專利名稱：一種檢測(cè)布魯氏菌的lamp方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種快速并且可實(shí)時(shí)定量檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的,是目前世界上流行最廣、危害最大的人畜共患病之一，引起流產(chǎn)、不孕以及各種組織的局部病灶。布魯氏菌可通過鼻、咽、口腔感染，主要是通過粘膜上皮組織浸入。目前，布魯氏菌屬已有10余個(gè)種的布魯氏菌存在，不同種的布魯氏菌具有明顯的宿主危害傾向性，但大多具有不同宿主間的交叉感染能力，可引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。隨著我國(guó)近年來(lái)，畜牧業(yè)的快速發(fā)展，布魯氏菌病成為了限制我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重病害之一。布魯氏菌包括羊群布魯氏菌、牛種布魯氏菌、豬種布魯氏菌等種源。布魯氏菌檢測(cè)技術(shù)主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、乳環(huán)試驗(yàn)(MRT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、ELISA和PCR等方法。常規(guī)方法分離鑒定病原所需條件苛刻，且費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、危險(xiǎn)性高、成功率低。PBT和SAT特異性不高、敏感性低；CFT操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)水平要求高，實(shí)踐應(yīng)用極為不便。PCR檢測(cè)方法較前幾種快速也準(zhǔn)確許多，但需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，成本高，不適合基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。LAMP方法具有靈敏性高、特異性好、反應(yīng)時(shí)間短、判定結(jié)果方便、不需要昂貴儀器等優(yōu)勢(shì)，目前多數(shù)建立的LAMP反應(yīng)方法多采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來(lái)判定結(jié)果，只能分析LAMP反應(yīng)的最終結(jié)果，且存在氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)室的危險(xiǎn)，由于缺乏對(duì)反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)控很難排除這些干擾因素，不能對(duì)檢測(cè)結(jié)果做出準(zhǔn)確的判定。本發(fā)明使用的LAMP方法不僅敏感度高，特異性強(qiáng)，不造成環(huán)境污染，快速得出結(jié)果，并且可實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，而且操作簡(jiǎn)便，只需按建立的體系加樣即可，為簡(jiǎn)便、快捷準(zhǔn)確地檢測(cè)布魯氏菌帶來(lái)便利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種為基層簡(jiǎn)便、快捷準(zhǔn)確地檢測(cè)布魯氏菌的方法，公開一種快速、實(shí)時(shí)定量的檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法。本發(fā)明提供的檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法，該方法的檢測(cè)步驟包括材料的準(zhǔn)備、LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成、細(xì)菌的前處理、LAMP反應(yīng)體系建立以及采用LAMP檢測(cè)方法，以上所述的LAMP檢測(cè)方法是采用特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和熒光可視化檢測(cè)的方法，反應(yīng)溫度為63°C、反應(yīng)在2(T35min間出現(xiàn)擴(kuò)增，引物包括外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物；
所述的外引物是F3和B3 ；
所述的內(nèi)引物是FIP和BIP ；
所述的環(huán)引物是LF和LB;
其中
F3 CGTCGGCTACGACCTGAAB3 ACCGGCCAGATCATAGTTCTFIP TCGTCCAAGCCGTTGTTAAGCTCCCGGTTATGCCGTACCTBIP GGTCTCGAAGCCAAGCTGACGTGTTGCCGTACTGGGTGTALF GCGAACCGGCAATACCAGLB GCCGCGTTGAGTACCGT。以上所述的細(xì)菌的前處理是將細(xì)菌直接加入PBS煮沸。以上所述的LAMP反應(yīng)體系建立LAMP反應(yīng)體系以25 μ I計(jì):
2X反應(yīng)緩沖液12.5μ1
FIP40pmol
BIP40pmol
F35pmol
B35pmol
LF20pmol
LB20pmol
模板2 μ I
超純水補(bǔ)足25 μ I
以上所述的LAMP檢測(cè)方法采用Loopamp實(shí)時(shí)濁度儀。
以上所述的LAMP檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)、定量的檢測(cè)方式。以上所述的LAMP檢測(cè)方法采用密閉全程監(jiān)控。以上所述的LAMP檢測(cè)方法中熒光檢測(cè)采用鈣黃綠素?zé)晒馊玖?，熒光染料在反?yīng)前加入。
以上所述的LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)樣品溶液為煮沸的細(xì)菌稀釋液體。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和進(jìn)步是:
I)特異性強(qiáng)
所檢測(cè)的陰性對(duì)照株均無(wú)陽(yáng)性結(jié)果出來(lái)，與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。2)靈敏度高
普通的PCR檢測(cè)方法的靈敏度為102cfu/ml數(shù)量級(jí)，而是用本發(fā)明檢測(cè)方法，檢測(cè)限約為7.4cfu/ml，是普通PCR的100倍左右。3)迅速出結(jié)果
普通的PCR整個(gè)過程在2 4小時(shí)左右才能得出結(jié)果，一般的LAMP方法也要在I小時(shí)左右得出結(jié)果，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法反應(yīng)在2(T35min間出現(xiàn)擴(kuò)增。4)不造成污染
目前LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應(yīng)后加入，加入的熒光染料syber-green,需采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像,存在開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染。而本發(fā)明的熒光染料是在反應(yīng)前加入的鈣黃綠素商用染料，檢測(cè)過程不需要開蓋。5)可實(shí)時(shí)定量
本發(fā)明利用Tubidimeter real-time LA-320池度儀來(lái)實(shí)時(shí)分析LAMP反應(yīng)的結(jié)果,不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對(duì)應(yīng)的濁度值的時(shí)間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代人標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求出各時(shí)間的布魯氏菌的拷貝數(shù)，達(dá)到定量檢測(cè)產(chǎn)物的目的。


圖1是本方明LAMP方法特異性檢測(cè)結(jié)果；3株布魯氏菌反應(yīng)管出現(xiàn)濁度的上升曲線，5株陰性對(duì)照菌反應(yīng)管均無(wú)擴(kuò)增。圖2是本發(fā)明LAMP方法敏感性檢測(cè)結(jié)果；原始菌液濃度為7.4X 106cfu/ml, LAMP法細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)限約為7.4cfu/ml，而PCR法細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)限一般為102cfu/ml數(shù)量級(jí)。圖3是加入熒光染料后肉眼觀察結(jié)果；左管為陰性對(duì)照，右管為以布魯氏菌為模板的反應(yīng)情況。圖4是本發(fā)明布魯氏菌定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；利用不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對(duì)應(yīng)的濁度值對(duì)時(shí)間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代人標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求出各時(shí)間的布魯氏菌拷貝數(shù)。
具體實(shí)施例方式1、材料的準(zhǔn)備
牛布魯氏囷、豬源布魯氏囷、羊源布魯氏囷、大腸桿囷、沙門氏囷、鏈球囷、副豬嗜血桿菌均為廣西獸醫(yī)研究所分離保存。LAMP法DNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京藍(lán)譜生物科技有限公司。2、LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)GenBank中的布魯氏菌外膜蛋白0MP25基因序列，利用LAMP法引物輔助設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V4軟件設(shè)計(jì)一套LAMP引物`，其中F3、B3為外引物，F(xiàn)IP、BIP為內(nèi)引物，LF、LB為環(huán)引物；B4、B5為布魯氏菌LAMP檢測(cè)引物，其中F3 CGTCGGCTACGACCTGAAB3 ACCGGCCAGATCATAGTTCT
FIP TCGTCCAAGCCGTTGTTAAGCTCCCGGTTATGCCGTACCTBIP GGTCTCGAAGCCAAGCTGACGTGTTGCCGTACTGGGTGTALF GCGAACCGGCAATACCAGLB GCCGCGTTGAGTACCGT
3、細(xì)菌的前處理
由于LAMP法具有敏感度高，其敏感性通常比PCR高出1(Γ1000倍，只需對(duì)菌株從平板中刮取一小接種環(huán)于裝有500微升PBS的EP管進(jìn)行煮沸處理即可。4、LAMP反應(yīng)體系建立
按照試劑盒說明書，按25 μ I體系配置:
2X反應(yīng)緩沖液12.5μ1
FIP40pmol
BIP40pmol
F35pmol
B35pmol
LF20pmol
LB20pmol模板2 μ 1
超純水補(bǔ)足25 μ 1
LAMP反應(yīng)在以實(shí)時(shí)濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)進(jìn)行密閉全程監(jiān)控的形式監(jiān)測(cè)本方法的檢出情況，濁度儀時(shí)間監(jiān)測(cè)擴(kuò)增情況，可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過獲得未知樣品達(dá)到0.1時(shí)的時(shí)間值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)，反應(yīng)溫度以試劑盒推薦的63 °C做為反應(yīng)溫度。5、LAMP檢測(cè)方法
I)特異性檢測(cè)
分別提取牛種布魯氏菌、羊種布魯氏菌、豬種布魯氏菌、豬大腸桿菌、沙門氏菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌8種菌株，各菌株純培養(yǎng)后，分別刮取一小接種環(huán)于裝有500微升PBS的EP管進(jìn)行分別煮沸處理作為模板，進(jìn)行各菌株的LAMP擴(kuò)增，檢驗(yàn)LAMP方法的特異性。2)敏感性檢測(cè)
將過夜培養(yǎng)的豬種布魯氏菌菌液10倍倍比稀釋至KT1 10_8成8個(gè)稀釋度菌液，取各稀釋度菌液100 μ I平板計(jì)數(shù)。各稀釋度菌液取1ml，用PBS的EP管煮沸提取DNA，取2 μ I上清液作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。3)熒光可視化檢測(cè)
根據(jù)濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，加入熒光染料，熒光染料在反應(yīng)前加入，加入的染料為鈣黃綠素商用染料，63°C下反應(yīng)25分鐘后，在紫外燈下觀察，不采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，避免開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染。實(shí)施例1 LAMP檢測(cè)方法的特異性結(jié)果
對(duì)3株布魯氏菌和5株陰性對(duì)照菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，3株布魯氏菌反應(yīng)管在30分鐘左右出現(xiàn)濁度的上升曲線，為陽(yáng)性結(jié)果，5株陰性對(duì)照菌反應(yīng)管曲線均無(wú)擴(kuò)增情況出現(xiàn)，LAMP呈陰性結(jié)果。實(shí)施例2 LAMP檢測(cè)方法的敏感性結(jié)果
細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度經(jīng)平板計(jì)數(shù)，原始菌液濃度為7.4 X 106cfu/ml。10倍倍比稀釋菌液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2顯示，LAMP法細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)限為7.4cfu/ml，而PCR法細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)限一般為102cfu/ml數(shù)量級(jí)。實(shí)施例3 LAMP檢測(cè)方法的熒光可視化檢測(cè)結(jié)果
根據(jù)濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，加入熒光染料，63°C反應(yīng)35分鐘后，在紫外燈下觀察，圖3為觀察結(jié)果，左管為陰性對(duì)照，右管為以布魯氏菌為模板的反應(yīng)情況，建立的方法方便基層使用，只需使用試劑盒配合本方法設(shè)計(jì)的LAMP引物，加入樣品后，用低廉的水浴鍋來(lái)保持63°C 35分鐘，即可快速觀察結(jié)果，且無(wú)需開蓋，避免了污染。實(shí)施例4布魯氏菌定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
設(shè)置對(duì)照:濃度為 7.4X105cfu/ml、7.4X 104cfu/ml、7.4X 103cfu/ml、7.4XlO2Cfu/ml、7.4 X IO1Cfu/ml、7.4 X 10°cfu/ml的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，因?yàn)闈舛鹊膶?duì)數(shù)值與濁度值為0.1的時(shí)間值成線性關(guān)系，所以可以將濁度儀捕捉到的值與時(shí)間做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，如圖4所示。從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程來(lái)看相關(guān)系數(shù)R2為0.9578，呈良好的線性關(guān)系。以時(shí)間為X值，可求出Y值即濃度的次方數(shù)。如某試驗(yàn)樣品達(dá)到濁度值為0.1的時(shí)間為30分鐘時(shí)，帶入所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出Y等于3.66，則濃度為103 66，再乘以基數(shù)7.4，即為該試驗(yàn)樣品點(diǎn)的濃度，從而達(dá)到定量的效果。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法，其特征是:該方法的檢測(cè)步驟包括材料的準(zhǔn)備、LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成、細(xì)菌的前處理、LAMP反應(yīng)體系建立以及采用LAMP檢測(cè)方法，所述的LAMP檢測(cè)方法是采用特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和熒光可視化檢測(cè)的方法，反應(yīng)溫度為63°C、反應(yīng)在2(T35min間出現(xiàn)擴(kuò)增，引物包括外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物； 所述的外引物是F3和B3 ； 所述的內(nèi)引物是FIP和BIP ； 所述的環(huán)引物是LF和LB; 其中:F3 CGTCGGCTACGACCTGAAB3 ACCGGCCAGATCATAGTTCTFIP TCGTCCAAGCCGTTGTTAAGCTCCCGGTTATGCCGTACCTBIP GGTCTCGAAGCCAAGCTGACGTGTTGCCGTACTGGGTGTALF GCGAACCGGCAATACCAGLB GCCGCGTTGAGTACCGT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法，其特征是:所述的細(xì)菌的前處理是將細(xì)菌直接加入PBS煮沸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP反應(yīng)體系建立LAMP反應(yīng)體系以25 μ I計(jì)， 2X反應(yīng)緩沖液12.5μ1FIP40pmol BIP40pmol F35pmol B35pmol LF20pmol LB20pmol 模板2 μ I 超純水補(bǔ)足25 μ I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)、定量的檢測(cè)方式。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP檢測(cè)方法采用Loopamp實(shí)時(shí)池度儀。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP檢測(cè)方法采用密閉全程監(jiān)控。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP檢測(cè)方法中熒光檢測(cè)采用鈣黃綠素?zé)晒馊玖?，熒光染料在反?yīng)前加入。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)樣品溶液為煮沸的細(xì)菌稀釋液體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)布魯氏菌的LAMP方法，該檢測(cè)方法包括材料的準(zhǔn)備、LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成、細(xì)菌的前處理、LAMP反應(yīng)體系建立以及采用LAMP檢測(cè)方法，LAMP檢測(cè)方法是采用特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和熒光可視化檢測(cè)的方法。特異性檢測(cè)和敏感性檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明提供的LAMP檢測(cè)方法可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)并且定量檢測(cè)出布魯氏菌的拷貝數(shù)，快速準(zhǔn)確的獲得檢測(cè)結(jié)果，為簡(jiǎn)便、快速地檢測(cè)布魯氏菌帶來(lái)便利。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103205493SQ201310107060
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者李軍, 陳澤祥, 楊威, 彭昊, 許力干, 謝宇舟, 禤雄標(biāo), 胡帥, 馬春霞, 謝永平, 潘艷 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所