專利名稱：用于生產拴系蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用重組表達載體生產拴系的(tethered)跨膜蛋白細胞外或細胞內結構域的方法。
背景技術：
目前市場上治療的主要部分瞄準了細胞膜成分。發(fā)明針對細胞膜目標的藥物的主要挑戰(zhàn)是保證分離的細胞膜樣本及其成分如在體內一樣發(fā)揮功能。從天然細胞環(huán)境移出時，細胞膜常常失去了其主要生理特征:流動性。流動性是中心膜特性之一，其有助于在無數(shù)的生化過程中的受體和信號分子的引人注目的空間重排，從細胞間的聯(lián)系到病毒感染。例如，多價配體誘導他們的靶受體的共同定位，從而編碼被承認的不同于獨立結合過程的集合特性。在許多情況中，靶受體能夠移動和采納互補構建的能力對于確定分子識別過程的整體親和性極為重要。在G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)和整合信號中，結合配體觸發(fā)受體蛋白自身的構象改變，依次，改變其與其他膜信號分子的結合。在各種情況中，膜成分的組織和遷移率的改變發(fā)生在信號傳送和識別過程中。為了保留細胞膜的生理完整性，大多數(shù)藥物開發(fā)過程被強制開發(fā)分析膜靶物質的“活細胞”分析。這些方法導致了顯著的復雜性，且常常難以被工業(yè)化。而且，活細胞系統(tǒng)特定受體的機制研究高度問題化，原因是天然膜含有數(shù)百的獨特的受體分子。美國專利No6228326，在此引入作參考，描述了已知為MembraneChip 的系統(tǒng)。此技術解決了許多上述問題，原因是其結合了體內環(huán)境的生理精確性和工業(yè)藥物篩選所需的高產量。此技術包括被輕移到硅底物上的被支持的脂質雙層，以及在不連續(xù)的列陣欄空間分離他們。MembraneChip 能夠展示出細胞膜及其分子成分在體內系統(tǒng)中的流動性及其功能特性。該技術的此特征不同于其他生物列陣技術，有助于準確代表種種生物功能，具有無先例的準確性。 磷脂瞄定區(qū)域的融合以及瞄定區(qū)域供體多肽的異種多肽已被描述了(美國專利No5，109，113)。而且，糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號區(qū)域與GPI信號區(qū)域的異種多肽的融合已經被描述(美國專利No5，374，548)用于瞄定細胞膜表面。這些融合蛋白質并不定位于細胞膜。但是，這些融合蛋白質的純化存在問題。因此，仍然需要一種新的生產拴系膜蛋白的方法，特別是使用以上所描述的設備。

發(fā)明內容
一方面，本發(fā)明包括一種生產拴系的跨膜蛋白的細胞內或細胞外結構域的方法。在一個實施方案中，該方法包括制備含有5’信號序列，純化的抗原決定簇標記，編碼膜蛋白細胞外結構域的序列，和3’瞄定序列的表達載體。然后用表達載體轉染哺乳動物細胞，以生產融合至膜蛋白細胞外結構域的錨，從而瞄定細胞膜。在一個實施方案中，信號序列選自下組中的蛋白:表皮生長因子，胰島素，神經生長因子，血小板衍生的生長因子，胰高血糖素，ICAM-l，B7-l，TrkA，血小板衍生的生長因子受體，及⑶58。在一個實施方案中，3’的瞄定序列是GPI瞄定序列。在另一個實施方案中，3’的瞄定序列是GPI序列的32個末端氨基酸。在另一個實施方案中，該方法包括制備一種含有5’豆蘧?；幋a序列，編碼膜蛋白細胞內結構域的序列，和3’純化的抗原決定簇標記的表達載體。用表達載體轉染哺乳動物細胞，以生產瞄定膜細胞內結構域的豆蘧酰化的拴系蛋白。在一個實施方案中，豆蘧?；幋a序列是來自c-Src。在一個實施方案中，純化標記是六-組氨酸抗原決定簇。哺乳動物細胞可以選自CHO 或 HEK-293 細胞。在另一方面，本發(fā)明包括用于生產含有5’信號序列；純化抗原決定簇標記；編碼膜蛋白細胞外結構域的序列；和3’瞄定序列的拴系細胞外結構域蛋白的表達載體。在一個可效仿的實施方案中，3’瞄定序列是GPI瞄定序列。在另一方面，本發(fā)明包括用于生產含有豆蘧?；?’信號序列；編碼膜蛋白細胞內結構域的序列；和3’純化抗原決定簇標記的拴系的細胞內結構域蛋白的表達載體。在一個實施方案中，純化抗原決定簇標記是六-組氨酸抗原決定簇標記。


圖1A-1B分別表示表達載體pYBSlOl和pYBS201。圖2A-2C·表示實施例3中描述的使用ICAM-1 (圖2A)和B7-1 (圖2B)的試驗的FACS分析，以及ICAM-1和B7-1的SDS-PAGE和蛋白質印記分析(圖2C)；圖3A-3C是描述細胞黏附至MembraneChip 顯示蛋白的圖；圖4A-4B表示“免疫學的突觸”的結果和T細胞激活試驗，以進一步確定MembraneChip 顯不蛋白的功能。圖4A表不在MembraneChips 顯不的ICAM-1和PCC力口載的IEk上PCC抗原特異的鼠科T細胞的不成熟和成熟的突觸的熒光顯微圖片。圖4B是圖4A中圖片的定量圖。
具體實施例方式I 定義“表達載體”和“質粒”互換使用是指可以被用于攜帶特定基因到靶細胞的單鏈或雙鏈DNA分子。一旦表達載體進入細胞，被基因編碼的蛋白質可以通過宿主細胞的正常的轉錄和翻譯過程被生產。應當理解DNA分子可以被可操縱的連接到控制序列如啟動子上?？杀贿M一步理解的是表達載體可以包含額外的調節(jié)序列以控制轉錄和/或翻譯。本文使用的“細胞外結構域”指的是膜蛋白的細胞外部分。這些片段通常為生理配體的結合位點，例如，神經傳導因子和激素。如果蛋白的多肽鏈幾次通過雙層，細胞外結構域可以包含幾個突出膜的“環(huán)”。本文使用的“細胞內結構域”指的是膜蛋白的細胞內(或細胞質)區(qū)域。本文使用的“純化抗原決定簇標記”指的是用于從裂解的細胞中純化表達蛋白的肽系列?？尚Х碌募兓氖橇?組氨酸。本文使用的“信號序列”指的是指導翻譯后蛋白運輸?shù)碾男蛄?。本文使用的“錨”和“拴系”指的是用磷脂或磷脂雙層瞄定或連接膜蛋白結構域的序列?？尚Х碌腻^序列編碼GPI拴系或豆蘧?；┫?。除非特別指明，本發(fā)明的實踐應用本領域技術中的分子生物學、化學、生物化學、重組DNA技術和免疫學中的常規(guī)方法。這些技術在文獻中有充分的解釋。見，例如，Handbook of Experimental Immunology, Vols.1-1V(D.M.Weir 和 C.C.Blackwelleds., Blackwell Scientific Publications) ;A.L.Lehninger, Biochemistry(WorthPublishers, Inc., current addition);Sambrook,等人，Molecular Cloning;ALaboratory Manual(2nd Edition, 1998);Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplaneds., Academic Press, Inc.)。

在詳細描述本發(fā)明之前，應當理解本發(fā)明并沒有局限于特定的配方或方法參數(shù)，其應該有不同。還應該理解用于本文的技術僅僅是為了描述本發(fā)明的特定實施方案，并沒有限定本發(fā)明的意思。盡管有許多類似或等同于本文描述的方法和物質可用于本發(fā)明，本文描述了優(yōu)選的物質和方法。II拴系的蛋白膜蛋白構成了人基因組中總蛋白的重要的部分，表明其調節(jié)多種細胞過程，如生長和分化，細胞間黏附，神經突觸產生，和免疫細胞活化。估計在約20，000已知的人蛋白中(NCBI Human Reference Protein Sequence, 9/10/03),通過 TMHMM 運算法則預計大約24.3%具有跨膜片段(Technical University of Denmark)。其中估計2,658個具有一個跨膜結構域，有531那么多蛋白具有僅通過膜一次的兩個跨膜區(qū)域，信號肽的疏水特性使其常常在常規(guī)的數(shù)據(jù)庫檢索中作為跨膜片段顯示。預計這些具有信號序列的蛋白的大約
0.5%已經含有GPI錨，該GPI錨為一個天然發(fā)生的膜拴系。本質上，本發(fā)明確保使用和研究超過66 %的膜蛋白，作為額外的膜蛋白種類，包括具有多個跨膜結構域，但是具有不連續(xù)的細胞外配體結合區(qū)域和細胞內信號結構域的蛋白，沒有算在內。從而，本文描述的蛋白表達和顯示的普通的方法有助于發(fā)現(xiàn)和研究大多數(shù)膜蛋白的與細胞內及細胞外有關的方面。跨膜受體是完整的膜蛋白，典型的其位于并在細胞質膜中工作，但也存在于一些亞細胞結構和細胞器的膜上。在膜的一側與一個信號傳導分子或有時候與一對這樣的分子結合，跨膜受體在另一側啟動反應。在這種方法中，他們在細胞通訊和信號傳導中起到獨特的和重要的作用。膜蛋白通常具有三個不同的片段:細胞外結構域，跨膜區(qū)域，和細胞內結構域。細胞外結構域是突出于細胞外或細胞內細胞器的腔表面上的膜的蛋白的一部分。如果蛋白的多肽鏈多次穿過雙層，細胞外結構域可以包括幾個突出于膜的“環(huán)”。此區(qū)域有助于配體的結合?？缒^(qū)域貫穿膜。在結構明確的大多數(shù)蛋白中，跨膜的α螺旋組成了跨膜結構域的大部分。在某些蛋白中，如煙堿乙酰膽堿受體，跨膜結構域形成一個通過膜的蛋白線孔，或離子通道。通過結合適當?shù)呐潴w激活細胞外結構域，孔變得對離子可通透，離子隨后通過該通道。在其他蛋白中，跨膜結構域被認為通過結合完成構向改變，其在細胞內發(fā)揮作用。在某些受體中，如7ΤΜ超家族(如GPCR)的成員，跨膜結構域可以含有配體結合袋(關于這類受體已知的這些和其他的一些證據(jù)是部分基于噬菌調理素以及通過結晶學確定的其詳細結構的研究)。受體的細胞內(或細胞質)結構域與細胞或細胞器的內部相互作用，傳遞信號(www.wikipedia.com)。許多跨膜受體與兩個或更多蛋白亞單位組成，當受體結合、分離或他們的“激活”循環(huán)的其他步驟中，該亞單位可操縱的結合或分離。通常根據(jù)其分子結構分類，或者除了一部分，大多數(shù)受體的詳細結構不清楚，根據(jù)其假定的(有時是試驗證實的)膜拓撲結構分類。預計最簡單的多肽鏈僅通過脂質雙層一次，而其他通過七次之多(被稱為G蛋白偶聯(lián))(mwikipedia.com)。I吳蛋白在I吳中具有多種拓撲結構，蛋白的最疏水部分包埋在I吳中。蛋白可以具有一個跨膜成分，其N末端和C末端位于膜的相反兩端，或N末端信號肽被切斷在膜的細胞外部分產生一個新的N末端。在另一個實施方案中，膜蛋白可以具有多個跨膜部分。而且，許多膜蛋白沒有包埋在膜中而是通過共價鍵連接的脂肪酸拴系于膜，該脂肪酸構成脂質雙層的一部分(Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., ff.H.Freeman and Company, New York, 1984)。III生產 拴系蛋白的方法在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于制備拴系的跨膜蛋白的細胞外或細胞內結構域的方法。這些拴系蛋白特別用于通過瞄定流動的雙層膜展示跨膜蛋白的細胞外和細胞內結構域，如，但不局限于，美國專利No6, 228, 326中描述的MembraneChip 中存在的那些，該專利在此引作參考。特別地，膜蛋白拴系于錨上，例如，GPI拋錨點，脂質連接(如豆蘧酰化或棕櫚化)，連接于生物素亞磷酰氨膜脂質的抗生物素蛋白/鏈霉素/神經抗生物素蛋白融合，通過Ni2+膜協(xié)調拴系的六-組氨酸標記蛋白，連接于與谷胱甘肽連接的膜脂質的谷胱甘肽-S-轉染酶融合蛋白，以及連接于與麥芽糖結合的膜脂質的麥芽糖結合蛋白融合蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，膜蛋白被基因工程操縱地含有如下所述的拴系連接。A細胞外結構域膜蛋白的可效仿的細胞外結構域包括人B7-1，I CAM-1, ErbBl，ErbB4，及鼠科的含有α和β多肽鏈的1-Ek 二聚體。細胞間信號傳導是腫瘤重要的基礎，因為為了其生長和維持，腫瘤常常需要細胞間的密切接觸。信號通過的(促)紅細胞生成素產生的肝細胞瘤(Eph)受體(EphRs)是受體酪氨酸激酶(RTKs)最大的家族，表明其在癌發(fā)生中很重要(Dodelet等人，Oncogene (2000) 19:5614-5619)。而且,EphRs 的配體，已知為 Ephrins 是一次通過或GP1-貓定膜蛋白(Cutforth等人,Trends Neurosc1.(2002)25:332-334),反應了通過此受體家族用于跨膜信號傳導的細胞間接觸的重要作用。EphRs/Ephrin信號傳導在血管形成過程中起重要作用，通過該精細的過程，腫瘤形成了維持有氧狀態(tài)的脈管系統(tǒng)。因此血管形成需要細胞間親密的相互作用和信號傳導，其也被認為是腫瘤治療干擾的重要機理(Huang，等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USElOO: 7785-7790)。使用本發(fā)明的方法，可以展示 EphRs 或 Ephrin配體的細胞外結構域，并可以在被覆蓋的完整的細胞上測定通過其同源受體的完整的信號傳導路徑。在腫瘤的一種情況中，合適的EphR/Ephrin配對介導的血管生成可被用于鑒別破壞信號系統(tǒng)的藥物的目的研究。從而，這種展示一個跨膜蛋白的方法可以鑒別和確認新的腫瘤化療藥物。除了組織再生和腫瘤外，免疫激活過程需要廣泛的細胞間相互作用和信號傳導。最終導致細胞因子釋放和激活的T細胞增殖的連續(xù)的步驟需要與APCs的親密接觸。在T細胞/APC相互作用的情況中，細胞間接觸非常緊密，以致被稱為“突觸”這一術語，其非常有助于精確地制定介導免疫反應的T細胞受體、MHC、黏附和共同刺激的分子的模式(Grakoui等人，Science (1999) 285:221-227)。而且，在MHC和特定抗原肽的上下文中的展示ICAM-1的被支持的脂質雙層表明足以形成免疫突觸和覆蓋完整T細胞的骨側(fide)激活(Grakoui等人，Science (1999) 285:221-227)。由于MHC分子、ICAM-1和大部分其他的黏附和共同刺激分子既是一次通過或GP1-瞄定的膜蛋白，展示此蛋白的本發(fā)明的方法提供了研究免疫系統(tǒng)活性的有力的機會。而且，過多的T細胞激活導致了許多嚴重的使衰弱的自體免疫疾病，包括多發(fā)硬化和Crohn氏病，此技術可以導致更好地治療這些免疫性疾病。B細胞內結構域本發(fā)明還有助于通過膜蛋白細胞質區(qū)域的展示研究細胞內信號傳導。RTKs是一個特別的受體的家族，其細胞內信號傳導路徑是抗腫瘤治療的潛在的靶子。表皮生長因子受體，可能是最常 見的RTK，在許多腫瘤中被上調了(Gill等人，Mol.CellEndocrinol (1987) 51:169-186),其是抗體治療 Erbitux 和 Herceptin 的革巴子。由于 RTKs 的細胞質激酶結構域已經被表明當從其細胞外和跨膜區(qū)域被分離時，具有組成活性，其有可能重建發(fā)源自拴系到流動雙層的細胞內結構域的信號傳導路徑，如在MembraneChip 上展示的。在一個實施方案中，RTK的細胞內結構域通過N末端膜錨瞄定到MembraneChip 上，隨后用信號路徑的細胞提取液或純化的成分孵育。在此方法中，體外重建RTK路徑有助于鑒別用難以相信的特異性篩選的小分子藥物。各種RTKs可以在一般的信號傳導機制存在的情況下在MembraneChipTM上排列，其可以鑒別對指定RTK特異的抑制劑。靶RTKs與非靶RTKs平行排列，保證了鑒別影響酪氨酸激酶路徑和可能的抗各種腫瘤活性的高特異的小分子藥物。在一個優(yōu)選的實施方案中，RTK蛋白中的興趣細胞內結構域是酪氨酸激酶結構域。進一步適合的細胞內結構域可以或可以不具酪氨酸激酶活性，這依賴其生物活性的模式，其選自粘合素和如腫瘤壞死因子受體、表皮生長因子受體和干擾素受體的受體。應該理解許多細胞內結構域是本領域已知的，適合用于本發(fā)明。C表達載體在一個優(yōu)選的實施方案中，拴系膜蛋白如以下描述使用表達載體被基因工程構建。將拴系序列，如GPI黏附信號與引起蛋白被細胞翻譯后修飾的基因結合產生了拴系蛋白。例如，當使用GPI黏附信號時，GPI連接導致信號定位。在一個實施方案中，膜蛋白包括膜蛋白的細胞外結構域。細胞外結構域作為配體的結合位點發(fā)揮作用。在另一個實施方案中，膜蛋白包括膜蛋白的細胞內結構域。細胞內結構域作為細胞質蛋白(如，轉換器、激酶、磷酸酶)的結合位點發(fā)揮作用，即，用于研究信號路徑。首先使用本領域已知的方法，通過PCR擴增膜蛋白。為了跨膜蛋白的細胞外結構域，編碼感興趣的細胞外結構域的cDNA而后被克隆至恰當?shù)谋磉_載體的靈活的多克隆位點，以產生pYBSlOl。恰當?shù)谋磉_載體是本領域已知的，是商業(yè)可售的(Invitrogen)。制備并將DNA插入表達載體的方法是本領域已知的(Sambrook, 1989)。應該理解商售的表達載體可以包括調節(jié)序列以及限制性位點。應該理解表達載體可以進一步包括可選擇的標記，如那些具有抗生素抗性的。在一個實施方案中，可選擇的標記是新霉素抗性。如圖1A中所見，pYBSlOl載體包括5’信號序列，純化抗原決定簇標記，以及3’拴系錨序列。信號序列將表達的蛋白定向于細胞表面。恰當?shù)男盘栃蛄惺潜绢I域已知的。在一個實施方案中，信號序列是來自Igk鏈的信號序列，條件是其是被很好定性的?？尚Х碌男盘栃蛄袔缀醢捎糜诒景l(fā)明的每一個分泌蛋白，以及許多膜蛋白。含有信號序列的分泌蛋白和膜蛋白的例子包括表皮生長因子(分泌的)、胰島素(分泌的)、神經生長因子(分泌的)、血小板衍生的生長因子(分泌的)、胰高血糖素(分泌的)、ICAM-1 (膜蛋白)、B7-1 (膜蛋白)、TrkA(膜蛋白)、血小板衍生的生長因子受體(膜蛋白)、以及CD58(膜蛋白)。應該理解，如本領域已知的，基因的密碼子是簡并的，超過一個密碼子可以編碼一個特定的蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，純化的抗原決定簇標記是六-組氨酸?？墒?，應該理解，六-組氨酸以外的其他抗原決定簇標記也可以被使用，如myc, Flag, HA,谷胱甘肽-S-轉染酶，以及麥芽糖結合蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，拴系序列是GPI拴系序列。應該理解，在另一個實施方案中，拴系由結合至生物素?；哪ぶ|的抗生物素蛋白/鏈霉素/神經抗生物素蛋白融合、通過Ni2+膜協(xié)同作用拴系的六-組氨酸標記蛋白、結合至與谷胱甘肽連接的膜脂質的谷胱甘肽-S-轉染酶融合蛋白、以及結合至與麥芽糖連接的膜脂質的麥芽糖結合蛋白融合蛋白。對于膜蛋白的細胞內結構域，將編碼細胞內結構域的cDNA克隆至pYBS201靈活的多克隆位點。如圖1B中所見，如上所述，PYBS201載體包括5’拴系序列和3’純化抗原決定簇標記。編碼膜蛋白的細胞內結構域的cDNA被亞克隆至側面有兩個修飾序列的多克隆位點。在一個實施方案中，栓系序列優(yōu)選豆蘧?；幋a序列。在一個實施方案中，栓系序列來自c-Src蛋白，可是，也可以使用幾乎任何一個N末端豆蘧?；鞍椎南鄳男蛄?。此種蛋白的例子包括酪氨酸激酶的Src家族的其他成員、鈣調蛋白磷酸酶B、蛋白的ADP-核糖基化因子家族的成員、一氧化氮合成酶、以及cAMP-依賴的蛋白激酶?？蛇x擇的，可以使用在5’端(pYBSlOl)或3’端(pYBS201)的腸激酶剪切位點亞克隆cDNA，如果必要，其可以除去純化的標記。除了腸激酶外，也可以使用其他蛋白酶和蛋白酶識別序列，包括但不局限于凝血酶和Xa因子。盡管已知pYBSlOl和pYBS201新霉素抗性基因，可用于選擇穩(wěn)定的轉染細胞，應該理解可以很容易地修飾載體以確保用其他的藥物選擇，包括但不局限于，潮霉素和zeocin。此種增加的靈活性有助于選擇共同表達不同蛋白的轉染細胞，如復合型蛋 白(multimeric complex)。如實施例1和3中所描述的，構建質粒pYBSlOl以生產膜蛋白細胞外結構域的膜拴系型。在實施例3中，膜蛋白的細胞外結構域是人B7-1或ICAM-1。PYBS101質粒是通過修飾pcDNA3.1 (+)的通用表達載體(圖1A)，其含有5’信號序列、六-組氨酸純化抗原決定簇標記、感興趣膜蛋白的細胞外結構域和3’ GPI瞄定序列。如實施例2中所描述的，PYBS201是通過pcDNA3.1 (+)修飾的通用質粒(圖1B)，其含有5’豆蘧酰化編碼序列(衍生自c-Src的N端瞄定氨基酸)和3’六-組氨酸抗原決定簇
T 己 O
通過本領域已知的方法繁殖載體?？梢杂帽绢I域已知的方法評估結構域的表達，例如，使用免疫組化染色、蛋白印跡雜交、和ELISA。而后根據(jù)本領域已知的方法用載體轉染哺乳動物細胞。如實施例3所見，將得到的構建pYBSlOl轉染到哺乳動物細胞，如中國倉鼠細胞(CHO)或HEK-293中，生成瞄定質膜的細胞外結構域和通過C末端GPI錨的拴系。應該理解，用PYBS201轉染產生了瞄定質膜的細胞內結構域和通過N端的豆蘧酰化錨的拴系。還可以通過病毒載體完成在哺乳動物細胞中的表達，其依賴于用于任何指定蛋白的標準轉染試劑的成功性。N末端的六-組氨酸序列的融合有助于快速、高效的在Ni2 +樹脂上純化。使用本發(fā)明的方法觀察到50-75%的轉染效率。在一些實施方案中，使用本發(fā)明至少達到50%的轉染效率。在其他實施方案中，使用本發(fā)明至少達到70-75%的轉染效率。如圖2A所見，在HEK293細胞中ICAM-1的表達是72 %。圖2A表明使用特異的抗人ICAM-1的PE-連接抗體的FASC分析結果。左面一組表明在對照的未轉染細胞中基本上沒有ICAM-1表達，而在用有人ICAM-1的pYBSlOl轉染的細胞中觀察到強表達(右組)。在圖2B中的用FASC的分析中表明相似的人B7-1的表達結果?？梢允褂萌鐖D2C中的SDS-PAGE和蛋白印跡雜交證明栓系蛋白的表達。該圖分別顯示了對應于ICAM-1或B7-1蛋白(左)或免疫反應性(右)的條帶。參考實施例3-11，盡管此處的實施例涉及使用pYBSlOl的膜蛋白細胞外結構域的產生和顯示，應該理解，這些實施例等同于使用PYBS201的膜蛋白細胞內結構域的結合應用。使用純 化抗原決定簇標記純化翻譯后的膜蛋白。在哺乳動物細胞中的表達分別產生了細胞外或細胞內結構域，其通過很容易被Ni2+樹脂純化的拴系拴系到膜上。如實施例4中所描述，根據(jù)已知的方法，抗原決定簇標記連接到小珠或樹脂上。IV 列陣如上所述，通過此處描述的方法形成的拴系蛋白被用于產生和展示脂質雙層列陣上的跨膜蛋白的細胞外和細胞內結構域。細胞外和細胞內結構域可被用作受體或配體結合區(qū)域，用于檢測列陣中的分析物。特別優(yōu)選地，使用本發(fā)明與美國專利No6，228，326中描述的流動的雙層膜。此流動的雙層膜，以下稱MembraneChip ，如那里所描述的，能夠展示活的細胞膜的特性，這有助于使用他研究幾乎調節(jié)細胞生理學每一方面的膜蛋白。發(fā)現(xiàn)這些膜列陣可用于很多應用，包括簡單質量確認/質量對照優(yōu)化研究、醫(yī)學診斷和涉及細胞間反應的藥物發(fā)現(xiàn)。使用此方法展示的細胞內結構域可以使研究整體的完整的信號傳導路徑變得可能。本文描述的展示方法，能夠處理含有不連續(xù)功能性細胞內或細胞外結構域的基因組中的大多數(shù)膜蛋白，從而使無數(shù)的工業(yè)和醫(yī)學臨床中的用于變?yōu)榭蓚}泛。例如，受體酪氨酸激酶(RTKs)，其是細胞生長和分化重要的調節(jié)子，與多種腫瘤有關，使用本發(fā)明的技術其可被瞄定。RTKs的配體誘導的二聚化和自體磷酸化特性能夠如實的被重建，用于指定MembraneChip 環(huán)境的藥物發(fā)現(xiàn)。除了研究膜蛋白調節(jié)的細胞自體狀況外，此技術還可用于示范細胞間的相互作用，包括細胞間黏附和信號傳導。細胞間信號傳導對于調節(jié)細胞增殖和分化、胚胎發(fā)生的器官和組織發(fā)育、神經突觸的建立、血管生成和免疫反應的激活非常重要。基本上，這些細胞間相互作用通過同源的跨膜結合的配體和受體的結合，在并列的細胞中啟動信號級聯(lián)中發(fā)生。不恰當?shù)募毎g聯(lián)系發(fā)生在一些疾病狀態(tài)中，包括腫瘤和自體免疫性疾病，其相關的信號分子是發(fā)現(xiàn)藥物的重要的靶子。在芯片欄中配體結合的膜，其上覆蓋表達膜結合受體的完整的細胞，其優(yōu)點是具有很好定義的、純化成分，能夠同時研究完整的信號傳導路徑。在免疫系統(tǒng)中，例如，展示復合至流動的雙層中的MHC和輔助黏附和共刺激分子的抗原肽可成功地再獲得抗原提呈細胞的能力(APCs)。覆蓋在芯片上展示的抗原肽特異的完整T細胞上，可使其快速激活，有助于T細胞激活路徑中幾乎每個檢測點的瞄定(見，例如Grakoui 等人 Science (1999) 285:221-227，用于討論其相互作用)。MembraneChip 的生理特性使其對于研究需要細胞間接觸的過程非常有用。例如，在有支持的脂質雙層中展示一次穿過膜蛋白的GPI連接的細胞外結構域可作為被覆蓋的完整細胞中的黏附分子和用于識別受體的信號傳導配體，使各種組織生長成為可能。許多研究表面干細胞可在體外通過與特定的組織共同培養(yǎng)分化成各種細胞類型(Prockop等人Proc.Natl.Sc1.USA(2003) 100:11917-11923)。從而，本發(fā)明的膜列陣有助于在工業(yè)規(guī)模上生產器官和組織。因此，通過提供存在于膜蛋白細胞外結構域的特定組織中干細胞分化所需的最小信號，干細胞可在展示這些蛋白的細胞外結構域的MembraneChip 的環(huán)境中培養(yǎng)。實際上，適合于移植或植入到有病器官的生長的人組織對公眾健康是非常有利的，特別是考慮到全國大約73，000人正等待器官移植，每年10，000人死于尸體器官短缺。此列陣還可以特別地用于臨床診斷。感染性疾病變?yōu)獒t(yī)學中一個重要的分支，能夠監(jiān)控抗各種致病菌的疫苗接種的有效性變得非常有意義。通常，接種導致投藥的特定抗原特異性的T細胞的產生。通過展示與致病抗原復合的MHC分子，有可能從病人的血清中分離抗原特異性的T細胞。在一個實施方案中，被免疫一組致病菌的病人提供簡單的血清樣本，其與在流動的雙層列陣上的MHC上展示的相同組混合，有助于指示成功接種的反應T細胞的一次高信息內容的篩選。具有抗原的展示的MHCs也有助于診斷各種自體免疫性疾病。例如，多發(fā)硬化中的自體抗原可以在芯片上被展示以用于檢測認為與疾病病理學相關的特定組群T細胞的存在與否。如實施例10中 所述的，JurkatT細胞選擇的黏附于包括拴系蛋白的雙層膜。如圖3A中所見，至少比對照多4X的Jurkat T細胞黏附至展示人B7-1蛋白的MembraneChip 上。對于展示人ICAM蛋白的MembraneChip ,觀察到至少多3X的黏附。而且，Jurkat T細胞的黏附可以分別被被預先與抗人B7-1和ICAM-1的細胞外結構域的單克隆抗體孵育的MembraneChip 抑制(圖3B)，表明展示蛋白的黏附特異性。圖3B是用或不用抗體阻斷的對照、具有拴系的ICAM-1蛋白的膜、具有拴系的B7-1蛋白的膜的Jurkat T細胞黏附的圖?？梢杂妹總€領域的細胞數(shù)測定黏附。如圖3B所見，使用抗體阻斷比不使用抗體阻斷至少少8X的Jurkat T細胞黏附。圖3表明抗原特異性T細胞在具有或不具有ICAM-U1-Ek-PCC抗體阻斷以及空膜對照中向MembraneChip 的黏附。在另一個實施方案中，雙層可以包括兩個或多個栓系蛋白。如實施例10中所述，用ICAM-1或1-Ek-PCC拴系蛋白制備MembraneChip 。在這種方式中，可以以同一個MembraneChip 組合物檢測超過一個分析物。兩種蛋白均保留功能。如圖3A所見，用抗1-Ek-抗體預處理后與沒用單克隆抗體處理的MembraneChip 相比大約一半的細胞黏附至ICAM-1/IEk-PCC。本發(fā)明的方法為質量確定和對照應用提供了有效地設備。已被鑒別具有對抗使用本方法展示的任何膜蛋白的活性的藥物(包括但不局限于小分子、抗體、和生物制劑)能夠很容易的使用此技術鑒別和優(yōu)化。此技術的列陣形式非常有助于特異性和敏感性的研究，其與許多不同的檢測系統(tǒng)兼容，包括如美國專利公布N0.20040053337中描述的無標記方法和表面等離子共振。在此方法中，可以快速獲得活性藥物的親和性檢測，有助于進一步優(yōu)化和確認。從而，本發(fā)明的膜蛋白展示方法對于許多不同的領域非常有利。表I免疫學的膜蛋白
權利要求
1.一種產生為了在脂質雙層陣列上展示的跨膜蛋白的拴系的細胞外或細胞內結構域的方法，其包括 a)制備包括5’信號序列，純化的抗原決定簇標記，膜蛋白細胞外結構域的編碼序列和為了將膜蛋白的細胞外結構域瞄定或連接至脂質雙層膜的3’錨序列的可操作的表達載體；以及 用所述表達載體體外轉染哺乳動物細胞，以產生靶向質膜的細胞外結構域的錨拴系蛋白；或 b)制備包括5’豆蘧酰化編碼序列，膜蛋白細胞內結構域的編碼序列和3’純化的抗原決定簇標記的可操作的表達載體；和 用所述表達載體體外轉染哺乳動物細胞以產生靶向膜的細胞內結構域的豆蘧酰化的掛系蛋白；及 c)在脂質雙層陣列上展示(a)或(b)的細胞膜。
2.根據(jù)權利要求I的方法，其中所述3’錨序列是GPI錨序列。
3.根據(jù)權利要求2的方法，其中所述GPI錨序列含有SEQID N0:3。
4.根據(jù)前述任何一項權利要求的方法，其中所述哺乳動物細胞選自CHO或HEK-293細胞。
5.根據(jù)權利要求1-3任何一項的方法，其中所述信號序列選自由表皮生長因子、胰島素、神經生長因子、血小板衍生的生長因子、胰高血糖素、ICAM-l、B7-l、TrkA、血小板衍生的生長因子受體或⑶58組成的蛋白。
6.根據(jù)權利要求1-3任何一項的方法，其中所述純化的抗原決定簇標記是六-組氨酸抗原決定簇標記。
7.根據(jù)權利要求1-3任何一項的方法，其中所述豆蘧?；幋a序列是c-Src豆蘧酰化編碼序列。
8.一種用于產生為了在脂質雙層陣列上展示的拴系的細胞外結構域蛋白的可操作表達載體，其包括 5’信號序列， 純化的抗原決定簇標記， 膜蛋白細胞外結構域的編碼序列，和 為了將膜蛋白的細胞外結構域瞄定或連接至存在于脂質雙層陣列中的脂質雙層膜的3’錨序列。
9.根據(jù)權利要求8的用于產生為了在脂質雙層陣列上展示的拴系的細胞外結構域蛋白的可操作表達載體，其中所述錨序列是GPI序列。
10.根據(jù)權利要求8或9的用于產生為了在脂質雙層陣列上展示的拴系的細胞外結構域蛋白的可操作表達載體，其中所述純化抗原決定簇標記是六-組氨酸抗原決定簇標記。
11.一種用于產生為了在脂質雙層陣列展示的拴系的細胞內結構域蛋白的可操作的表達載體，其包括 5’豆蘧酰化編碼序列； 膜蛋白的細胞內結構域的編碼序列；和 3’純化抗原決定簇標記，其中5’豆蘧?；蛄性试S展示在脂質雙層陣列中的膜蛋白的細胞內結構域。
12.根據(jù)權利要求11的用于產生為了在脂質雙層陣列展示的拴系的細胞內結構域蛋白的可操作的表達載體，其中所述純化抗原決定簇標記是六-組氨酸抗原決定簇標記。
13.根據(jù)權利要求1-3任何一項的方法，其進一步包括純化所述的錨栓系蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產拴系蛋白的方法，具體而言，本發(fā)明涉及一種新的使用表達載體生產拴系的(tethered)跨膜蛋白細胞外或細胞內結構域的方法。本發(fā)明還提供了用于此領域的表達載體。
文檔編號C12N15/62GK103255167SQ201310091458
公開日2013年8月21日 申請日期2005年2月9日 優(yōu)先權日2004年2月9日
發(fā)明者V·山崎, O·西連科, J·T·格羅夫斯 申請人:西納門公司