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一種融合蛋白基因TAT-sVP7及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):423668閱讀:332來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):一種融合蛋白基因TAT-sVP7及其應(yīng)用的制作方法
—種融合蛋白基因TAT-SVP7及其應(yīng)用本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域,更具體涉及到一種融合蛋白基因TAT-SVP7,還涉及到一種融合蛋白基因TAT-SVP7在制備治療或預(yù)防草魚(yú)呼腸孤病毒口服藥物中的應(yīng)用。以水稻愈傷組織細(xì)胞作為生物反應(yīng)器,采用融合表達(dá)的技術(shù)策略,將構(gòu)建的組成型植物表達(dá)載體通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法,導(dǎo)入水稻愈傷組織細(xì)胞,在水稻愈傷組織細(xì)胞中高效表達(dá)和大量積累融合蛋白。
背景技術(shù)
草魚(yú)(Ctenopharyngon idellus)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)淡水養(yǎng)殖品種,其年養(yǎng)殖量約已占我國(guó)淡水養(yǎng)殖總量的20%。草魚(yú)出血病是危害草魚(yú)種的主要病害,流行于我國(guó)主要淡水養(yǎng)殖區(qū),可導(dǎo)致草魚(yú)種大量死亡,死亡率在70%以上,給養(yǎng)殖戶(hù)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重影響了我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展(Fang Q, Seng EK, Ding QQ, Zhang LL(2008)Characterization of infections particles of grass carp reovirus by treatmentwith proteases.Arch Viroll53:675_682)。GCRV 是引起草魚(yú)出血病的主要病原。GCRV是一種直徑70nm的球狀病毒,有雙層衣殼,無(wú)囊膜。研究表明,決定病毒進(jìn)入細(xì)胞的是其外層蛋白質(zhì)衣殼。VP7與VP5形成的異源二聚體是外衣殼主要的結(jié)構(gòu)蛋白,VP6則連接內(nèi)、外蛋白層。VP5的抗體可對(duì)GCRV產(chǎn)生中和作用,但VP7抗體的中和作用是VP5抗體的 3 倍(Shao L, Sun X, Fang Q (2011) Antibodies against outer-capsid proteinsof grass carp reovirus expressed in E.coli are capable of neutralizing viralinfectivity.Virol j8:347)。研究發(fā)現(xiàn),基于VP7構(gòu)建的核酸疫苗對(duì)草魚(yú)GCRV具有較好的免疫保護(hù)(He Y X,Yang Q, Xu HX, Wu H, Wu FY, Lu LQ (2011) Prokaryotic expressionand purification of grass carp reovirus capsid protein VP7and its vaccinepotential.Afr J Microbiol Res5 (13): 1643-1648)。因此,VP7 是開(kāi)發(fā) GCRV 疫苗最佳靶標(biāo)。免疫預(yù)防是有效防治GCRV導(dǎo)致草魚(yú)出血病的方法之一,因此疫苗研制對(duì)于控制該病意義重大。在漁 用疫苗中,口服免疫途徑是一種最為方便和引起魚(yú)體應(yīng)激最小的途徑(李新華,沈錦玉,潘曉藝,郝貴杰.魚(yú)類(lèi)口服免疫的研究進(jìn)展,水產(chǎn)科學(xué),2010,29(1):51-56)。用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研制的口服疫苗會(huì)更加符合草食性魚(yú)類(lèi)的特點(diǎn),也有利于該疫苗的推廣應(yīng)用。合適的黏膜免疫佐劑,可增強(qiáng)黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。如穿膜肽Tat (transcriptional activator protein)是一種帶正電荷的短肽,是一些具有細(xì)胞膜穿透能力的小分子多肽,可有效攜帶比其分子質(zhì)量大100倍的外源性疏水大分子進(jìn)入細(xì)胞,且對(duì)宿主細(xì)胞沒(méi)有顯著毒副作用(Rosales-Mendoza S, Rubio-1nfanteN, Govea-Alonso DO, Moreno-Fierros L.Current status and perspectives ofplant-based candidate vaccines against the human immunodeficiency virus(HIV).Plant Cell Rep2012, 31:495-511.) TAT 是由 11 個(gè)氨基酸組成,其序列為 YGRKKRRQRRR,該段等電點(diǎn)12.7,為堿性多肽,轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快,效率高。TAT可以將與之相連的多肽或全長(zhǎng)蛋白質(zhì)在數(shù)分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞,而且在體內(nèi)可以通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)輸至魚(yú)體免疫生發(fā)中心一前腎。因此,利用植物細(xì)胞生產(chǎn)含有TAT與VP7的GCRV 口服疫苗可能會(huì)成為預(yù)防草魚(yú)出血病的最佳選擇,也符合水生動(dòng)物的特點(diǎn),也有利于該疫苗的推廣應(yīng)用,具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種融合蛋白基因TAT-SVP7,其序列為SEQ ID N0.1所示。該基因的密碼子根據(jù)真核生物基因密碼子偏好性進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后TAT-SVP7基因密碼子,更加符合真核生物基因表達(dá)特點(diǎn),表達(dá)的重組蛋白量高,且更有活性。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種含有融合蛋白基因TAT-SVP7的大腸桿菌基因工程菌,分類(lèi)命名:大腸桿菌 BL21(DE3)hsdS gal pET28a_TAT_sVP7,Escherichia coliBL21(DE3)hsdS gal pET28a-TAT_sVP7CCTCC N0:M2013084。該菌已于 2013 年 3 月 14 日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏,地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。該菌繁殖速度快,擴(kuò)大培養(yǎng)容易,環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)。本發(fā)明還有一個(gè)目的是在于提供了一種含有融合蛋白基因TAT-SVP7的重組農(nóng)桿菌基因工程菌,分類(lèi)命名:農(nóng)桿菌EHA105Act-TAT-sVP7,Agrobacteriumsp.EHA105Act-TAT-sVP7CCTCC N0:M2013083,該菌已于 2013 年 3 月 14 日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏,地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。該菌具有將重組融合蛋白基因整入到植物細(xì)胞的核遺傳物質(zhì)中,且整合效率高,對(duì)植物細(xì)胞無(wú)損傷。本發(fā)明最后一個(gè)目的是在于提供了一種含有融合蛋白基因TAT-SVP7的重組農(nóng)桿菌基因工程菌在制備治療或預(yù)防草魚(yú)呼腸孤病毒口服藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:1.獲得水稻密碼子優(yōu)化的GCRV外衣殼蛋白sVP7基因;

為了使重組蛋白在水稻愈傷細(xì)胞中獲得較高的表達(dá),采用了水稻偏愛(ài)的遺傳密碼子,從美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因庫(kù)里獲得了成熟的GCRV的VP7基因序列信息(GenBank AF403394)所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列,由DNA分析軟件(Gene Runner)將VP7基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成含有優(yōu)化水稻遺傳密碼子的核苷酸序列,人工合成VP7基因,記為sVP7,其序列為SEQ N0.3所示的核苷酸序列。2.融合基因TAT-SVP7的制備及表達(dá)載體的構(gòu)建:(I)TAT核苷酸片段的生成上游引物I條,下游引物I條,一次聚合合成。TAF:GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAGCGTCGACGCGGTGGAGGTGGATCT ;TAR:ATCATGTGAAGTGGAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCAC ;先分別配成IOuMol.L_\等量混合后,95°C加熱IOmin后,室溫冷卻Ih后,即得到細(xì)胞穿膜肽TAT及柔性聯(lián)系序列。將其和sVP7片段等量混合作為PCR擴(kuò)增的模板。(2) TAT與sVP7基因柔性對(duì)接上游引物,GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAG;下游引物,GGATCCTTATCATAGCTCATCTTTCTC ;退火溫度 56°C進(jìn)行 PCR, PCR 擴(kuò)增目的基因 TAT_sVP7,其序列為SEQ ID N0.1所示。PCR產(chǎn)物通過(guò)DNA凝膠電泳檢測(cè),回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到PGEM-T載體(在PiOmega公司購(gòu)置)中,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TP10,挑取單菌落培養(yǎng),用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,并進(jìn)行測(cè)序,得到的陽(yáng)性克隆子即為包含TAT-SVP7基因的大腸桿菌,該質(zhì)粒命名為pGEM-TAT-sVP7。 (3)質(zhì)粒pET-28a (+)(在INVITR0GEN公司購(gòu)置),經(jīng)BamHI酶切后,并經(jīng)堿性磷酸酶處理后,再用瓊脂糖膠切膠回收,回收的載體記為:pET-28a-B-C。用BamHI酶切pGEM-TAT-sVP7質(zhì)粒,目的片段TAT_sVP7和開(kāi)環(huán)的pET-28a-B_C在16°C連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞,用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,并進(jìn)行測(cè)序,得到的陽(yáng)性克隆子即為包含TAT-SVP7基因的大腸桿菌,該質(zhì)粒命名為pET-28a-TAT-sVP7。3.大腸桿菌基因工程菌的制備和融合蛋白TAT-SVP7的表達(dá)(I)將質(zhì)粒pET-28a-TAT_sVP7轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。PCR鑒定篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,所得陽(yáng)性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠融合表達(dá)TAT-SVP7的重組基因工程菌株 Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT_sVP7。(2)重組基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT_sVP7 的單菌落接種到IOml新鮮液體LB (含終濃度為50 μ g/ml卡那霉素)培養(yǎng)基中。37°C 150rpm搖床培養(yǎng)過(guò)夜。無(wú)菌條件下,從培養(yǎng)過(guò)夜的菌中,取出2ml菌液接種到200ml的新鮮液體LB中,370C 200rpm搖床培養(yǎng)至0D600為0.8時(shí)(約4h)加入終濃度為0.5mM IPTG,37°C誘導(dǎo)4h后,離心6000g,4°C,IOmin收集菌體,用IOmM PBS (pH8.0)重懸超聲波破壁,離心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。以?xún)?yōu)化后的條件擴(kuò)大培養(yǎng),超聲波破壁后,離心12000g,4°C,20min收集沉淀,并用尿素變性液在4°C冰箱中溶解處理過(guò)夜,4°C離心12000g,30min收集上清。融合蛋白TAT_sVP7的純化按N1-NTA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純化結(jié)果。得到純化的TAT-SVP7蛋白,其序列為SEQ ID N0.2所示。一種大腸桿菌基因工程菌株,其特征在于,該菌株為重組基因工程菌株,分類(lèi)命名:大腸桿菌 BL21(DE3)hsdS gal pET28a_TAT_sVP7,Escherichia coli BL21 (DE3)hsdSgal pET28a-TAT-sVP7CCTCC N0:M201`3084。該菌已于2013年3月14日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏,地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。該菌株有以下特征,最適生長(zhǎng)溫度為37°C,菌落邊緣整齊,表面有光澤、濕潤(rùn)、光滑、呈灰白色。培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基配方:IL溶液中,Tryptone(胰蛋白胨):10g;YeastExtract (酵母提取物):5g;NaCl (氯化鈉):10g,再加入16g Agar (瓊脂)ρΗ7.2,培養(yǎng)溫度在32-39°C均可生產(chǎn),但最適培養(yǎng)溫度37°C,卡那霉素抗性,好氧性細(xì)菌。4.TAT-SVP7融合基因?qū)朕D(zhuǎn)基因載體,構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌;將上述目的片段TAT-SVP7與轉(zhuǎn)基因載體ACT(本實(shí)驗(yàn)室留存)通過(guò)BamHI酶切位點(diǎn)相聯(lián)(T4DNA連接酶(NEB公司購(gòu)買(mǎi)),16°C,連接12h,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)PCR鑒定正反向。將插入正確的TAT-sVP7_ACT導(dǎo)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefa ciensSP.)EHA105o一種重組農(nóng)桿菌基因工程菌株,其特征在于,該菌株為重組基因工程菌株 Agrobacteriu m tumefaciens SP.EHA105ACT-TAT-sVP7,分類(lèi)命名農(nóng)桿菌EHA105Act-TAT-sVP7,Ag robacterium sp.EHA105Act-TAT-sVP7CCTCC N0:M2013083。該菌已于2013年3月14日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏,地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。該菌株有以下特征,最適生長(zhǎng)溫度為26 °C,菌落邊緣整齊,表面濕潤(rùn)、光滑、呈白色不透明。培養(yǎng)基=YEB培養(yǎng)基配方:1L溶液中,蛋白胨:5.0g;酵母提取物:1.0g;牛肉膏:
5.0g;蔗糖5.0g;MgSO4.7Η200.5g;再加入16g Agar (瓊脂)。其培養(yǎng)基的最適ρΗ7.2,培養(yǎng)溫度25-31°C,但最適培養(yǎng)溫度28°C,卡那霉素抗性,好氧性菌株。一種含有融合蛋白基因TAT-SVP7的重組農(nóng)桿菌基因工程菌在制備治療或預(yù)防草魚(yú)呼腸孤病毒口服藥物中的應(yīng)用,其應(yīng)用過(guò)程是:利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法,經(jīng)共培養(yǎng)和抗性篩選,獲得大量的轉(zhuǎn)基因水稻愈傷細(xì)胞系,再經(jīng)繼代,⑶S顯色和PCR分子鑒定,獲得了 26個(gè)水稻轉(zhuǎn)基因愈傷細(xì)胞系。從每個(gè)水稻愈傷細(xì)胞系中取出一部分材料,利用蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)——酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(武漢博士德公司)檢測(cè)技術(shù),篩選高表達(dá)重組TAT-SVP7的轉(zhuǎn)基因愈傷細(xì)胞系。高表達(dá)重組TAT-SVP7的水稻轉(zhuǎn)基因愈傷細(xì)胞系,經(jīng)NB和N6培養(yǎng)基進(jìn)行交替培養(yǎng),收獲水稻轉(zhuǎn)基因愈傷細(xì)胞,經(jīng)凍干機(jī)凍干,即為草魚(yú)GCRV的口服疫苗,可以直接或拌餌投喂草魚(yú),拌餌量為15%,草魚(yú)攝食轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織凍干粉后,產(chǎn)生了有效免疫保護(hù),保護(hù)率達(dá)到70.18%。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明利用基因工程的方法,利用水稻愈傷組織細(xì)胞作為載體,借助植物轉(zhuǎn)基因的技術(shù)平臺(tái),實(shí)現(xiàn)在水稻愈傷組織細(xì)胞中高效表達(dá)細(xì)胞穿膜肽TAT與GCRV外衣殼VP7的融合蛋白,細(xì)胞穿膜肽具有協(xié)助后面的重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞,增強(qiáng)了重組融合蛋白直接進(jìn)入魚(yú)體消化道粘膜機(jī)會(huì),減少了被消化道中消化酶的消化降解作用,并加以直接利用,供草魚(yú)直接口服免疫接種,實(shí)現(xiàn)魚(yú)用疫苗的生產(chǎn)和免疫接種的有機(jī)統(tǒng)一,不僅簡(jiǎn)化了重組蛋白的純化工序,還克服了因表達(dá)體系不同而引起的蛋白糖苷化修飾的不同。本發(fā)明提供的GCRV 口服疫苗,直接口服免疫接種草魚(yú)魚(yú)種,使魚(yú)體在吞食餌料的同時(shí),也實(shí)現(xiàn)了免疫接種。該口服植物疫苗,不僅使用方便,實(shí)用性強(qiáng),成本低,擴(kuò)大生產(chǎn)容易,具有廣闊的應(yīng)用前景。

本項(xiàng)目的生產(chǎn)的植物疫苗,疫苗的載體為水稻愈傷,草魚(yú)可以直接攝食,即是食物也是疫苗,對(duì)草魚(yú)機(jī)體無(wú)損傷,無(wú)毒副作用,使用方便,可以單獨(dú)投喂,也可拌在飼料中投喂,省時(shí)省力,可解決大水面(如湖泊、水庫(kù)、河流)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)和大批量魚(yú)類(lèi)的免疫接種難題。生產(chǎn)的疫苗可以常溫存放,減少了常規(guī)疫苗需低溫存放和低溫運(yùn)輸?shù)臒┈嵑唾M(fèi)用。本專(zhuān)利生產(chǎn)的植物疫苗,有別于一般的細(xì)菌(原核)為載體的口服疫苗,需人工注射或拌飼料,使用不方便。同時(shí),該疫苗的生產(chǎn)利用的是真核生物,重組蛋白在表達(dá)過(guò)程中,經(jīng)過(guò)了糖基化等修飾,因此,重組蛋白的活性比原核生物更強(qiáng),特性更好。


:圖1為sVP7基因的合成電泳示意圖。圖1中:M,DL2000分子標(biāo)準(zhǔn);1,pUC18_sVP7質(zhì)粒經(jīng)經(jīng)BamHI酶切.
圖2為一種TAT-SVP7原核誘導(dǎo)表達(dá)及其融合蛋白的純化電泳示意圖。圖2中a:pET28a-TAT-sVP7誘導(dǎo)前后菌體總蛋白情況;1,誘導(dǎo)前的總蛋白;2,誘導(dǎo)后的總蛋白;圖2中b:融合蛋白的純化;1,菌體超聲處理后上清中的總蛋白;2,菌體超聲處理后下部分的蛋白;3,純化后的TAT-SVP7融合蛋白。
圖3為一種TAT-SVP7合成及其轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建電泳示意圖TAT-SVP7導(dǎo)入到植物轉(zhuǎn)基因載體,并生產(chǎn)水稻組成型表達(dá)的載體;圖3中a:TAT-sVP7融合片段的生成。M,DL2000的DNA標(biāo)準(zhǔn);1,TAT片段;2,合成的sVP7片段;3,TAT-sVP7融合片段;圖3 中 b:TAT-sVP7 轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建;Μ1, λ DNA 的 Hind III的 DNA 標(biāo)準(zhǔn);M2, DL2000的DNA標(biāo)準(zhǔn);C,轉(zhuǎn)基因載體的母體經(jīng)BamHI酶切;1,構(gòu)建的含TAT_sVP7的轉(zhuǎn)基因載體經(jīng)BamHI酶切。圖4為一種水稻愈傷 組織細(xì)胞系PCR鑒定和Western blot定性檢測(cè)分析示意圖。圖4中a =GCRV的TAT_sVP7融合基因在不同水稻愈傷組織細(xì)胞系中的PCR鑒定;圖4中b =GCRV的TAT_sVP7融合蛋白在不同水稻愈傷組織細(xì)胞系中的Westernblot檢測(cè)。M, DNA分子標(biāo)準(zhǔn)(DL2000) ; CO,無(wú)樣品的PCR對(duì)照;V,轉(zhuǎn)基因植物載體;C1,正常水稻愈傷細(xì)胞;1_7,分別為不同的水稻愈傷組織樣品。TAT-SVP7,TAT-SVP7融合基因融合表達(dá)的蛋白。圖5為一種水稻愈傷組織細(xì)胞系胚性狀態(tài)調(diào)整示意圖。圖5中a:篩選的水稻愈傷組織細(xì)胞系在同一 N6培養(yǎng)基上繼代情況;圖5中b:篩選的水稻愈傷組織細(xì)胞系進(jìn)行N6和NB培養(yǎng)基交替繼代的情況。圖6為一種水稻轉(zhuǎn)基因愈傷組織細(xì)胞系的凍干材料示意圖。圖7為一種GCRV攻毒實(shí)驗(yàn)示意圖。圖7中C:攝食普通非轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織的草魚(yú),經(jīng)攻毒后出現(xiàn)的癥狀;圖7中TAT-SVP7:攝食含有TAT_sVP7的轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織的草魚(yú),經(jīng)攻毒后出現(xiàn)的癥狀。
具體實(shí)施方式
:本實(shí)驗(yàn)中所涉及的分子生物學(xué)方法為常規(guī)方法,為本領(lǐng)域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳細(xì)闡述的請(qǐng)參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》J.薩姆布魯克,D.W.拉塞爾等主編。實(shí)施例1:融合基因TAT-SVP7的制備I)從美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因庫(kù)里獲得了成熟的GCRV的VP7(GenBank:AAM92742.1)所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列信息,由DNA分析軟件(Gene Runner)將VP7基因(GenBank AF403394)的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成含有優(yōu)化水稻遺傳密碼子的核苷酸序列,人工合成VP7基因,記為sVP7,其序列為SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列,人工合成(南京金斯瑞生物科技公司合成)。經(jīng)密碼子優(yōu)化后的sVP7基因的核苷酸序列改變了 23.5%,遺傳密碼改變了 74.5%。2) TAT核苷酸片段的生成上游引物I條,下游引物I條,一次聚合合成。TAF:GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAGCGTCGACGCGGTGGAGGTGGATCT ;TAR:ATCATGTGAAGTGGAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCAC先將兩條引物分別配成IOuMol.L—1,等量混合后,95°C加熱IOmin后,室溫冷卻Ih后,生成TAT核苷酸片段,4°C保存?zhèn)溆谩F渖傻募?xì)胞穿膜肽TAT及柔性聯(lián)系序列為:
GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAGCGTCGACGCGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTCCACTTCACATGATTCCG。3) TAT與sVP7的柔性融合以TAT和人工合成的sVP7為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增得TAT-VP7融合基因。在引物中加ABamH I酶切位點(diǎn),以利于后續(xù)的重組質(zhì)粒構(gòu)建工作。設(shè)計(jì)的特異引物序列為:上游引物:5,一GG GGA TCC ATG ATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAG — 3,BamH I下游引物:5’一 GG GGA TCC TTA TCATAGCTCATCTTTCTC — 3’BamH IPCR反應(yīng)的總體積為50 μ I。PCR擴(kuò)增條件為:熱啟動(dòng)(94°C,5min),繼續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán),每一循環(huán)的程序?yàn)?4°C,30sec ;56°C,30sec ;72°C , 30sec,最后一個(gè)延伸反應(yīng)(72°C,5min)。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μ I在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳,EB染色后,紫外燈下觀(guān)察,拍照。擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR純化試劑盒純化。實(shí)施例2 =PCR產(chǎn)物的回收、純化及質(zhì)粒pMD18-TAT_sVP7的構(gòu)建將實(shí)施例1中得到的TAT-SVP7,在瓊脂糖凝膠上電泳,在紫外燈下迅速切下欲回收的條帶,用Trans瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化,將單一的目的DNA條帶放入干凈的Eppendorf管中,稱(chēng)取重量。按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收操作。將回收、純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T (在Takara公司購(gòu)置)連接,連接體系如下:
pMD18_T Vector 1.0 μ I純化的TAT+sVP7 3.0dH201.0混勻后,再加入5.0 μ I的連接溶液I (Solution I)(在Takara公司購(gòu)置,D6020S)16°C,連接過(guò)夜。實(shí)施例3:pMD18-TAT-sVP7工程菌的構(gòu)建I)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞采用TP10,其步驟和方法,按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞:其步驟是:2)在無(wú)菌條件下取連接反應(yīng)液10 μ 1,加入到100 μ I大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕混勻,冰浴30min。42°C水浴中熱激90sec,速移至冰水中2_3min。無(wú)菌下,加入600 μ I液體LB培養(yǎng)基,37°C,IOOrpm輕搖,溫浴45min使細(xì)胞復(fù)蘇。取上述菌液150μ 1,用無(wú)菌三角玻棒均勻涂布在50 μ g/ml Kan的LB平板上,正向放置l_2h,直至液體被全部吸收,倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。由此法可得到E.coli TP10pMD18-TAT-sVP7菌落。實(shí)施例4:融合基因的制備及表達(dá)載體的構(gòu)建挑取單克隆E.coli TP10pMD18-TAT-sVP7于IOml新鮮液體LB培養(yǎng)基中,37°C,150rpm搖床培養(yǎng)過(guò)夜,按分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行提取質(zhì)粒。用BamHI分別酶切pMD18-TAT-sVP7和pET_28a,目的片段TAT_sVP7與開(kāi)環(huán)pET_28a膠回收后16°C連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法同上。選取5個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,鑒定TAT-SVP7插入到pET-28a載體中的方向和序列信息,分析編碼框的完整性。實(shí)施例5:大腸桿菌基因工程菌的制備
將鑒定正確的質(zhì)粒pET-28a-TAT-sVP7(1.0ul)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。PCR鑒定篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,所得陽(yáng)性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠融合表達(dá)TAT-SVP7 的重組基因工程菌株,大腸桿菌 BL21(DE3)hsdS gal pET28a-TAT_sVP7CCTCCN0:M2013084o實(shí)施例6:基因工程融合蛋白TAT-SVP7的誘導(dǎo)表達(dá)和純化重組基因工程菌株Escherichiacoli BL21 (DE3)hsdS gal pET-28a-TAT_sVP7 的單菌落接種到IOml新鮮液體LB (含終濃度為50ug/ml卡那霉素)培養(yǎng)基中。37°C 150rpm搖床培養(yǎng)過(guò)夜。無(wú)菌條件下,從培養(yǎng)過(guò)夜的菌中,取出2ml菌液接種到200ml的新鮮液體LB中,37°C 200rpm搖床培養(yǎng)至0D600為0.8時(shí)(約4h)加入終濃度為0.5mM IPTG, 37°C誘導(dǎo)4h后,離心6000g,4°C,IOmin收集菌體,用IOmM PBS (pH8.0)重懸超聲波破壁,離心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。以?xún)?yōu)化后的條件擴(kuò)大培養(yǎng),超聲波破壁后,離心12000g,4°C,20min收集沉淀,并用尿素變性液在4°C冰箱中溶解處理過(guò)夜,4°C離心12000g,30min收集上清。融合蛋白TAT_sVP7的純化按N1-NTA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純化結(jié)果。得到純化的TAT-SVP7蛋白,其序列為SEQ ID N0.2所示。實(shí)施例7:融合蛋白TAT-SVP7的抗體制備;純化的TAT-SVP7融合蛋白與弗氏不完全佐劑等量混合,腹腔注射Bal/C小白鼠5只,間隔2周免疫I次,共三次,最后I次免疫后第7天,從小白鼠眼眶取少量的血,37°C溫箱中作用2h后,4°C放置過(guò)夜,取上清采用ELISA檢測(cè)效價(jià)。如達(dá)到1:10000,就可大量取血,同上制備血清。TAT-SVP7的鼠源抗血清,4°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例8:TAT-sVP7融合基因?qū)朕D(zhuǎn)基因載體,構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因載體;將目的片段TAT-SVP7與轉(zhuǎn)基因載體ACT,通過(guò)BamHI酶切位點(diǎn)相聯(lián),T4DNA連接酶(NEB公司購(gòu)買(mǎi)), 16°C,連接12h,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TPlO感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)PCR鑒定正反向。將插入正確的TAT-sVP7_ACT導(dǎo)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。獲得了一種重組農(nóng)桿菌,分類(lèi)命名農(nóng)桿菌EHA105Act-TAT-sVP7,Agrobacteriumsp.EHA105Act-TAT-sVP7CCTCC N0:M2013083。實(shí)施例9:構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌將鑒定方向正確的TAT-SVP7-ACT通過(guò)電激轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105.電擊議的實(shí)驗(yàn)參數(shù)為:2.5KV,電泳沖25 μ F,電阻400歐。實(shí)施例10:農(nóng)桿菌與水稻愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)、篩選和繼代;Α.愈傷組織的誘導(dǎo)1.剝?nèi)シN子的外穎、內(nèi)穎,選擇成熟飽滿(mǎn)的水稻世錦B(SJB)種子,裝入50ml離心管。2.蒸懼水30ml清洗3次,70%乙醇浸泡2min,蒸懼水清洗3次,再用0.15%HgCl2浸泡15_20min,同時(shí)IOOrpm振蕩。3.在無(wú)菌臺(tái)打開(kāi)離心管,倒出HgCl2,用無(wú)菌水清洗種子4、5次后,把種子倒在滅菌的濾紙,放置約lh。4.將種子置入N6固體培養(yǎng)基(10粒/25ml/瓶),種胚朝上或接觸培養(yǎng)基,28°C,暗
培養(yǎng)4周。5.觀(guān)察誘導(dǎo)的愈傷,把淡黃色、致密的胚性愈傷與小盾牌分離后,轉(zhuǎn)入新的N6,繼代培養(yǎng)2周。B.前培養(yǎng)選擇致密、相對(duì)干燥的胚性愈傷轉(zhuǎn)移至新的N6培養(yǎng)基上,28°C下暗培養(yǎng)2天。C.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和懸浮1.將適量農(nóng)桿菌涂布接種在含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上,對(duì)于LBA4404,28°C下暗培養(yǎng)36h即可。2.向50ml離心管加入30mll/2N6AS。然后,取滅菌小勺刮取農(nóng)桿菌,用勺背面將菌體貼在管壁輕輕拍散,使細(xì)菌懸液的0D_達(dá)到0.8 1.0。D.感染和共培養(yǎng)1.感染:把經(jīng)過(guò)前培養(yǎng)的愈傷集中至一個(gè)平皿,一次性轉(zhuǎn)入菌液中,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)管子使菌液均勻分布,感染時(shí)間約15 - 25min。2.共培養(yǎng):將菌液倒出,把愈傷在無(wú)菌濾紙上放置2h,保證菌液被吸干,接至1/2N6AS 中,20°C,暗培養(yǎng) 1.5_2d。E.農(nóng)桿菌的去除1.將共培養(yǎng)的愈傷裝入50ml離心管,用無(wú)菌水清洗3次以上,至液體比較清亮。2.最后一次倒出無(wú)菌水,加入含有頭孢霉素(500mg/L)的N6液體培養(yǎng)基,于IOOrpm 下,振蕩 15_20min,重復(fù) 2-3 次。1.將愈傷倒在無(wú)菌濾紙上吸干2h以`上。F.愈傷組織的篩選1.將干燥愈傷轉(zhuǎn)入含有頭孢霉素(250mg/L)的N6培養(yǎng)基中,28°C暗培養(yǎng)7_10d。2.將沒(méi)有被農(nóng)桿菌污染的愈傷轉(zhuǎn)入含有頭孢霉素(250mg/L)和潮霉素(50mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于超量表達(dá)載體)或含有頭孢霉素(250mg/L)和G418 (25mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于轉(zhuǎn)基因沉默載體),28°C暗培養(yǎng)15 20d。3.將愈傷轉(zhuǎn)入僅含有潮霉素(50mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于超量表達(dá)載體)或含有G418 (50mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于轉(zhuǎn)基因沉默載體),28°C暗培養(yǎng)15 20d。4.再一次將愈傷轉(zhuǎn)入僅含有潮霉素(50mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于超量表達(dá)載體)或含有G418 (50mg/L)的N6培養(yǎng)基中(對(duì)于轉(zhuǎn)基因沉默載體),28°C暗培養(yǎng)15 20d。實(shí)施例11:外源融合蛋白的表達(dá)量檢測(cè)和高表達(dá)水稻愈傷組織細(xì)胞系篩選;取每個(gè)水稻愈傷組織細(xì)胞系中的部分組織塊,采用ELISA試劑盒(從武漢博士德生物工程公司購(gòu)買(mǎi))進(jìn)行外源融合蛋白量的測(cè)定。轉(zhuǎn)基因的水稻愈傷細(xì)胞系經(jīng)繼代后,取0.1g的水稻愈傷材料,用IOOul的蛋白提取液提取,取20ul的上樣在12%聚丙烯酰胺凝膠電泳,通過(guò)蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)膜并進(jìn)行Westernblot,可檢測(cè)到TAT-SVP7帶,后經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè),其表達(dá)量為1.54%。最終獲得了一種高表達(dá)重組TAT-SVP7的水稻轉(zhuǎn)基因愈傷細(xì)胞系,實(shí)施例12:水稻轉(zhuǎn)基因愈傷組織的擴(kuò)大培養(yǎng)和胚性改良選取高表達(dá)TAT-SVP7融合蛋白的水稻愈傷組織細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),為改善其胚性,采用N6和NB培養(yǎng)基交替進(jìn)行繼代。即是將高表達(dá)TAT-SVP7融合蛋白的水稻愈傷組織細(xì)胞系先繼代在N6培養(yǎng)基上,等愈傷生長(zhǎng)14d后,再將其在NB上進(jìn)行繼代培養(yǎng);再等愈傷生長(zhǎng)14d后,又用N6培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代,依此類(lèi)推,這樣可以有效地改善了愈傷組織細(xì)胞的胚性和愈傷組織細(xì)胞狀態(tài);實(shí)施例13:轉(zhuǎn)基因水稻愈傷的加工將采集的水稻轉(zhuǎn)基因愈傷,放在培養(yǎng)皿中進(jìn)行冷凍干燥。實(shí)施例14:轉(zhuǎn)基因水稻愈傷直接用于草魚(yú)種的GCRV免疫防治草魚(yú)為草食性魚(yú)類(lèi),在人工養(yǎng)殖的條件下可吃天然水草,可吃配合飼料,也可吃?xún)龈傻闹参镉鷤牧稀龈傻乃居鷤M織塊,無(wú)需純化處理即為草魚(yú)種的口服疫苗。實(shí)驗(yàn)中,每箱中隨機(jī)放養(yǎng)15尾,每尾體重50.0±5g的草魚(yú)苗。將陽(yáng)性愈傷組織直接投喂。對(duì)照組的水稻愈傷組織為正常非轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織,實(shí)驗(yàn)組的水稻愈傷組織含有TAT-SVP7蛋白,設(shè)置不同的濃度梯度,其中凍干粉為15%左右,間隔I天投喂,連續(xù)投喂5次,每天的投餌量為魚(yú)體重的2%。設(shè)3個(gè)平行組,實(shí)驗(yàn)前Id和實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第7d、第14d、第28d和第35d進(jìn)行草魚(yú)尾靜脈采血,做間接ELISA、Western blot免疫組化檢測(cè)。如若檢測(cè)效果好,則對(duì)連續(xù)口服攝食28d后的實(shí)驗(yàn)草魚(yú)種和對(duì)照實(shí)驗(yàn)草魚(yú)(一組為空白組和對(duì)照組),經(jīng)腹腔注射GCRV組織毒進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),分別統(tǒng)計(jì)各組的死亡率和相對(duì)保護(hù)率。結(jié)果顯示,攻毒后,對(duì)照組草魚(yú)的死亡率78.75%±2.56 ;而投喂了含有轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織塊的飼料組,草魚(yú)的死亡率為23.48± 1.27,后者比前者下降了 55.27%,二者比較達(dá)到顯著水準(zhǔn)(t-test P=0.024), 表明直接喂養(yǎng)轉(zhuǎn)TAT-sVP7融合基因水稻愈傷組織塊的獲得的相對(duì)免疫保護(hù)率為70.18%,因此,含有TAT-SVP7融合蛋白的植物疫苗,具有明顯的抗GCRV的效果O
權(quán)利要求
1.一種分離基因,其特征在于:基因TAT-SVP7,其序列為SEQ ID N0.1所示。
2.一種分離的蛋白,其序列為SEQ ID N0.2所示。
3.一種人工合成的基因,其特征在于:基因sVP7,其序列為SEQ ID N0.3所示。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的大腸桿菌基因工程菌,其特征在于:大腸桿菌(.Escherichia co7i) BL21 (DE3) hsdS gal pET28a_TAT_sVP7 CCTCC NO: M2013084。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的重組農(nóng)桿菌基因工程菌,其特征在于:農(nóng)桿菌(.Agrobacterium sp.) EHA105 Act-TAT_sVP7 , CCTCC NO: M2013083。
6.權(quán)利要求4或權(quán)利要求3所述的基因工程菌在制備治療或預(yù)防草魚(yú)呼腸孤病毒藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要 求2所述的蛋白在制備治療或預(yù)防草魚(yú)呼腸孤病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種融合蛋白基因TAT-sVP7及其應(yīng)用,基因庫(kù)里獲得了成熟的GCRV的VP7所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列信息,將VP7基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成含有優(yōu)化水稻遺傳密碼子的核苷酸序列,將其與細(xì)胞穿膜肽TAT進(jìn)行柔性連接,導(dǎo)入表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,該菌可高效的表達(dá)TAT-sVP7融合蛋白;將融合蛋白基因TAT-sVP7導(dǎo)入植物轉(zhuǎn)基因載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,該菌介導(dǎo)了融合蛋白基因TAT-sVP7整入植物細(xì)胞核DNA,實(shí)現(xiàn)了TAT-sVP7融合蛋白在植物細(xì)胞中的高效表達(dá),表達(dá)量達(dá)總可溶蛋白的1.54%,;草魚(yú)經(jīng)口服吞食含重組融合蛋白的植物材料,產(chǎn)生了有效的免疫應(yīng)答;草魚(yú)對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒的免疫保護(hù)率達(dá)到70.18%。
文檔編號(hào)C12R1/01GK103184230SQ20131009010
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月20日
發(fā)明者聶品, 張秋勝, 李楠, 羅璋, 高謙 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所
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