專利名稱：真菌固體發(fā)酵法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，提供了一種用于真菌發(fā)酵培養(yǎng)，尤其是固體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基，以及對真菌的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。
背景技術(shù)：
固體發(fā)酵(solid-state fermentation, SSF)是在指沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度固態(tài)基質(zhì)中，用一種或多種微生物進(jìn)行的一個生物反應(yīng)過程(Singhaniaet al., 2009)。從生物反應(yīng)過程的角度考慮，固態(tài)發(fā)酵是以氣相為連續(xù)相的生物反應(yīng)過程，更為具體的，我們可以認(rèn)為固體發(fā)酵是一種在培養(yǎng)基為固體微粒的情況下進(jìn)行利用的一種發(fā)酵手段(Mitchell et al.，2000b)。固體發(fā)酵與液體發(fā)酵相比有許多顯著的優(yōu)點:培養(yǎng)基更為便宜、低能耗、投入成本低、更容易控制發(fā)酵體積、產(chǎn)生的廢水較少(Pandey Aet al., 2000; Pandey A et al.，2008)。以培養(yǎng)基的用料為例，用于固體發(fā)酵的培養(yǎng)基比較單純，一般來說，例如谷物類、小麥麩、小麥草、大宗谷物或農(nóng)產(chǎn)品等均可被使用，所以發(fā)酵原料成本較經(jīng)濟。對于大多數(shù)的微生物而言，其生長的環(huán)境并沒有大量的自由水存在。即便是海洋中的微生物，其中有超過98%的種類是生長于水下表層的固體介質(zhì)中的，對于真菌而言，所有已知的真菌中只有不到1%的種類是在海洋中發(fā)現(xiàn)的(Carlile & Watkinson, 1994;Kelecom, 2002)。也正是因為如此，固體發(fā)酵能夠較好地模擬真菌的生長環(huán)境，從而適用于真菌的生物發(fā)酵。到目前為止，有許多人研究了影響固體發(fā)酵進(jìn)程的生物化學(xué)和工程學(xué)的因素(Mitchell et al., 2000a, 2000b; Pandey, 2003)，但是 SSF 中的許多技術(shù)問題仍然沒有得到解決(H01ker et al.，2004)。即便如此，SSF在生物技術(shù)中的運用已經(jīng)很廣泛了(Raimbault, 1998; Pandey et al., 2000, 2001)。在許多綜述中可以查到運用SSF技術(shù)生產(chǎn)的一些生物 產(chǎn)品或代謝物，如次級代謝產(chǎn)物(Balakrishnan & Pandey,1996; Robinson et al., 2001)、黃曲霉素(Barrios-Gonzalez & Tomasini, 1996)、工程酶(Pandey et al., 1999)、細(xì)菌酶(Babu & Satyanarayana, 1996)、淀粉糖化酶(Selvakumar et al., 1998)、纖維素酶(Cen & Xia, 1999)、中國食品(Han et al.,2001)、木質(zhì)素的生物轉(zhuǎn)化(Tengerdy & Szakacs, 2003)、食用菌種植和天然香料的生產(chǎn)(Wang, 1999)、富蛋白食物(Nigam & Singh, 1996)等。關(guān)于固體發(fā)酵工藝的優(yōu)化，一般情況下，都會從溫度、培養(yǎng)基、初始pH、含水量、接種量、種齡、發(fā)酵時間等角度考慮，而關(guān)于培養(yǎng)基，更是涉及了碳源、氮源和無機鹽的選擇(Davood Mazaheri et al., 2012; Tamires Carvalho dos Santos et al., 2012;Madhuri Narra et al., 2012; Fatma Chaari et al., 2012)。以含水量為例，在蛋白酶和脂肪酶的生產(chǎn)中，高含水量會降低培養(yǎng)基質(zhì)的多孔性，從而妨礙氣體的交換，而低含水量則會減少微生物的生長，從而使酶的產(chǎn)量下降(Mahanta et al.，2008)。再以發(fā)酵時間(發(fā)酵進(jìn)程)對固體發(fā)酵的影響為例，Biazus等人在采用玉米麥芽糖進(jìn)行研究的時候發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵開始時，產(chǎn)物的量很低，而隨后產(chǎn)物的量就迅速上升直到達(dá)到最大值，在達(dá)到最大產(chǎn)物量后，產(chǎn)物的生成就受到了抑制，并且產(chǎn)物的活性也會下降(Biazus et al.，2006)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種真菌固體發(fā)酵法，采用該真菌固體發(fā)酵法能夠快速有效地得到產(chǎn)氣霉屬真菌固體發(fā)酵的產(chǎn)物。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種真菌固體發(fā)酵法，將真菌按照0.1~0.3% (質(zhì)量％)的接種量接種至真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，在黑暗中于23 28°C的發(fā)酵溫度下發(fā)酵5 10天；真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成:熟小米100g、珍珠巖19 21g和營養(yǎng)液24 26ml ；熟小米的制備方法為:在IOOg生小米中加入55飛5ml 土豆汁，用滅菌鍋于12(Tl22°C加熱1Γ16分鐘，得熟小米；營養(yǎng)液的制備方法為:將葡萄糖0.5 3g、脫脂大豆粉5 7g,蛋白胨(peptone)I 5g，磷酸二氫鉀0.3 0.55g，硫酸鎂0.15g，用25 50ml的土豆汁溶解后調(diào)節(jié)pH至6，得營養(yǎng)液(呈糊狀)。作為本發(fā)明的真菌固體發(fā)酵法的改進(jìn):將真菌按照0.2^0.3% (質(zhì)量％)的接種量接種至真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，在黑暗中于24 26°C的發(fā)酵溫度下發(fā)酵5 8天；真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成:熟小米100g、珍珠巖20g和營養(yǎng)液25ml ；熟小米的制備方法為:在IOOg生小米中加入60ml 土豆汁，用滅菌鍋于121°C加熱15分鐘，得熟小米；營養(yǎng)液的制備方法為:將葡萄糖0.5g，脫脂大豆粉7g，蛋白胨1.0g,磷酸二氫鉀0.55g，硫酸鎂0.15g，用25ml的土豆汁溶解后調(diào)節(jié)pH至6，得營養(yǎng)液。作為本發(fā)明的真菌固體發(fā)酵法的進(jìn)一步改進(jìn):營養(yǎng)液的制備方法中用濃度為
4.8 5.2mol/L (較佳為5 mol/L)的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH。作為本發(fā)明的真菌固體發(fā)酵法的進(jìn)一步改進(jìn):真菌為產(chǎn)氣霉屬真菌。具體而言:真菌為植物內(nèi)生真菌。例如可選用保藏號為CGMCC 2864的內(nèi)生真菌Muscodor sp.ZJLQ070。作為本發(fā)明的真菌固體發(fā)酵法的進(jìn)一步改進(jìn):接種量為0.2^0.3%，發(fā)酵溫度為25°C，發(fā)酵時間為5 8天。作為本發(fā)明的真菌固體發(fā)酵法的進(jìn)一步改進(jìn):用于接種的Z幾Q070菌株的種齡為6天。在本發(fā)明中，土豆汁采用常規(guī)方法制備而得，即，土豆汁的制備方法為:將200g新鮮去皮土豆切塊，用90(T990 ml的水煮沸30min后用4層紗布過濾，濾液自然冷卻至室溫后用蒸懼水定容至IL備用，pH為自然pH。本發(fā)明的真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為:將營養(yǎng)液、熟小米和珍珠巖均勻攪拌后，于121°C高壓(1.05 X IO5Pa)滅菌鍋滅菌20分鐘后備用。在本發(fā)明中:用于制備真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基的各項成分可通過市購的方式獲得，例如，脫脂大豆粉可購自河北省秦皇島金海食品工業(yè)有限公司生產(chǎn)的食品級的低溫脫脂大豆粉；蛋白胨可購自生工公司生產(chǎn)的PN5247型號的P印tone。本發(fā)明包括優(yōu)化培養(yǎng)基，溫度，種齡和接種量。本發(fā)明采用正交設(shè)計和單因素實驗設(shè)計，分別從培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)基營養(yǎng)液pH、發(fā)酵溫度、接種量、種齡這五個方面全面探索了ZJLQ070菌株的固體發(fā)酵工藝。此外，本發(fā)明采用DNS法、鑰酸銨比色法、中性甲醛法、質(zhì)量差法測定了固體發(fā)酵過程中相關(guān)生物量參數(shù)(浸出液中的還原糖、總糖、溶磷和氨基氮及氨氮，質(zhì)量損失率，含水量)在不同發(fā)酵時間的水平，最終得到了這些相關(guān)生物量參數(shù)隨發(fā)酵進(jìn)程進(jìn)行改變的發(fā)酵曲線。通過對發(fā)酵曲線的綜合分析推測在搖瓶小量固體發(fā)酵時，菌株的對數(shù)生長期開始于發(fā)酵起始后的第5-6天，結(jié)束于發(fā)酵起始后的第8天。本發(fā)明中涉及的真菌，尤其是植物內(nèi)生真菌，是定殖于健康植物組織中并不表現(xiàn)出病害癥狀的一類真菌，這些內(nèi)生真菌從分類上來講，主要是一些子囊菌，也有一些是擔(dān)子菌和卵菌。它們能與植物建立起互利共生的互作關(guān)系。這種共生互作為寄主植物帶來的好處是使植物增加了對病原微生物的抵抗能力，促進(jìn)了植物的生長和對逆境的忍受能力。本發(fā)明中涉及的產(chǎn)氣霉屬Muscodor內(nèi)生真菌，已知分布于中美洲、南美洲、東亞、東南亞和澳大利亞的熱帶、亞熱帶植物中。它們的一個重要特征就是能夠產(chǎn)生易揮發(fā)的有機化合物(volatile organic compounds, VOCs),這些VOCs能夠抑制甚至殺死許多的植物病原菌、線蟲甚至昆蟲和一些與人類疾病有關(guān)的病原菌。真菌例如選用保藏號為CGMCC 2864的內(nèi)生真菌Muscodor sp.ZJLQ070。備注說明:ZJLQ070在專利2009 10153511.6有告知,保藏號為CGMCC2864。本發(fā)明具有如下優(yōu)點:1、首次嘗試產(chǎn)氣霉屬真菌的固體發(fā)酵，開創(chuàng)先例；2、能夠快速有效地得到產(chǎn)氣霉屬真菌固體發(fā)酵的產(chǎn)物。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1:不同生小米與土豆汁比例下的固體發(fā)酵情況。A:生小米:土豆汁=1:0.75、營養(yǎng)液土豆汁用量為50%，培養(yǎng)基有明顯的結(jié)塊；B:生小米:土豆汁=1:0.50、營養(yǎng)液土豆汁用量為25%，無法觀測到菌體的生長；C:生小米:土豆汁=1:0.60、營養(yǎng)液土豆汁用量為25%，菌體生長且體系松散不結(jié)塊；D:生小米:土豆汁=1:0.60、營養(yǎng)液土豆汁用量為25%，可見到分布均勻的白色菌絲(B卩，D是C的放大圖)。圖2:發(fā)酵10天時發(fā)酵體系的質(zhì)量損失率(％)與營養(yǎng)液初始pH的關(guān)系。圖3:發(fā)酵10天時發(fā)酵體系的質(zhì)量損失率(％)與種齡的關(guān)系。圖4:25°C下ZJLQ070菌株在PDA平皿上的生長速率。圖5:發(fā)酵10天時發(fā)酵體系的質(zhì)量損失率(％)與接種量的關(guān)系。圖6:發(fā)酵10天時發(fā)酵體系的質(zhì)量損失率(％)與發(fā)酵溫度的關(guān)系。圖7:發(fā)酵產(chǎn)物浸出液中還原糖的含量與發(fā)酵時間的關(guān)系。圖8:發(fā)酵產(chǎn)物浸出液中總糖的含量與發(fā)酵時間的關(guān)系。圖9:發(fā)酵產(chǎn)物浸出液中溶磷的含量與發(fā)酵時間的關(guān)系。
圖10:發(fā)酵產(chǎn)物浸出液中氨氮的含量與發(fā)酵時間的關(guān)系。圖11:發(fā)酵體系中的含水量與發(fā)酵時間的關(guān)系。圖12:發(fā)酵體系的質(zhì)量損失率與發(fā)酵時間的關(guān)系。圖13:ZJLQ070菌株固體發(fā)酵曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例1:固體發(fā)酵培養(yǎng)基含水量的確定在固體發(fā)酵中，培養(yǎng)基的含水量將影響微生物的生長，含水量過高，將在培養(yǎng)過程中形成結(jié)塊，從而影響發(fā)酵的進(jìn)行。本實施例中，通過改變熟小米的制備中，生小米與土豆汁之間的料水比以及營養(yǎng)液中土豆汁的用量來改變培養(yǎng)基的含水量。按照上述設(shè)計理論，在進(jìn)行了大量初步選擇培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選用了以下三個培養(yǎng)基配方進(jìn)行試驗，從而確定培養(yǎng)基中較優(yōu)含水量。配方一的固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成:熟小米100g，珍珠巖20g，營養(yǎng)液25ml ο制備過程如下:I)、熟小米制備:100g生小米中加入75ml 土豆汁，用滅菌鍋于121°C加熱15分鐘，得熟小米。2)、營養(yǎng)液制備:將葡萄糖3.0g,低溫脫脂大豆粉5.0g,蛋白胨(peptone) 5.0g,磷酸二氫鉀0.3g,硫酸鎂0.15g，用50ml的土豆汁溶解后再用濃度為5mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6，得營養(yǎng)液(糊狀)。3)、將25ml營養(yǎng)液與IOOg熟小米和20g珍珠巖混拌在一起，121 °C高壓(1.05*105Pa)滅菌鍋滅菌20分鐘后備用。備注說明:按照上述配方一所得的培養(yǎng)基，滅菌前(即，步驟3)中營養(yǎng)液、熟小米和珍珠巖混拌后)的理論含水量約為54.62%。配方二的固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成:熟小米100g，珍珠巖20g，營養(yǎng)液25ml ο制備過程如下:I)、熟小米制備:100g生小米中加入50ml 土豆汁，用滅菌鍋于121°C加熱15分鐘，得熟小米。2)、營養(yǎng)液制備:將葡萄糖3.0g,低溫脫脂大豆粉5.0g,蛋白胨(peptone) 5.0g,磷酸二氫鉀0.3g,硫酸鎂0.15g，用25ml 土豆汁溶解后再用濃度為5mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6，得營養(yǎng)液(糊狀)。3)、將25ml營養(yǎng)液與IOOg熟小米和20g珍珠巖混拌在一起，121 °C高壓(1.05*105Pa)滅菌鍋滅菌20分鐘后備用。備注說明:按照上述配方二所得的培養(yǎng)基，滅菌前(即，步驟3)中營養(yǎng)液、熟小米和珍珠巖混拌后)的理論含水量約為 28.35%。
配方三的固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成:熟小米100g，珍珠巖20g，營養(yǎng)液25ml。制備過程如下:I)、熟小米制備:100g生小米中加入60ml 土豆汁，用滅菌鍋于121°C加熱15分鐘，得熟小米。2)、營養(yǎng)液制備:將葡萄糖3.0g,低溫脫脂大豆粉5.0g,蛋白胨(peptone) 5.0g,磷酸二氫鉀0.3g,硫酸鎂0.15g，用25ml 土豆汁溶解后再用濃度為5mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6，得營養(yǎng)液(糊狀)。3)、將25ml營養(yǎng)液與IOOg熟小米和20g珍珠巖混拌在一起，121 °C高壓(1.05*105Pa)滅菌鍋滅菌20分鐘后備用。備注說明:按照上述配方三所得的培養(yǎng)基，滅菌前(即，步驟3)中營養(yǎng)液、熟小米和珍珠巖混拌后)的理論含水量約為40.64%。分別用配方一、配方二和配方三所得的培養(yǎng)基進(jìn)行固體發(fā)酵，即將內(nèi)生真菌Muscodor sp.ZJLQ070以接種量0.2% (質(zhì)量％)于25°C下黑暗培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵時間10天，定期(每隔24小時)觀察固體發(fā)酵體系中真菌的生長狀況:實驗結(jié)果如圖1所示:當(dāng)用配方 一所得的培養(yǎng)基時，即當(dāng)生小米與土豆汁的料水比為1:0.75、營養(yǎng)液土豆汁用量為50% (滅菌 前理論含水量為54.62%)時，發(fā)酵7天時，ZJLQ070生長旺盛，且培養(yǎng)基有明顯的結(jié)塊，并且結(jié)塊不易消除(圖1A)；當(dāng)用配方二所得的培養(yǎng)基時，即料水比僅為1:0.5、營養(yǎng)液土豆汁用量為25% (滅菌前理論含水量為28.35%)時，ZJLQ070將難以生長，在發(fā)酵體系中無法觀測到菌體的生長(圖 1B)；當(dāng)用配方三所得的培養(yǎng)基時，即在料水比為1:0.6、營養(yǎng)液土豆汁用量為25% (滅菌前理論含水量為40.64%)時，有較好的發(fā)酵結(jié)果，在發(fā)酵7天時，能夠見到明顯的菌體生長，且培養(yǎng)體系松散不結(jié)塊(圖1C)，仔細(xì)觀看，可見到培養(yǎng)基中分布均勻的白色菌絲(圖1D)。因此，適用于ZJLQ070菌株固體發(fā)酵的料水比為生小米:土豆汁=1:0.60，即配方三，此時的滅菌前理論含水量為40.64%。實施例2:固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化采用的培養(yǎng)基為確定了含水量的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方如實施例1中配方三。培養(yǎng)基的優(yōu)化采用正交設(shè)計，如表I所示，以葡萄糖的用量為因素一，蛋白胨的用量為因素二，低溫脫脂大豆粉的用量為因素三，磷酸二氫鉀的用量為因素四，進(jìn)行4因素3水平的正交設(shè)計。因素與水平、以及正交設(shè)計表如下表2:表1:4因素3水平的正交設(shè)計表(單位:克):
權(quán)利要求
1.真菌固體發(fā)酵法，其特征是:將真菌按照0.Γ0.3% (質(zhì)量％)的接種量接種至真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，在黑暗中于23 28°C的發(fā)酵溫度下發(fā)酵5 10天； 所述真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成:熟小米100g、珍珠巖19 21g和營養(yǎng)液24 26ml ； 所述熟小米的制備方法為:在IOOg生小米中加入55飛5ml 土豆汁，用滅菌鍋于12(Tl22°C加熱1 Γ16分鐘，得熟小米； 所述營養(yǎng)液的制備方法為:將葡萄糖0.5 3g、脫脂大豆粉5 7g，蛋白胨f5g，磷酸二氫鉀0.3^0.55g，硫酸鎂0.15g，用25 50ml的土豆汁溶解后調(diào)節(jié)pH至6，得營養(yǎng)液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌固體發(fā)酵法，其特征是: 將真菌按照0.2^0.3% (質(zhì)量％)的接種量接種至真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，在黑暗中于24 26°C的發(fā)酵溫度下發(fā)酵5 8天； 所述真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成:熟小米100g、珍珠巖20g和營養(yǎng)液25ml ； 所述熟小米的制備方法為:在IOOg生小米中加入60ml 土豆汁，用滅菌鍋于121°C加熱15分鐘，得熟小米； 所述營養(yǎng)液的制備方法為:將葡萄糖0.5g，脫脂大豆粉7g，蛋白胨1.0g,磷酸二氫鉀0.55g，硫酸鎂0.15g，用25ml的土豆汁溶解后調(diào)節(jié)pH至6，得營養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的真菌固體發(fā)酵法，其特征是:所述營養(yǎng)液的制備方法中用濃度為4.8 5.2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的真菌固體發(fā)酵法，其特征是:所述真菌為產(chǎn)氣霉屬真菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的真菌固體發(fā)酵法，其特征是:接種量為0.2^0.3%，發(fā)酵溫度為25 °C，發(fā)酵時間為5 8天。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的真菌固體發(fā)酵法，其特征是:用于接種的Z幾Q070菌株的種齡為6天。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明公開了一種真菌固體發(fā)酵法，將真菌按照0.1~0.3%的接種量接種至真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，在黑暗中于23~28℃的發(fā)酵溫度下發(fā)酵5~10天；真菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成熟小米100g、珍珠巖19~21g和營養(yǎng)液24~26ml；熟小米的制備方法為在100g生小米中加入55~65ml土豆汁，用滅菌鍋于120~122℃加熱14~16分鐘，得熟小米；營養(yǎng)液的制備方法為將葡萄糖、脫脂大豆粉、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂用25~50ml的土豆汁溶解后調(diào)節(jié)pH至6，得營養(yǎng)液。采用本發(fā)明的方法能夠快速有效地得到產(chǎn)氣霉屬真菌固體發(fā)酵的產(chǎn)物。
文檔編號C12P1/02GK103215313SQ201310111048
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月31日
發(fā)明者林福呈, 劉誠, 章初龍, 馮曉曉 申請人:浙江大學(xué)