH2P04, CaCl2, MgS04 · 7H20〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括：大豆蛋白胨1.0-2. 5%，可溶性 淀粉 2. 0-4 %, Na2HP04 · 12H200. 4-0. 5 %, ΚΗ2Ρ040. 15 -0 . 25 %, CaCl20. 01-0. 03 %, MgS04 · 7Η200· 05-0. 07%。
3. -種納豆激酶液態(tài)發(fā)酵的方法，包括以下步聚：取保存于固體培養(yǎng)基上的菌種，接 種在種子培養(yǎng)基中（pH優(yōu)選為6. 8-7. 2)，恒溫培養(yǎng)（優(yōu)選10-14小時），之后接種到如權(quán)利 要求1或2中的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中接種量為2-10%，優(yōu)選2-4%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的菌種是經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心（CGMCC)保藏，保藏號為7467。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述發(fā)酵是在發(fā)酵罐中進行。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中攪拌速度隨著發(fā)酵時間的延長而增大，優(yōu)選攪拌 速度從300rpm提高到700rpm，更優(yōu)選從320rpm提高到700rpm。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，發(fā)酵罐裝液量為50-70 %，接種量為2-4 %，通氣量 為0. 5-0. 8vvm，培養(yǎng)pH為6. 9-7. 1 (以氨水和乙酸調(diào)節(jié)pH)，溫度為35-37°C，，整個發(fā)酵周 期為28-32小時。
9. 一種枯草芽孢桿菌，該菌株經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)保藏，保藏號為7467。
【文檔編號】C12N9/56GK104152429SQ201310178561
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月15日
【發(fā)明者】戴東升, 王星星, 楊仁佳, 安俊, 鄭慧, 周鵬, 姚振芳, 王斐, 陳婧, 禹玉洪, 任武賢 申請人:亞寶藥業(yè)集團股份有限公司