專利名稱：一種由納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠制備合生素的方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及一種納豆菌與米糠發(fā)酵活性成分組成的合生素制劑的制備方法 及其用途。
背景技術(shù)：
米糠是大米加工的主要副產(chǎn)物，富含優(yōu)質(zhì)蛋白、纖維素、礦物元素、V b族(V B1、 V b2、 Vee)、大量食 物纖維素等營養(yǎng)素及多糖V e、生育三烯酚、Y-谷維醇、28碳垸醇、角鯊烯、神經(jīng)酰胺等生理功能卓越的
活性物質(zhì)，蛋白質(zhì)及氨基酸種類較齊全。米糠中所含脂肪主要為不飽和脂肪酸,必需脂肪酸含量達47 % , 還含70多種抗氧化成分，被世界譽為"天賜營養(yǎng)源"。
納豆是日本的傳統(tǒng)食品，具有千年以上的歷史。納豆芽孢桿菌是納豆的發(fā)酵菌株，生理功能卓越溶 血栓功能抗腫瘤；降血壓；抗菌作用；預(yù)防骨質(zhì)疏松癥；提高蛋白質(zhì)的消化率；抗氧化性調(diào)節(jié)腸功能 等等。
合生素通常是發(fā)酵濃縮益生菌，噴霧干燥或者真空冷凍干燥后加入一定量的益生元和保護劑來制備。 本合生素制劑是采用納豆菌發(fā)酵米糠的上清原液添加保護劑真空冷凍干燥后制成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種保健合生素制劑的制備方法，方法是以抗氧化為指標優(yōu)化納豆芽孢桿菌發(fā)酵
米糠的條件，獲得含較高濃度納豆菌的、具有抗氧化活力的米糠發(fā)酵上清液；以一定配方比例添加保護劑，
冷凍干燥得到合生素粉劑。
實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是
發(fā)酵方法以4% 8% (W/V)米糠為培養(yǎng)基碳源，1%的酵母粉(W/V)為氮源，培養(yǎng)基初始pH5 8， 裝瓶量5~25% (V/V),接種量2 6% (V/V),溫度為27 37'C,培養(yǎng)48 64h， 140 180r/rain時,在此 最佳條件下納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠上清液的羥自由基清除率活性最高,為94.1%;并考察了在此條件下的 納豆芽孢桿菌的濃度為8. 2Xl09個/mL。
根據(jù)上述條件進行了納豆菌與米糠發(fā)酵物組成的合生素的制備添加保護劑的最佳組合為脫脂奶粉 5 15% (W/V),蔗糖3 8% (W/V) , 3-環(huán)狀糊精0 5% (W/V),該最佳復(fù)配保護劑能使納豆芽孢桿 菌在真空冷凍干燥中的存活率達到80%以上，抗氧化活力無損失。
本發(fā)明的優(yōu)點在于本合生素制劑不僅含有可調(diào)整腸道功能的納豆菌，而且所含有的米糠發(fā)酵物具有抗 氧化活力，服用后能起到雙重作用。
具體實施例方式
以米糠為碳源，調(diào)整初始pH， 1%的酵母粉為氮源，接種量4%,振蕩140r/min培養(yǎng)64h。發(fā)酵米糠上清 液以一定比例的脫脂奶粉、蔗糖、0-環(huán)狀糊精進行復(fù)配后真空冷凍干燥制得合生素粉劑。 實例1
5%的米糠(W/V)為碳源，1%的酵母粉(W/V)為氮源，培養(yǎng)基初始pH6.0，裝瓶量10% (V/V),接種 量4% (V/V),發(fā)酵溫度為27'C，培養(yǎng)64h， 140r/min時,在此最佳條件下納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠上清液的 羥自由基清除率為90.3%;在此條件下的納豆芽孢桿菌的濃度為6.61X108個/inL。羥自由基清除率的試 驗方法和計算方法如下所述- OH由EDTANa2— Fe (11)—1 )2體系產(chǎn)生。鑒于 OH可特異地使番紅褪色，因此可根據(jù)褪色程度 用比色法來測量'OH的含量。反應(yīng)體系為在10ml具塞試管中，依次加入1.0邁L pH7.4的磷酸緩沖液， 0. 2mL番紅溶液(520ug/mL), 1. OmL 3. 8mmol/L EDTANa2—Fe (II)溶液，再加入不同濃度的樣品溶液O. lmL， 最后加入0.5mL 0.075%仏02溶液，雙蒸水補足至10mL，混合均勻后于40 'C水浴保溫30min,在519 nm波 長處測吸光度(A)值?？瞻捉M以等體積的重蒸水代替樣品溶液；對照組以等體積的重蒸水代替樣品溶液和 EDTA~"Na2^Fe (II)溶液。實驗結(jié)果以清除率IC表示
IC = (A樣品一A空白)X100%/(A對照一A空白)
衰老動物試驗表明,服用本品后動物體內(nèi)血清和肝臟的過氧化脂質(zhì)丙二醛(MDA)含量分別下降20. 5%、 55.4免，抗氧化酶超氧化物岐化酶(SOD)的活力分別提高1.9倍、2.0倍，抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)的活力分別提高1. 2倍、1. 3倍，體現(xiàn)出較強的抗氧化、抗衰老活性。動物試驗、指標測定及計 算方法見下述。 (1〉亞急性衰老動物模型的建立及試驗分組
按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》，抗氧化功能檢測方法要求采用8 12月齡老年小鼠進行試驗 或通過給予成年小鼠D-半乳糖誘導(dǎo)老化形成進行試驗。本試驗中，采用小鼠每天頸背部皮下注射用無菌生 理鹽水配制的125mg/kg d D-半乳糖，連續(xù)40天，以造成亞急性衰老模型，其衰老程度接近于21月齡水 平。
試驗時，正常對照組和造模組每天頸背部皮下分別注射生理鹽水和D-半乳糖，持續(xù)40天后，于最后一 次注射D-半乳糖及灌胃后lh，取血及肝組織按(2)所述方法制備分析樣品供生化指標分析；供試樣品為 納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠的上清液凍干粉，陽性藥物為維生素E。試驗期間，試驗組和陽性對照組每天按 0.2mL/10g體重分別灌胃供試藥液和陽性藥物；試驗小鼠均自然進食正常飼料，自由飲水。
(2) 小鼠血清及小鼠肝組織的制備 '
試驗結(jié)束后，小鼠摘除眼球取血，37'C下水浴0.5 2h, 3000r/min取上清作為小鼠血清備用； 小鼠處死后，取組織塊(0.2g lg)在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入小 燒杯內(nèi)；用量筒量取預(yù)冷的生理鹽水，總量為組織塊重量的9倍，用帶刻度的滴管取總量2/3的生理鹽水于 燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，然后倒入玻璃勻漿管內(nèi)，再將剩下的l/3生理鹽水用來沖洗殘留在燒 杯中的碎組織塊， 一起倒入勻漿管中進行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手 將搗桿垂直插入套管中上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次(6 8min)，充分研碎，使組織勻漿化，即為小鼠肝組織備用。
(3) 丙二醛的測定
丙二醛(MDA)的量反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映出細胞損傷的程度。丙二醛也可通過蛋白 質(zhì)一級氨基基團反應(yīng)與蛋白質(zhì)交聯(lián)，造成細胞功能的破壞以及死亡。
待測試樣經(jīng)旋渦混勻器混勻后，95'C水浴40min，然后3500 4000r/min離心10min,取上清測試。操 作步驟按MDA試劑盒說明書進行。MDA按下式計算
，w、測定管OD—測定空白^)D 1ft磁^位新 MDA(,l/ni^歸管od—標準空白散DxlOx稀釋倍數(shù)
(4) 超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定
超氧化物歧化酶(SOD)清除超氧陰離子自由基(02— )保護細胞免受損傷。SOD的活性與清除自由基 的能力成正比。
202 +2H+ S0D >壓02+02
SOD測定原理是通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(02—),后者氧化羥胺
形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見分光光度計測其吸光度。當被測樣品中含SOD時， 則對超氧陰離子自由基(Of)有專一性的抑制作用，形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度低于 對照管的吸光度。
待測樣品混勻10分鐘后倒入比色杯中進行測定。蒸餾水調(diào)零，波長550nm處比色。操作步驟按SOD試劑
4盒說明書進行。SOD活力按下式計算
咖活力(nu/mL)=對照管:管=管00+30%><稀釋倍數(shù)C3.8"0加、
(5)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的測定
谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的還原反應(yīng)，保護細胞 膜結(jié)構(gòu)和功能完整，測定此酶促反應(yīng)中還原型谷胱甘肽的消耗，可求出酶的活力。
H2Ch + 2GSH GSH-Px >2H20 + GSSG
由于這兩個底物在沒有酶的條件下，也能進行氧化還原反應(yīng)(稱為非酶促反應(yīng))，所以最后計算該酶
活力時必須扣除非酶促反應(yīng)所引起的GSH減少的部分。
GSH-Px活力的湖!l定操作步驟按GSH-Px試劑盒說明書進行。 鼠血清中GSH-Px活力按下式計算
CSII rxfg力—bg[非酶管OD—空白節(jié)D] -log脾管OD-空白節(jié)D]
3minx0.002mL
鼠肝組織中GSH-Px活力按下式計算
GSH-Px活力-:^^^^^x標準管濃度x稀釋倍數(shù)+反應(yīng)時間+蛋白含量 標準営OD—2白管OD
實例2
6%的米糠(WA)為碳源，1%的酵母粉(ff/V)為氮源，培養(yǎng)基初始pH6.5,裝瓶量15% (V/V),接種 量4% (V/V),發(fā)酵溫度為27'C,培養(yǎng)64h, 140r/min時,在此最佳條件下納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠上清液的 羥自由基清除率為81.8%:在此條件下的納豆芽孢桿菌的濃度為6.17X10'個AnL。衰老動物試驗表明，服 用本品后動物體內(nèi)血清和肝臟的過氧化脂質(zhì)丙二醛(MDA)含量分別下降18.1%、 46.3%,抗氧化酶超氧化物 岐化酶(SOD)的活力分別提高1. 5倍、1. 8倍，抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力分別提高1.0 倍、1. 1倍,體現(xiàn)出較強的抗氧化、抗衰老活性。試驗方法及指標測定同實例1。 實例3
5%的米糠(W/V)為碳源，1%的酵母粉(W/V)為氮源，培養(yǎng)基初始pH7.0,裝瓶量15% (V/V),接種 量4% (V/V)，發(fā)酵溫度為32'C,培養(yǎng)64h，140r/min時，在此最佳條件下納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠上清液的 羥自由基清除率為81.1°/。；在此條件下的納豆芽孢桿菌的濃度為4.17><109個/111。衰老動物試驗表明，服 用本品后動物體內(nèi)血清和肝臟的過氧化脂質(zhì)丙二醛(MDA)含量分別下降17.0%、 40.3%，抗氧化酶超氧化物 岐化酶(S0D)的活力分別提高1.4倍、1.8倍，抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力分別提高l.O 倍、l.O倍，體現(xiàn)出較強的抗氧化、抗衰老活性。試驗方法及指標測定同實例1。 實例4
7%的米糠(W/V)為碳源，1%的酵母粉(W/V)為氮源，培養(yǎng)基初始pH7.0,裝瓶量20% (V/V)，接種 量4% (V/V)，發(fā)酵溫度為32'C,培養(yǎng)64h, 140r/min時,在此最佳條件下納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠上清液的 羥自由基清除率為81.9%;在此條件下的納豆芽抱桿菌的濃度為2.63Xl(f個/mL。衰老動物試驗表明，服 用本品后動物體內(nèi)血清和肝臟的過氧化脂質(zhì)丙二醛(MDA)含量分別下降17.5%、 46.0%,抗氧化酶超氧化物 岐化酶(S0D)的活力分別提高1.5倍、1.9倍，抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力分別提高0. 9 倍、l.O倍，體現(xiàn)出較強的抗氧化、抗衰老活性。試驗方法及指標測定同實例l。 實例5
7%的米糠(W/V)為碳源，1%的酵母粉(W/V)為氮源，培養(yǎng)基初始pH 6.0,裝瓶量15% (V/V)，接 種量4% (V/V)，發(fā)酵溫度為37'C，培養(yǎng)64h,140r/min時，在此最佳條件下納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠上清液 的羥自由基清除率為79.9%;在此條件下的納豆芽孢桿菌的濃度為2.34X108個/mL。衰老動物試驗表明， 服用本品后動物體內(nèi)血清和肝臟的過氧化脂質(zhì)丙二醛(MDA)含量分別下降15.5%、 43.7%,抗氧化酶超氧化 物岐化酶(SOD〉的活力分別提高1. 5倍、1. 7倍，抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力分別提髙 0.7倍、0.9倍,體現(xiàn)出較強的抗氧化、抗衰老活性。試驗方法及指標測定同實例1。 實例6米糠發(fā)酵上清液添加保護劑脫脂奶粉5% (w/v)、蔗糖3% (w/v) 、 e-環(huán)狀糊精5% (W/V)，該復(fù)配
保護劑使納豆芽孢桿菌在真空冷凍干燥中的存活率為44. 6%，抗氧化活力無損失。 實例7
米糠發(fā)酵上清液添加保護劑脫脂奶粉15% (W/V)、蔗糖8% (W/V),該復(fù)配保護劑使納豆芽孢桿菌在
真空冷凍干燥中的存活率為77.4%，抗氧化活力無損失。
實例8
米糠發(fā)酵上清液添加保護劑脫脂奶粉15% (W/V)、蔗糖5% (W/V) 、 0-環(huán)狀糊精5% (W/V)，該復(fù) 配保護劑使納豆芽孢桿菌在真空冷凍干燥中的存活率為80.4 。
權(quán)利要求
1、一種由納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠制備合生素的方法，其特征在于按照下述步驟制得(1)在含有4％～8％的米糠，1％的酵母粉，初始pH為5～8的培養(yǎng)基中，接入以體積計2～6％的納豆芽孢桿菌，裝瓶量以體積計5～25％，發(fā)酵溫度為27～37℃，140～180r/min，培養(yǎng)48～64h制得納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠上清液；(2)取納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠上清液，加入5～15％的脫脂奶粉，3～8％的蔗糖，0～5％的β-環(huán)狀糊精真空冷凍干燥后制得合生素粉劑。
2、 一種如權(quán)利要求1所述的由納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠制備的合生素，其特征在于該合生 素可以用做制備具有抗氧化功能的保健食品或者藥品。
3、 一種如權(quán)利要求1所述的由納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠制備的合生素，其特征在于該合生 素可以用做制備具有抗衰老功能的保健食品或者藥品。
全文摘要
一種納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠制備合生素的方法及用途，涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提出一種保健合生素制劑的制備方法，方法是以抗氧化為指標優(yōu)化納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠的條件，獲得含較高濃度納豆菌的、具有抗氧化活力的米糠發(fā)酵上清液；添加一定比例的脫脂奶粉，蔗糖，β-環(huán)狀糊精作為保護劑，冷凍干燥得到合生素粉劑，該保護劑能使納豆芽孢桿菌在真空冷凍干燥中的存活率達到80％以上，抗氧化活力無損失。該合生素具有抗氧化和延緩衰老的功能，可以制成保健食品或藥品。
文檔編號A23L1/29GK101530205SQ20091003103
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日
發(fā)明者佳 何, 劉玲玲, 周曉坤, 驊 徐, 祁紅兵, 鈞 陳 申請人:江蘇大學(xué)