小麥TaFAD2蛋白及其編碼基因和其在提高植物抗病性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及小麥TaFAD2蛋白及其編碼基因TaFAD2。所述小麥TaFAD2蛋白為：（1）SEQ?ID?NO.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（2）SEQ?ID?No.3所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等功能的由（1）衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了所述TaFAD2蛋白在提高植物抗病性中的應(yīng)用。在小麥中抑制TaFAD2基因的表達(dá)能夠明顯降低小麥對白粉病的抗性，而在擬南芥中過表達(dá)TaFAD2基因可明顯增加轉(zhuǎn)基因擬南芥對白粉病的抗性，本發(fā)明可有效解決植株由于白粉病等真菌病害導(dǎo)致的產(chǎn)量減少等問題。
【專利說明】小麥TaFAD2蛋白及其編碼基因和其在提高植物抗病性中 的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及小麥TaFAD2蛋白及其編碼基因和其在 提高植物抗病性中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)鞘澜绶秶鷥?nèi)最廣泛種植的糧食作物，小麥白粉病是小麥的重要病害之一。 據(jù)報(bào)道，小麥白粉病可造成13%?34%的產(chǎn)量損失。而過多依賴于農(nóng)藥，不僅增加了生產(chǎn)成 本，而且還造成了大面積環(huán)境污染，嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生態(tài)安全。因此，采用生物技術(shù)手段，克 隆高抗小麥白粉病基因并將其應(yīng)用于小麥抗病遺傳育種是控制小麥白粉病流行最經(jīng)濟(jì)、安 全、有效的方法。然而，由于抗病基因和無毒基因的互作表現(xiàn)為品種對小種的專化抗性，植 物抗病性常因病原菌群體生理小種的變化而被克服，有些抗病基因還沒有克隆到，
[0003] 其抗病性就由于病菌群體毒性的變化而喪失。由此可見，利用抗病基因培育抗病 品種也在不斷面臨新的挑戰(zhàn)。人們轉(zhuǎn)而開始篩選廣譜、持久的抗病重要相關(guān)基因并培育具 有持久抗病性的作物品種。
[0004] 油醜憐脂膽喊去飽和酶（l-aeyl-2-〇leoyl-sn-glyeer〇-3-phosphoeholin Λ 12_d esaturase，ECI. 3. 1. 35; FAD2)又稱Λ 12脂肪酸脫氫酶或油酸脫氫酶，是植物體中產(chǎn)生多不 飽和脂肪酸的一個(gè)重要酶，在亞油酸和亞麻酸的合成過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)FAD2酶的活性尤為重 要，參與在脂肪酸碳鏈的第12位碳原子上引入第二個(gè)雙鍵，催化多不飽和脂肪酸生物合成 的第一步反應(yīng)，負(fù)責(zé)除質(zhì)體膜內(nèi)膜膜脂外所有不飽和甘油脂的合成，主要催化油酸（18:1) 轉(zhuǎn)化為亞油酸（18:2)。油脂生物化學(xué)研究認(rèn)為，硬脂酞-ACP脫氫酶決定硬脂酸形成油酸， 而FAD2和FAD6則決定油酸形成亞油酸。FAD2基因是FAD2酶的編碼基因，因此FAD2基 因是控制油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因，直接決定了種子中儲存脂中多不飽和脂肪酸的含 量與比例(袁思瑋，植物激素和非生物脅迫對擬南芥FAD2基因的調(diào)節(jié)機(jī)制研究，碩士論文， 2010)。
[0005] 植物中，F(xiàn)AD可以介導(dǎo)植物防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，在植物對細(xì)菌和真菌病害防御中 發(fā)揮重要作用?；A(chǔ)防御是植物抵御病原侵染產(chǎn)生的初級主動(dòng)防御反應(yīng)。大豆中GmFAD3 的沉默可以增強(qiáng)JA的累積，略微減少18:3脂肪酸水平，從而使植株對扁豆花葉病毒（Bean pod mottle virus, BPMV)更敏感（Singh AK, Silencing genes encoding omega-3fatty acid desaturase alters seed size and accumulation of Bean pod mottle virus in soybean， Mol Plant Microbe Interact，2011，24(4):506_15)〇
[0006] 目前，F(xiàn)AD基因主要是用于研究油類作物，但是對小麥FAD基因的研究很少，并且 對于FAD2基因的抗病功能也并未研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供小麥TaFAD2蛋白及其編碼基因。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供小麥TaFAD2蛋白及其編碼基因在提高植物抗病性中的 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供了小麥TaFAD2蛋白，所述蛋白為：
[0010] (1) SEQ ID N0. 3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0011] (2)SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有 同等功能的由（1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述小麥TaFAD2蛋白的編碼基因 TaFAD2,優(yōu)選地，所述基因的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] 應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。
[0014] 所述小麥TaFAD2基因包含1164bp的開放閱讀框架(核苷酸序列如SEQ ID N0. 2 所示)，TaFAD2蛋白含有387個(gè)氨基酸。
[0015] 本發(fā)明還提供了含有所述TaFAD2基因的載體。
[0016] 優(yōu)選地，所述載體為 pEASY-Tl Simple-TaFAD2。
[0017] 本發(fā)明還提供了含有所述TaFAD2基因的重組表達(dá)載體。
[0018] 優(yōu)選地，所述含有TaFAD2基因的重組表達(dá)載體為pCAM2300-35S-0cs- TaFAD2。
[0019] 所述載體pCAM2300-35S-0cs-TaFAD2的構(gòu)建過程如下：
[0020] (1)以中國春小麥（Triticum aestivum L.)小麥葉片為材料，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄 獲得cDNA，以cDNA為模板，以TaFAD2-F和TaFAD2-R為引物，進(jìn)行PCR ;
[0021] TaFAD2-F ：TCGTCCCGTCAACAAGAGG (SEQ ID NO. 5)；
[0022] TaFAD2-R ：TCAGTTATTCCGCCATAAACA (SEQ ID NO. 6)；
[0023] 將PCR產(chǎn)物克隆連接到pEASY-TlSimple載體上，獲得pEASY-Tl Simple- TaFAD2 ;
[0024] (2)用 Kpnl 和 Spel 酶切 pEASY-TlSimple-TaFAD2,得到 TaFAD2 片段，用 Kpnl 和 Spel酶切表達(dá)載體pCAM2300-35S-0cS，得到載體片段，將酶切得到的兩個(gè)片段連接，獲得 重組表達(dá)載體 pCAM2300-35S-0cs-TaFAD2。
[0025] 其中，步驟（1)中PCR程序：95 °C預(yù)變性5分鐘；95 °C變性30秒，56 °C退火30秒， 72 °C延伸2分鐘，重復(fù)35次；72 °C延伸10分鐘；
[0026] PCR 體系：
[0027] 2 X Easy Taq PCR SuperMix 12. 5 μ 1 ；
[0028] TaFAD2_F (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0029] TaFAD2_R (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0030] cDNA 模板 2 μ 1 ;
[0031] 雙蒸水 補(bǔ)足25 μ 1。
[0032] 本發(fā)明還提供了含有所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包括重組菌， 如大腸桿菌、農(nóng)桿菌等，也包括植物細(xì)胞。
[0033] 本發(fā)明還提供了小麥TaFAD2蛋白在提高植物抗病性中的應(yīng)用。
[0034] 所述應(yīng)用為將小麥TaFAD2基因或含有小麥TaFAD2基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物 中過表達(dá)小麥TaFAD2蛋白，使植物產(chǎn)生抗病性。
[0035] 優(yōu)選地，所述的抗病為抗白粉病。
[0036] 優(yōu)選地，所述植物為小麥和擬南芥。
[0037] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用為通過過表達(dá)小麥TaFAD2基因，調(diào)節(jié)SA，JA路徑相關(guān)基因的表 達(dá)變化，從而使植株產(chǎn)生抗病性。小麥TaFAD2基因通過正向調(diào)控JA路徑，負(fù)向調(diào)節(jié)SA路 徑來參與調(diào)控對白粉病的抗性。
[0038] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0039] 本發(fā)明可用于解決植株由于白粉病等真菌性病害導(dǎo)致的產(chǎn)量減少等問題，對抗白 粉病植物的培育和育種具有較大的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1和實(shí)施例2小麥TaFAD2基因的克隆中間載體PEASY-T1 Simple的圖譜；
[0041] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中小麥TaFAD2蛋白和基因?qū)φ請D；
[0042] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中小麥TaFAD2與多序列的一致性比對結(jié)果；其中，0sFAD2 為水稻0sFAD2蛋白的氨基酸序列；AtFAD2為擬南芥AtFAD2蛋白的氨基酸序列；TaFAD2為 小麥TaFAD2蛋白的氨基酸序列；
[0043] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中mRNA相對表達(dá)量檢測結(jié)果；其中，1、2、3為平行重復(fù)實(shí) 驗(yàn)；
[0044] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中不同植株的抗病性表型觀察；
[0045] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中顯微觀察VIGS植株的葉片接種白粉菌5天后次生菌絲 的生長情況；
[0046] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例4中植物表達(dá)載體pCAM2300-35S-0cs的圖譜；
[0047] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例5中過表達(dá)擬南芥植株與野生型擬南芥植株對白粉病的抗 性；
[0048] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例6中過表達(dá)擬南芥植株的RT-PCR陽性鑒定。

【具體實(shí)施方式】
[0049] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0050] 若未特別指明，本發(fā)明所用的各試劑和實(shí)驗(yàn)材料均可市售獲得，實(shí)施例中所用的 技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0051] 本發(fā)明中涉及到的生物材料中國春小麥（Triticum aestivum L.)、硬 粒小麥 DR147 (Triticum durum)、二倍體粗山羊草（Aegilops taushii)Ae39、 小麥Am6、北京837均為公知公用品種，（各品種可參見Szyroki等，ΚΑΤΙ is not essential for stomatal opening，2001，Proceedings of the National Academy of Sciences，USA，98,2917-2921 ;Zhou等，Development of wheat near-isogenic lines for powdery mildew resistance, 2005, Theoretical and Applied Genetics，110,640-648)
[0052] 2 X Easy Taq PCR SuperMix、pEASY-Tl Simple Cloning Kit 均購自北京全式金 生物技術(shù)有限公司。
[0053] 白粉菌E09為公知公用品種（參見Li等，Comparative analysis of early H202 accumulation in compatible and incompatible wheat - powdery mildew interactions, 2005，Plant Pathology, 54, 308-316)。
[0054] BSMV:HSP90 載體為公知公用載體(參見 Wang 等，Molecular analysis of common wheat genes encoding three types of cytosolic heat shock protein 90(Hsp90):functional involvement of cytosolic Hsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance, 2011，New Phytol, 191，418-431)。
[0055] GKP緩沖液的配制方法為：50mM甘氨酸、30mM磷酸氫二鉀、1%皂土、1%硅藻土， ρΗ9· 2。
[0056] 實(shí)施例1小麥TaFAD2基因全長的克隆及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析
[0057] 以中國春小麥（Triticum aestivum L.)小麥葉片為材料，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，以cDNA為模板，以TaFAD2-F和TaFAD2-R為引物，利用PCR方法獲得小麥TaFAD2基 因序列全長。
[0058] TaFAD2基因全長的引物序列：
[0059] TaFAD2-F ：TCGTCCCGTCAACAAGAGG (SEQ ID NO. 5)
[0060] TaFAD2-R ：TCAGTTATTCCGCCATAAACA (SEQ ID NO. 6)
[0061] PCR程序：95 °C預(yù)變性5分鐘；95 °C變性30秒，56°C退火30秒，72 °C延伸2分鐘， 重復(fù)35次；72 °C延伸10分鐘。
[0062] PCR 體系：
[0063] 2 X Easy Taq PCR SuperMix 12. 5 μ 1 ；
[0064] TaFAD2_F (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0065] TaFAD2_R (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0066] cDNA 模板 2 μ 1 ;
[0067] 雙蒸水 補(bǔ)足25 μ 1。
[0068] PCR產(chǎn)物切膠回收純化后按照pEASY-Tl Simple Cloning Kit克隆方法克隆連 接到pEASY-Tl Simple載體上（pEASY-Tl Simple的圖譜如圖1所示)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5a，并在其中擴(kuò)繁，陽性克隆經(jīng)過測序篩選獲得PEASY-T1 Simple- TaFAD2,其中， TaFAD2全長為1790bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；由其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸 序列如SEQ ID N0. 3所示。TaFAD2包含1164bp的開放閱讀框架（SEQ ID N0. 2)，由此推測 TaFAD2蛋白含有387個(gè)氨基酸殘基(小麥TaFAD2蛋白和基因?qū)φ請D如圖2所示)。根據(jù)軟 件預(yù)測，該蛋白的分子量為44435. 35道爾頓，等電點(diǎn)為8. 29。將TaFAD2蛋白的氨基酸序列 與GenBank中所有氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示TaFAD2蛋白與單子葉植物水稻中該基因 的直系同源基因 （NCBI Reference Sequence:NP_001047927. 1)的相似性較高，為88%，同雙 子葉植物擬南芥中該基因的直系同源基因（GenBank:AAM61113. 1)的相似性為67%，多序列 一致性比對結(jié)果如圖3所示。
[0069] 實(shí)施例2小麥TaFAD2基因的VIGS載體及VIGS植株
[0070] 以實(shí)施例1獲得的cDNA為模板，以正向引物F和反向引物R為引導(dǎo)進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR程序：95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，重復(fù)30次； 72 °C延伸10分鐘。
[0071] 正向引物 F :CTAGCTAGC GGGGTCTTCTGGTACAGC (SEQ ID NO. 7);下劃線為限制 性酶切位點(diǎn)。
[0072] 反向引物 R :CTA GCTAGC GACACGCTACTCTTTCCTTT (SEQID NO. 8);下劃線為限 制性酶切位點(diǎn)。
[0073] PCR 體系：
[0074] 2XEasy Taq PCR SuperMixl2. 5μ 1 ；
[0075] 正向引物 F (10 μ Μ) 1 μ 1 ;
[0076] 反向引物 R (10 μ Μ) 1 μ 1 ;
[0077] cDNA 模板 2 μ 1 ;
[0078] 雙蒸水 補(bǔ)足25 μ 1。
[0079] PCR產(chǎn)物切膠回收純化后按照北京全式金生物技術(shù)有限公司提供的pEASY-Tl Simple Cloning Kit克隆方法克隆連接到pEASY-TlSimple載體上（圖譜如圖1所示)，連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，并在其中擴(kuò)繁，陽性克隆經(jīng)過測序篩選獲得TaFAD2的cDNA片 段，該片段序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0080] 大麥條紋花葉病毒（BSMV)載體由BSMV- a，BSMV- β，BSMV- γ三個(gè)組分構(gòu) 成（參見 Holzberg 等，Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant[J]· The Plant Journal, 2002, 30(3) :315-327.)。將本實(shí)施例中測序正確 的pEASY-Tl Simple載體和BSMV- γ載體用NEB公司的Nhel酶切，回收酶切的231bp的 TaFAD2基因片段（SEQ ID NO. 4)和BSMV-γ載體片段，用T4 DNA連接酶（NEB公司）連接， 將TaFAD2的基因片段反向連接到BSMV-γ載體多克隆位點(diǎn)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5ci感受態(tài)中，菌液PCR篩選陽性克隆并測序驗(yàn)證，獲得序列正確的載體質(zhì)粒即為重組 載體 BSMV-γ :TaFAD2。
[0081] 綠色突光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP)來源于海洋生物水母，其基因 可在異源組織中表達(dá)并產(chǎn)生熒光，GFP cDNA開放閱讀框架長度約714bp，編碼238個(gè)氨基酸 殘基，其肽鏈內(nèi)部第65-67位絲氨酸一脫氫酪氨酸一甘氨酸通過自身環(huán)化和氧化形成一個(gè) 發(fā)色基因，在長紫外波長或藍(lán)光照射下發(fā)出綠色熒光。綠色熒光蛋白是常用的報(bào)告基因之 一。本研究中之所以選用綠色熒光蛋白作為對照，是因?yàn)樵摶蛟谥参矬w內(nèi)沒有任何同源 基因，因此攜帶GFP的BSMV載體不會(huì)沉默植物中的任何基因，可以作為基因下調(diào)表達(dá)的對 照。
[0082] 在病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus induced gene silencing, VIGS)實(shí)驗(yàn)中， BSMV:GFP 用來作為陰性對照（參見 Li 等，Transcriptome Analysis of H202 -Treated Wheat Seedlings Reveals a H202-Responsive Fatty Acid Desaturase Gene Participating in Powdery Mildew Resistance, 2011, PLoS One, 6, 1-16;Cao等，Serine/ threonine kinase gene Stpk-V, a key member of powdery mildew resistance gene Pm21, confers powdery mildew resistance in wheat, 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences,USA, 108, 7727-7732)。該載體構(gòu)建過程與 BSMV- γ :TaFAD2載體相同，測序篩選得到正確的載體質(zhì)粒即為BSMVi :GFP重組載體。
[0083] VIGS植株獲得的方法步驟：
[0084] 1)獲得 BSMV-α，BSMV-β，BSMV-γ :TaFAD2 和 BSMV-γ :GFP 質(zhì)粒，BSMV-α， BSMV-γ :TaFAD2 和 BSMV-γ :GFP 用 Mlul 酶切，BSMV-β 用 Spel 酶切，37°C，8h。線性化處 理，50 μ 1NEB酶切體系如下：
[0085] Mlul ：
[0086] 10 XNEB 緩沖液：5 μ 1
[0087] 質(zhì)粒： 彡 2 μ g
[0088] Mlul ： 1 μ 1
[0089] 加滅菌雙蒸水至50 μ 1
[0090] Spel ：
[0091] 10XNEB 緩沖液：5μ1
[0092] 質(zhì)粒： 彡 2 μ g
[0093] 100XBSA ： 0. 5 μ 1
[0094] Mlul ： 1 μ 1
[0095] 加滅菌雙蒸水至50 μ 1
[0096] 2)乙醇沉淀
[0097] 分別取150 μ 1 1)中四種線性化好的質(zhì)粒，分別加350 μ 1DEPC (Diethyl pyrocarbonate)H20,加500μ 1酚氯仿(苯酚和氯仿體積比為1:1),12000 rpm離心30min。 取上清450μ1，加45μ1 NaAc (PH 5. 2,3M)，加 lml冷（4°C)無水乙醇，混勻。-20°C過夜。 12000rpm離心30 min,倒掉上清，lml 70%乙醇重復(fù)洗兩次，瞭干，分別加30ylDEPC H20溶 解。濃度應(yīng)> 400ng/yl。
[0098] 3)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒使用北京GBI公司提供的AmpliCap-Max?T7and T3High Yield Message Maker Kits (Epicentre, USA),分別以2)中得到的四種經(jīng)過乙醇沉淀處理的質(zhì)粒 為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到BSMV-α、BSMV-P、BSMV-γ :TaFAD2、BSMV-γ :GFP的轉(zhuǎn)錄物。
[0099] 10 μ 1反應(yīng)體系：
[0100] 模板： 3μ1
[0101] 10χ轉(zhuǎn)錄緩沖液： Ιμ?
[0102] Cap/NTP 預(yù)混液： 4μ1
[0103] 100mM 二硫蘇糖醇：1 μ 1
[0104] Τ7 酶： Ιμ?
[0105] 42°C，3h，4°C，保溫。
[0106] 4)病毒接種
[0107] BSMV-α、BSMV-3、BSMV-Y :TaFAD2(或 BSMV-γ :GFP)轉(zhuǎn)錄物各取 10μ 1 混合，共 30μ 1，加3倍體積（90μ 1)的DEPC Η20,總體積達(dá)到120μ 1，再加一倍體積（120μ 1)的GKP buffer，制得240 μ lTaFAD2的接種病毒混合液和240 μ 1GFP的接種病毒混合液。
[0108] 用于病毒侵染的小麥材料選用抗白粉病近等基因系PmAm6/北京837*BC5F 3 (PmAm6/北京837*BC5F3制備方法：以四倍體硬粒小麥（Triticum durum) DR147為母本，以 二倍體粗山羊草（Aegilops taushii)Ae39為父本，人工合成六倍體小麥Am6。以Am6為供 體親本，以北京837為輪回親本，從雜交Fi中篩選抗白粉病單株，與北京837回交，從每次 回交后代中篩選抗病單株。從回交5代的F 3家系中篩選純合抗病單株，即為PmAm6/北京 837*BC5F3)。待小麥幼苗第二片葉展平時(shí)（14d)，開始接種。戴剛開封橡膠手套，用處理過的 無 RNA酶的槍頭取5-10 μ lTaFAD2或GFP的接種病毒混合液接種液到食指肚上，一手固定 住小麥幼苗基部，另一手用大拇指和食指輕輕來回摩擦小麥第二片葉。
[0109] 接種完后，向小麥幼苗噴施DEPC H20,保鮮膜覆蓋，保濕24h (高濕有利于病毒侵 入)，之后揭開。溫度在20-32°C之間均可(溫度升高不利于病毒侵入，且葉片長的很快)。
[0110] 6-8天后，第三片葉產(chǎn)生病毒斑，即為病毒接種成功，得到BSMV:TaFAD2和 BSMV:GFP 的 VIGS 植株。
[0111] 實(shí)施例3VIGS實(shí)驗(yàn)證明TaFAD2基因參與白粉病抗性反應(yīng)
[0112] 1) TaFAD2的VIGS植株中TaFAD2的表達(dá)檢測
[0113] 從實(shí)施例2中獲得的BSMV:TaFAD2和BSMV:GFP的VIGS植株經(jīng)熒光實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)檢測TaFAD2的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，在TaFAD2的VIGS植株中檢測TaFAD2的 表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)TaFAD2基因的確下調(diào)。為了避免意外將其他基因沉默（off target)，所以 同時(shí)檢測了小麥中與TaFAD2相似性最高的TaFAD6基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示TaFAD6表達(dá) 不變，說明該VIGS植株沒有把TaFAD2以外的家族其他成員基因沉默，以下進(jìn)行的表型及功 能研究均為TaFAD2基因的下調(diào)產(chǎn)生的。
[0114] 2) BSMV:TaFAD2的VIGS植株的表型觀察
[0115] 實(shí)施例2中獲得的BSMV:TaFAD2和BSMV:GFP的VIGS植株在培養(yǎng)箱一起培養(yǎng)至第 四葉展平，將有病毒發(fā)病表型的植株葉片剪下，放在苯并咪唑培養(yǎng)基上接種白粉菌E09培 養(yǎng)一周（下文分別稱為BSMV:TaFAD2和BSMV:GFP)。同時(shí)，將正常的北京837 (Bj)同樣接 種白粉菌E09 (下文稱Bj)、正常的PmAm6/北京837*BC5F3 (以下簡稱PmA)對照（Mock)接 種GKP緩沖液(下文稱Mock)，BSMV:HSP90的VIGS植株（BSMV:HSP90VIGS植株的獲得方法 同 BSMV: TaFAD2 和 BSMV: GFP )接種白粉菌 E09 (下文稱 BSMV: HSP90 )。
[0116] BSMV:HSP90 載體為公知公用載體(參見 Wang 等，Molecular analysis of common wheat genes encoding three types of cytosolic heat shock protein90(Hsp90):functional involvement of cytosolic Hsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance, 2011，New Phytol, 191，418-431)。
[0117] 上述不同植株的抗病性表型觀察如圖5所示，北京837 (Bj)為感病對照，葉片表 面均勻長滿了白粉菌孢子，表明白粉菌的接種沒有問題;Mock接種GKP緩沖液，葉片表面干 凈，沒有一個(gè)孢子堆，排除摩擦損傷葉片產(chǎn)生的影響；BSMV:GFP為帶有水母的綠色熒光蛋 白（GFP)基因的病毒，GFP基因在植物體內(nèi)沒有任何同源基因，因此BSMV:GFP載體不會(huì)沉默 植物中的任何基因，可以作為基因下調(diào)表達(dá)的對照。該葉片表面有白色條紋狀的病斑，說明 病毒侵染成功，葉片表面干凈，沒有生長白粉菌孢子堆，說明BSMV病毒不會(huì)影響植株的抗 病性；BSMV:HSP90在VIGS實(shí)驗(yàn)中常常作為病毒體系正常工作的陽性對照，因?yàn)镠SP90是病 原菌入侵時(shí)，植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)（hypersensitive reaction,HR)所必需的。BSMV:TaFAD2為 帶有目標(biāo)基因片段TaFAD2的載體，該葉片表面長有肉眼可見的白色孢子堆，同BSMV:HSP90 載體的表型一致，證明小麥TaFAD2基因參與白粉病抗性反應(yīng)。
[0118] 3) BSMV:TaFAD2的VIGS植株的顯微觀察
[0119] 顯微觀察材料的步驟：
[0120] (1)脫色
[0121] 脫色液的配置：1. 5g/L三氯乙酸醇溶液(溶于無水乙醇):三氯甲烷=4:1(體積比)。 將待觀察的葉片侵泡在脫色液中48h，24h換一次脫色液(如脫色不完全可以適當(dāng)延長脫色 時(shí)間）。
[0122] (2)染色
[0123] 染色液的配置：lg/L苯胺藍(lán)水溶液(溶于水)。染色時(shí)，將葉片從脫色液中取出，先 在雙蒸水中清洗3s，然后放入染色液中染色10s，再將葉片在干凈的水中快速清洗，去掉表 面多余的染色液，最后放入50%的甘油中保存(保持滲透壓，防止細(xì)胞因吸水漲破)。
[0124] 將VIGS植株的第四片葉離體接種白粉菌，在離體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后，VIGS植株 的葉片接種白粉菌5天后次生菌絲的生長情況的顯微觀察結(jié)果如圖6所示，BSMV:GFP的 VIGS植株的葉片中只有處于附著孢芽管狀態(tài)的孢子，沒有長出次生菌絲，該圖為物鏡放大 40倍觀察結(jié)果；BSMV:TaFAD2的VIGS植株同BSMV:HSP90觀察結(jié)果一致，部分孢子有次生菌 絲長出，生長狀態(tài)同感病的北京837 -致，其余孢子生長狀態(tài)同BSMV:GFP -樣，沒有長出次 生菌絲。
[0125] 這兩張圖片為物鏡放大20倍數(shù)觀察結(jié)果。
[0126] (3)次生菌絲的統(tǒng)計(jì)
[0127] 在顯微鏡下，統(tǒng)計(jì)每片葉上接上的總白粉菌孢子數(shù)及有次生菌絲長出的孢子數(shù)。 計(jì)算百分比，即為白粉菌侵染率。每次統(tǒng)計(jì)三片葉，共進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。對接菌孢子數(shù) 和長出次生菌絲的孢子數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，從而計(jì)算出白粉菌的侵染概率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示， 感病材料北京837 (Bj)的白粉侵染率為47. 83%，TaFAD2和HSP90VIGS植株的白粉侵染率 分別為28. 06%和27. 12%，VIGS材料的白粉侵染率是感病材料的一半左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不同于Mock 和BSMV:GFP(白粉侵染率為0)，所以統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：TaFAD2與HSP90基因同樣，參與白粉病 抗性反應(yīng)。
[0128] 表1各植株的白粉菌的侵染概率
[0129]

【權(quán)利要求】
1. 小麥TaFAD2蛋白，其特征在于，所述蛋白為： (1) SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (2) SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等 功能的由（1)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因 TaFAD2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的TaFAD2基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述TaFAD2基因的重組表達(dá)載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為 pCAM2300-35S-0cs-TaFAD2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，所述載體pCAM2300-35S-0cs-TaFAD2的構(gòu) 建過程如下： (1) 以中國春小麥葉片為材料，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，以 TaFAD2-F 和 TaFAD2-R 為引物，進(jìn)行 PCR ; TaFAD2-F ：TCGTCCCGTCAACAAGAGG ； TaFAD2-R ：TCAGTTATTCCGCCATAAACA ； 將 PCR 產(chǎn)物克隆連接到 pEASY-TlSimple 載體上，獲得 pEASY-TlSimple-TaFAD2 ; (2) 用 ΚρηΙ 和 Spel 酶切 pEASY-TlSimple-TaFAD2,得到 TaFAD2 片段；用 ΚρηΙ 和 Spel 酶切表達(dá)載體pCAM2300-35S-0cs，得到載體片段，將酶切得到的兩個(gè)片段連接，獲得重組表 達(dá)載體 pCAM2300-35S-0cs-TaFAD2。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，步驟（1沖PCR程序：95°C預(yù)變性5分鐘； 95°C變性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，重復(fù)35次；72°C延伸10分鐘； PCR體系： 2X Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μ 1 ； TaFAD2-F (10 μ Μ) 1 μ 1 ； TaFAD2-R (10 μ Μ) 1 μ 1 ； cDNA 模板 2 μ 1 ; 雙蒸水 補(bǔ)足25 μ 1。
8. 含有權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求1所述TaFAD2蛋白在提高植物抗病性中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為將權(quán)利要 求2或3所述TaFAD2基因或權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物中過表達(dá) TaFAD2蛋白，使植物產(chǎn)生抗病性。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗病為抗白粉病。
【文檔編號】C12N9/02GK104152420SQ201310177666
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月14日
【發(fā)明者】毛龍, 李愛麗, 武亮, 耿帥鋒 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所