專利名稱：Foxp3基因 TSDR位點甲基化檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因位點甲基化檢測方法。
背景技術(shù)：
SLE是一種由于自身免疫反應(yīng)引起的慢性炎性疾病，以多個器官、組織受累和血清中有多種自身抗體為特征，但其發(fā)病機制尚未明了，大量資料證明是在遺傳、環(huán)境、感染和性激素等因素的影響下出現(xiàn)的細胞免疫功能失調(diào)所致。SLE患者臨床異質(zhì)性大，病情遷延，反復(fù)波動。因此，在診斷SLE時，應(yīng)進行包括其活動性與嚴重程度的病情判斷，以利于選擇治療方案。但是對于SLE活動度的判定并非易事，活動性與重癥度并非是平行關(guān)系，且SLE是多臟器受害的疾病，受侵犯臟器損害不同，對疾病活動性的評價也會發(fā)生變化。包括對感染性疾病在內(nèi)的其他疾病進行鑒別，進一步加大了活動性判定的難度?，F(xiàn)行的SLE活動性判定依據(jù)主要有:SLE病情活動指數(shù)(systemic lupuserythematosus disease activity index, SLEDAI)、狼瘡活動測量標(biāo)準(systemic lupusactivity measure, SLAM)、歐洲統(tǒng)一狼瘡損傷指數(shù)(European consensus lupus damageindex，ECLAM)和大不列顛群島狼瘡評估組指數(shù)(British Isles lupus assessmentgroup, BILAG)，其中SLEDAI和BILAG是目前狼瘡隨機臨床試驗最常用的兩個評估工具。但上述各種評分方法仍不完美，各有優(yōu)缺點。單獨使用，有時并不能對活動性給出準確的評判。因此，需要一種更為有效、更為精準判定方法。CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)首次由日本學(xué)者Sakaguchi等于1995年所報道，這類T細胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用是維持自身免疫耐受的關(guān)鍵，此發(fā)現(xiàn)引起了免疫學(xué)界的廣泛關(guān)注。Treg的免疫抑制性是指經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號刺激活化以后能夠抑制CD4+ CD25-T細胞的活化和增殖。大量研究表明，Treg不僅在自身耐受的獲得和維持及自身免疫的防御中起重要作用，在腫瘤、移植耐受甚至是病原體感染等免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中也扮演重要角色。雖然其機制至今還不是十分明確，但大量研究表明Treg細胞的發(fā)育、功能的發(fā)揮與一個蛋白質(zhì)分子——Foxp3有著密切的聯(lián)系。Foxp3是一種轉(zhuǎn)錄因子，它能通過調(diào)控特定基因的表達，從而控制Treg細胞的分化成熟。有研究發(fā)現(xiàn)與非活動性SLE患者和健康對照組相比,活動性SLE患者外周血⑶4+T細胞表面⑶69表達增多，而⑶25的表達明顯減少，這一現(xiàn)象提示，活動性SLE患者中T細胞被大量激活，卻沒有誘導(dǎo)出免疫調(diào)節(jié)性Treg細胞。進一步研究顯示SLE患者外周血Foxp3的表達也明顯低于對照組，它的表達水平與⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量存在依賴關(guān)系。Treg細胞在發(fā)揮抑制作用機制中起著重要作用。因此，活動性SLE患者體內(nèi)缺乏CD4+CD25+ T細胞可能會導(dǎo)致機體抑制自身免疫反應(yīng)的功能減弱，并與SLE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前，甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-High Resolution Melting CurveAnalyse，簡稱MS-HRM)是一種不需要PCR產(chǎn)物后續(xù)操作的，簡單且靈敏的檢測基因甲基化水平的方法。該方法在甲基化修飾位點附近設(shè)計實時定量PCR引物，對來自經(jīng)重亞硫酸鹽修飾的DNA的相關(guān)區(qū)進行特異性PCR擴增。重亞硫酸鹽修飾DNA，讓非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而5 -甲基胞嘧啶保持不變，隨后使用含飽和DNA結(jié)合染料的PCR體系擴增，擴增后通過比較曲線的熔解溫度和峰形進行分析。MS-HRM因其高敏感性，可以區(qū)分擴增產(chǎn)物中少至I個堿基變化的序列差異，從而通過尿嘧啶/胞嘧啶的差異判斷擴增子來源的初始模板的甲基化修飾差異。但MS-HRM的數(shù)據(jù)一直沒有一種公認的分析方法，目前結(jié)果分析大多采用標(biāo)準曲線法，將甲基化和非甲基化對照DNA (經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾)以不同比例混合，創(chuàng)建一系列甲基化梯度標(biāo)準品。結(jié)合標(biāo)準品的特征熔解曲線和溫度，用專門軟件進行計算分析，從而得出樣本中的DNA甲基化比率。這種方法使得實驗更加繁瑣，增加了實驗環(huán)節(jié)，在標(biāo)準品在配置的過程中極易因操作原因，導(dǎo)致標(biāo)準品配比不準確，使得實驗準確性和重復(fù)性大打折扣。且加大了實驗成本，延長了實驗時間。因此限制了 MS-HRM技術(shù)在臨床診斷的推廣應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
，本發(fā)明的目的在于基于并改進現(xiàn)有MS-HRM方法，提供一種更為簡單的檢測Foxp3基因TSDR位點甲基化水平的方法。
本發(fā)明提供的檢測 Foxp3基因TSDR位點甲基化水平的方法依次包括下述步驟:(I)從樣本全血中提取基因組DNA ;(2) DNA的亞硫酸氫鹽處理；(3) MS-HRM PCR =MS-HRMPCR反應(yīng)中，F(xiàn)oxp3基因TSDR位點的特異性擴增引物序列為:F:5/ -TTGGGGGTAGAGGAGGATTTAGAGGGTC-3/，R:5/ -CAACACCCATATCACCCCACCTAAA-3'；(4)經(jīng)HRM-PCR檢測，讀取樣本Tm值，根據(jù)樣本Tm值判斷Foxp3基因TSDR甲基化水平。
本發(fā)明改進了傳統(tǒng)用于檢測基因甲基化水平的MS-HRM方法，基于MS-HRM的高靈敏性，直接使用MS-HRM檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎蚪MDNA中Foxp3基因TSDR的Tm值，以此為指標(biāo)，反應(yīng)活動性SLE患者Foxp3基因TSDR甲基化水平。因為直接使用Tm值進行統(tǒng)計學(xué)分析，不用標(biāo)準曲線進行后續(xù)的甲基化百分比計算。這樣我們省去了標(biāo)準品制備和軟件分析環(huán)節(jié)，大大節(jié)省了時間和成本，簡化了實驗步驟，使得實驗操作更簡單且減少了實驗誤差。特別是無需甲基化計算軟件分析，使得很多沒有配備甲基化分析軟件的HRM實時定量PCR儀均能開展此實驗。該方法相對于現(xiàn)有的MS-HRM方法，更加簡單易行，有望成為評估Foxp3基因TSDR甲基化的精確、廉價、快速的工具，并為臨床指導(dǎo)評價SLE活動性、療效和預(yù)后提供幫助。
TSDR (Treg-specific demethylated region)是 Foxp3 基因中的一個高度保守的位點，其在自然Treg細胞中完全去甲基化，但在效應(yīng)T細胞中是甲基化的。Foxp3基因TSDR的甲基化使得相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子不能結(jié)合至其啟動子區(qū)，導(dǎo)致Foxp3低表達。本發(fā)明研究得到:以慢性感染性疾病作為疾病對照，與非活動性SLE患者，慢性感染性疾病患者以及正常人群相比，活動性SLE患者。Foxp3的TSDR區(qū)甲基化水平明顯升高，且與SLE活動性呈高度正相關(guān)。因此，通過檢測Foxp3基因TSDR的甲基化水平，對評價SLE病人的活動性提供幫助。


圖1:各組樣本MS-HRM PCR檢測Tm值示意圖，其中HC:健康對照；CM1:慢性感染性疾病；In SLE::非活動性SLE ；Ac SLE:活動性SLE ；
圖2: SLEDAI分值與Tm值間相關(guān)性 圖3 =MS-HRM PCR反應(yīng)條件；
圖4 =HRM-PCR原理和特點。
具體實施例方式實施例1: Foxp3基因TSDR位點甲基化檢測
1、從300ul全血中提取基因組DNA
(1)裂解1:取300ul全 血放入到1.5ml的離心管中，加入900ul裂解液I。上下顛倒混勻，渦旋混勻15秒后放入離心機中離心，離心速率為8000rpm，Imin0倒掉上層液，可見離
心管底部有血色沉淀。重復(fù)上述裂解步驟一次，最后去除上清，使離心管底部沉淀無殘留裂解液I ;
(2)裂解2:在上步所得沉淀中加入Iml裂解液2。上下顛倒混勻，徹底重懸沉淀。渦旋混勻15秒后8000rpm，離心lmin。去上清，可見離心管底部有微量淡紅色沉淀。重復(fù)此裂解步驟一次，最后徹底去除上清，離心管底部的灰白色沉淀無殘留裂解液2 ；
(3)消化:吸取蛋白酶KIOul ( = 0.2mg )加入到上面的離心管中，使蛋白酶K與沉淀物均勻接觸后，加入320ul消化液，上下顛倒混勻，使沉淀充分重懸。58°C水浴消化15分鐘，最后可見澄明的消化液體；
(4)純化:在上面的消化液體中加入IlOul純化液，上下顛倒混勻，15000rpm,離心lmin。吸取上清液放入到裝有IOOOul無水乙醇的1.5ml離心管中，輕柔上下翻轉(zhuǎn)10次,可見絮狀DNA析出。用帶鉤的玻璃棒挑起絮狀DNA放入到IOOul 70%乙醇中來回漂洗20次，鉤出DNA，在空氣中涼干后放入到IOOul溶解液中。4°C溶解過夜，提取完成。提取的DNA可于-20°C長期保存。如要立即用此DNA做PCR實驗，把DNA溶解液放在58°C水浴中，保溫30分鐘，手指輕彈混勻離心管，使DNA充分溶解即可。2、DNA的亞硫酸氫鹽處理
采用Qiagen公司的EpiTect Bisulf ite試劑盒處理全血基因組，DNA標(biāo)本來自第一部分實驗提取所得，操作步驟按試劑盒說明書進行:
(1)緩沖液BW中加入30ml無水乙醇
(2)緩沖液BD中加入30ml無水乙醇
(3)將310ul 無酶水加入 310ug carrier RNA 中，得到 lug/ul 的 carrier RNA 溶液
(4)按1:100體積往緩沖液BL中加入lug/ul的carrier RNA溶液,使緩沖液BL中carrier RNA 的濃度為 10ug/ml
(5)根據(jù)需要處理的樣本多少溶解BisulfiteMix,每管Bisulfite Mix中加入800ul的無酶水，劇烈震蕩5分鐘至完全溶解
(6)在200ul的PCR管中依次加入表2-1中的各成分，充分震蕩混勻；反應(yīng)體系見表I。表1:DNA亞硫酸氫鹽處理步驟(6)的反應(yīng)體系成分__體積_
DMA 溶液35μΙ (約 lfjg)
無酶水__5|i_
Bisulfite Mix 溶液85μ!
「DHA保護緩沖液丨丨35μ!
「結(jié)體積[j 140μ1
(J)在PCR儀中按表2的條件進行亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)換；
表2: DNA亞硫酸氫鹽處理反應(yīng)條件
「變性H 99°C—|丨5分鐘 Π
fjffWIf^O0C丨卩5分鐘
「變性Ilsrc~Il 5分鐘 Π
[Tff育Il cotI Ils 分鐘
「變性||wtIh分鐘
「■育11 MT11 Π5 分鐘
保存Il 20°cIl
(8)反應(yīng)結(jié)束后將PCR管簡短離心，將所有的反應(yīng)液體轉(zhuǎn)至干凈的1.5ml EP管中；
(9)加入560ul緩沖液BL(含IOug/mlcarrier RNA,見第4步),震蕩混勻，簡短離心；
(10)將上一步所得的所有液體全部轉(zhuǎn)入帶有收集管的EpiTectspin吸附柱中，13000rpm離心I分鐘，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中；
(11)往離心柱中加入500ul緩沖液BW，13000rpm離心I分鐘，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中；
(12)往離心柱中加入500ul緩沖液BD，室溫孵育15分鐘，13000rpm離心I分鐘，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中；
(13)13000rpm離心I分鐘，將吸附柱轉(zhuǎn)入一個新的1.5ml的EP管中，加20ul緩沖液EB, 12000rpm離心I分鐘洗脫DNA，所得的液體即為純化了的亞硫酸氫鈉處理后的DNA。3.MS-HRM檢測樣本Foxp3基因TSDR甲基化水平
使用 Rotor-Gene 6000 cycler (Corbett)實時定量 PCR 儀進行 MS-HRM PCR，根據(jù)EpiTect HRM-PCR kit (Qiagen)試劑盒說明書步驟進行。(I)反應(yīng)體系的建立在200ul的PCR管中依次加入以下各組分，所有PCR均采用10μ1反應(yīng)體系,具體見表3。表 3:MS-HRM PCR 反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.Foxp3基因TSDR位點甲基化檢測方法，其特征在于依次包括下述步驟: Cl)從樣本全血中提取基因組DNA ； (2)DNA亞硫酸氫鹽處理；(3)MS-HRM PCR ； (4)經(jīng)HRM-PCR檢測，讀取樣本Tm值，根據(jù)樣本Tm值判斷Foxp3基因TSDR甲基化水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:步驟(3)MS-HRM PCR反應(yīng)時，F(xiàn)oxp3基因TSDR位點的PCR特異性擴增引物序列為:F:5/ -TTGGGGGTAGAGGAGGATTTAGAGGGTC-3/， R:5/ -CAACACCCATATCACCCCACCTAAA-3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化檢測方法，其特征在于:在步驟(4)中，樣本Tm均值達到或超過79.0O時 ，判斷Foxp3基因TSDR位點甲基化水平高。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測Foxp3基因TSDR位點甲基化水平的方法。該方法依次包括下述步驟(1)從全血中提取基因組DNA；(2)DNA的亞硫酸氫鹽處理；(3)MS-HRMPCR；(4)經(jīng)HRM-PCR檢測，讀取樣本Tm值，根據(jù)樣本Tm值判斷Foxp3基因TSDR甲基化水平。該方法相對于現(xiàn)有的MS-HRM方法，更加簡單易行，有望成為評估Foxp3基因TSDR位點甲基化的精確、廉價、快速的工具，并為臨床指導(dǎo)評價SLE活動性、療效和預(yù)后提供幫助。
文檔編號C12Q1/68GK103173552SQ20131009160
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月21日
發(fā)明者陸前進, N·歐文, 梁功平, 趙明, 余鑫海 申請人:中南大學(xué)