專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于降解菌劑的制備領(lǐng)域，特別涉及一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著新型環(huán)境分析工具的快速發(fā)展和應(yīng)用，以及人們環(huán)境意識(shí)的不斷增強(qiáng)，世界各國(guó)的環(huán)境工作者對(duì)環(huán)境污染和人類(lèi)健康領(lǐng)域中的關(guān)注焦點(diǎn)已逐漸從傳統(tǒng)典型的污染物延伸到環(huán)境中存在的新興痕量污染物，如抗生素藥物等。近年來(lái)，在污水、地表水、地下水，甚至是飲用水中都檢測(cè)出不同濃度水平的抗生素藥物。有研究表明，長(zhǎng)期暴露在環(huán)境濃度水平的抗生素藥物環(huán)境下會(huì)對(duì)生物造成慢性毒性、內(nèi)分泌干擾、抗藥性演變等嚴(yán)重危害。紅霉素(分子結(jié)構(gòu)式如圖1)是一種大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)抗生素藥物，被廣泛地應(yīng)用于人體呼吸道感染等疾病的治療。通常情況下，紅霉素藥物進(jìn)入人體后只能被部分分別代謝吸收，未被吸收的母體及其代謝產(chǎn)物大部分被排入城市污水處理廠進(jìn)行處理，但是現(xiàn)有的污水處理工藝對(duì)其只能部分降解去除，從而導(dǎo)致仍有相當(dāng)數(shù)量的紅霉素藥物進(jìn)入水源水中。目前，我國(guó)頒布執(zhí)行的生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB5749-2006)并未規(guī)定需對(duì)相關(guān)抗生素藥物進(jìn)行檢測(cè)和控制。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署于2009年首次將紅霉素藥物列為飲用水標(biāo)準(zhǔn)需要優(yōu)先檢測(cè)和控制的候選污染物之一?，F(xiàn)階段，對(duì)水中存在的微量紅霉素藥物的處理方法主要有二氧化氯氧化法、膜過(guò)濾法、砂濾-臭氧氧化法、生物降解法等。盡管如此，化學(xué)氧化法和高級(jí)氧化法雖然可以部分甚至完全氧化降解紅霉素藥物，但往往達(dá)不到礦化的效果，所產(chǎn)生的氧化副產(chǎn)物對(duì)生物體產(chǎn)生的毒性可能更強(qiáng)。膜過(guò)濾法雖然可以較為高效的去除水中的紅霉素藥物，但存在能耗大，投資高的缺點(diǎn)，此外所產(chǎn)生的濃縮液的處理仍然是一個(gè)問(wèn)題。生物降解法是一種價(jià)格低廉而有效的處理方法，但傳統(tǒng)的污水處理工藝對(duì)紅霉素處理效果往往差強(qiáng)人意。研究表明，紅霉素藥物去除與 降解微生物的菌種密切相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法，該方法簡(jiǎn)單易行、安全性高、成本低；所得的紅霉素降解菌劑使用方便，能夠高效降解抗生素藥物紅霉素，而且菌株易于滅活，能夠應(yīng)用于水處理中紅霉素的有效去除。本發(fā)明中的一種用于增強(qiáng)去除污水和水源水中紅霉素能力的高效降解菌株，是一種革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌株，經(jīng)鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida),主要生物學(xué)特性為G_，菌體呈短桿狀，菌落呈圓形，顏色為乳白色，不透明，邊緣整齊，表面光滑，微凸，菌體大小為0.4 0.6 ii mX 1.0 1.5 ii m。葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、朽1檬酸鹽試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)呈陰性；淀粉水解試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性；該菌株16S rDNA的長(zhǎng)度為1388bp，基因序列在GenBank中的登錄號(hào)為JN226401。
本發(fā)明的一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法，包括:(I)將活性污泥按7%_15%的接種量接入培養(yǎng)基中，以梯度壓力式馴化法進(jìn)行馴化，紅霉素投加濃度為10 100mg/L，馴化后，靜置，取上層水樣，經(jīng)梯度稀釋后采用涂布分離法和平板劃線(xiàn)法分離，然后接種于富集培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25-35°C，培養(yǎng)時(shí)間為48-72h，純化，將分離出的菌種接種到牛肉膏和蛋白胨培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；(2)將上述培養(yǎng)好的菌種按1%_3%的接種量接入無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得抗生素藥物紅霉素降解菌劑，其中培養(yǎng)過(guò)程，攪拌速度為140 180r/min，培養(yǎng)溫度為25_35°C，培養(yǎng)時(shí)間為48 72h，紅霉素濃度為20-50mg/L。所述步驟(I)中培養(yǎng)基配方為:K2HP044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg，MgSO40.2g，MnSO40.05g, FeSO4 7H200.0lg, CaCl2 2H200.03g，蒸餾水 IOOOmL, pH=6.8 7.0。所述步驟(I)中馴化條件為:攪拌速度140 180r/min，培養(yǎng)溫度為25 35°C，馴化時(shí)間為2 3個(gè)月。所述步驟(I)中富集培養(yǎng)基的配方為:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，瓊脂糖17g，蒸餾水 IOOOmL, pH=7.1 7.3。所述步驟(I)中牛肉膏和蛋白胨培養(yǎng)基為:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，蒸餾水IOOOmL, pH=7.2 7.5。所述步驟(I)中紅霉素梯度投加濃度依次為10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L。所述步驟(2)中無(wú)機(jī) 培養(yǎng)基為K2HP044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg, MgSO40.2g，MnSO40.05g, FeSO4 *7H200.0lgjCaCl2 *2H200.03g，蒸餾水 IOOOmL, pH6.8 7.0，紅霉素 20 50mg/Lo所述步驟(2)所得的降解菌劑可應(yīng)用于污水處理和水源水處理領(lǐng)域。本發(fā)明借助于生物強(qiáng)化技術(shù)的思想，從城市污水處理廠二次沉淀池的活性污泥中經(jīng)馴化、富集、分離、純化后，得到一株對(duì)抗生素藥物紅霉素具有高效降解作用的菌株。該菌株來(lái)源于污水處理系統(tǒng)，能夠適應(yīng)復(fù)雜的實(shí)際水質(zhì)條件以加速處理系統(tǒng)啟動(dòng)，而且可以提高水處理系統(tǒng)承受水力和有機(jī)負(fù)荷能力，優(yōu)化處理系統(tǒng)內(nèi)降解菌群落結(jié)構(gòu)，在含紅霉素污水和水源水生物處理系統(tǒng)中具有非常廣闊的應(yīng)用前景。有益.效果(I)本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單易行、安全性高、成本低；所得的紅霉素降解菌劑使用方便，能夠高效降解抗生素藥物紅霉素，而且菌株易于滅活，保證其使用的生態(tài)安全性，能夠應(yīng)用于水處理中紅霉素的有效去除；本發(fā)明對(duì)于污水和水源水中微量抗生素藥物的高效生物降解去除具有重要的借鑒意義和使用價(jià)值；(2)水源水預(yù)處理工藝中試裝置(曝氣生物濾池)試驗(yàn)結(jié)果表明，使用本發(fā)明所得的降解菌劑不僅可以加快處理系統(tǒng)的成功啟動(dòng)，而且顯著提高對(duì)水源水中紅霉素藥物的去除效率。


圖1為紅霉素的分子結(jié)構(gòu)式；
圖2為紅霉素高效降解菌劑的電鏡掃描圖；圖3為曝氣生物濾池實(shí)驗(yàn)裝置圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例11.菌株的分離和鑒定(I)將活性污泥按10%的接種量接入培養(yǎng)基中，以梯度壓力式馴化法進(jìn)行馴化，紅霉素投加濃度依次為10、20、40、60、80、100mg/L，在培養(yǎng)溫度為30 °C和攪拌速度為160r/min條件下，250mL錐形瓶中裝填量IOOmL進(jìn)行馴化培養(yǎng)，總馴化時(shí)間約為3個(gè)月。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為:K2HP044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg, MgSO40.2g，MnSO40.05g,FeSO4.7H200.0lg, CaCl2.2H200.03g,蒸餾水 IOOOmL, pH=6.8 7.0。(2)取ImL上述馴化后的培養(yǎng)液，使用滅菌的生理鹽水作KT1 10_6梯度稀釋?zhuān)猛坎及艟鶆蛲坎荚诠腆w培養(yǎng)基上，然后將培養(yǎng)基置于30°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑取形態(tài)清晰的單一菌落，并進(jìn)行編號(hào)，然后反復(fù)純化。將分離出的菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，于4°C冰箱中保存，每隔3個(gè)月移植培養(yǎng)一次，待后續(xù)進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。其中富集培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，瓊脂糖17g，蒸餾水IOOOmL, pH=7.2。(3)分別挑取經(jīng)分離純化后的單一菌落以2%的接種量于各自的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，向無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中投加紅霉素藥物，投加濃度分別為20mg/L和50mg/L。在培養(yǎng)溫度為30°C和攪拌速度為160r/min條件下，250mL錐形瓶中裝填量IOOmL的條件下避光振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為5d。培養(yǎng)后測(cè)定溶液中紅霉素藥物的剩余濃度，選取并確定對(duì)紅霉素藥物降解效率最高的菌株Ery-E ；所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為:Κ2ΗΡ044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg, MgSO40.2g，MnSO40.05g, FeSO4 *7H200.0lgjCaCl2 *2H200.03g，蒸餾水 IOOOmL, pH6.8 7.0，紅霉素 20 50mg/Lo(4)經(jīng)生理生化鑒定和16S rDNA序列分析和同源性比較，菌株Ery-E被初步鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida),主要生物學(xué)特性為G 菌體呈短桿狀,菌落呈圓形，顏色為乳白色，不透明，邊緣整齊、表面光滑、微凸，菌株大小為0.4 0.6 μ mX 1.0
1.5 μ m。葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)呈陰性；淀粉水解試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性。該菌株16SrDNA的長(zhǎng)度為1388bp，在GenBank中的登錄號(hào)為JN226401。2.實(shí)驗(yàn)室錐形瓶紅霉素藥物的降解試驗(yàn)本發(fā)明所提供的紅霉素高效降解菌劑在pH為7.0 7.5，培養(yǎng)溫度為30°C，振蕩速率為160r/min，250mL錐形瓶中裝填量IOOmL的條件下，菌株接種量為2%，紅霉素初始濃度為30mg/L，培養(yǎng)5d后，可得紅霉素藥 物的降解效率達(dá)76%以上。3.水源水預(yù)處理工藝中試裝置(曝氣生物濾池)的生物強(qiáng)化試驗(yàn)
將本發(fā)明提供的紅霉素高效降解菌劑按3%的比例，在進(jìn)水溫度為15 20°C，pH為6.5 7.8條件下，維持氣水比約為4:1，水力停留時(shí)間為4h，紅霉素藥物投加濃度為50y g/L，結(jié)果表明，投加了降解菌劑的曝氣生物濾池中紅霉素藥物的平均去除率為61% 70%，而沒(méi)有投加降解菌劑的曝 氣生物濾池中紅霉素藥物的平均去除率為27% 29%。
權(quán)利要求
1.一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法，包括: (1)將活性污泥按7%-15%的接種量接入培養(yǎng)基中，以梯度壓力式馴化法進(jìn)行馴化，紅霉素投加濃度為10 100mg/L，馴化后，靜置，取上層水樣，經(jīng)梯度稀釋后采用涂布分離法和平板劃線(xiàn)法分離，然后接種于富集培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25-35°C，培養(yǎng)時(shí)間為48-72h，純化，將分離出的菌種接種到牛肉膏和蛋白胨培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； (2)將上述培養(yǎng)好的菌種按1%_3%的接種量接入無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得抗生素藥物紅霉素降解菌劑，其中培養(yǎng)過(guò)程，攪拌速度為140 180r/min，培養(yǎng)溫度為25_35°C，培養(yǎng)時(shí)間為48 72h，紅霉素濃度為20-50mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中培養(yǎng)基配方為:K2HP044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg，MgSO40.2g，MnSO40.05g, FeSO4.7H200.0lg, CaCl2.2H200.03g，蒸餾水 IOOOmL, pH=6.8 7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中馴化條件為:攪拌速度140 180r/min，培養(yǎng)溫度為25 35°C，馴化時(shí)間為2 3個(gè)月。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中富集培養(yǎng)基的配方為:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，瓊脂糖17g，蒸餾水 IOOOmL, pH=7.1 7.3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中牛肉膏和蛋白胨培養(yǎng)基為:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，蒸餾水IOOOmL, pH=7.2 7.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生素藥`物紅霉素高效降解菌劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中紅霉素梯度投加濃度依次為10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中無(wú)機(jī)培養(yǎng)基為 Κ2ΗΡ044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg, MgSO40.2g，MnSO40.05g, FeSO4 *7H200.0lgjCaCl2 *2H200.03g，蒸餾水 IOOOmL, pH6.8 7.0，紅霉素 20 50mg/Lo
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)所得的降解菌劑可應(yīng)用于污水處理和水源水處理領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗生素藥物紅霉素高效降解菌劑的制備方法，包括(1)活性污泥接入培養(yǎng)基中，以梯度壓力式馴化法馴化；馴化后，靜置，取上層水樣，梯度稀釋后采用涂布分離法和平板劃線(xiàn)法分離，然后再進(jìn)行培養(yǎng)、純化，將分離出的菌株接種至牛肉膏和蛋白胨培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；(2)將上述培養(yǎng)所得的菌株接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單易行、安全性高、成本低；所得的紅霉素降解菌劑使用方便，能夠高效降解抗生素藥物紅霉素，而且菌株易于滅活，能夠應(yīng)用于水處理中紅霉素的有效去除。
文檔編號(hào)C12R1/40GK103224899SQ20131014881
公開(kāi)日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月25日
發(fā)明者高品, 黃圣琳, 何夢(mèng)琦, 李侃竹, 王宇暉, 薛罡, 劉亞男, 劉振鴻, 張慧芬, 劉暢, 吳立樂(lè), 劉路, 石為民 申請(qǐng)人:東華大學(xué), 上海三伊環(huán)境科技有限公司