專利名稱：利用分子標(biāo)記輔助選擇鵝肌肉脂肪酸性狀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鵝肌肉脂肪酸性狀相關(guān)基因的克隆及其在標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪酸是構(gòu)成脂肪的重要化學(xué)物質(zhì)和組織細(xì)胞的重要組成部分，肌肉脂肪中的脂肪酸組成不僅影響肉品的風(fēng)味，而且與消費(fèi)者健康有關(guān)。營養(yǎng)學(xué)研究認(rèn)為，人體血脂和血膽固醇含量受飲食中脂肪酸構(gòu)成的影響，其中的飽和脂肪酸引起血脂升高，而不飽和脂肪酸有降血膽固醇的作用。流傳病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，飲食中的脂肪含量、脂肪酸組成與心血管疾病直接相關(guān)(Williams, 2000)。因此作為評(píng)價(jià)肌肉營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一，脂肪酸的組成已日益受到人們的重視。據(jù)報(bào)道，品種是決定肉質(zhì)中脂肪酸成分變化的主要影響因素，通過培育具有優(yōu)質(zhì)肉用性能的畜禽品種來提高肉產(chǎn)品中不飽和脂肪酸含量顯得尤為重要。綜合評(píng)定不同品種動(dòng)物肌肉中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸組成的差異是育種選擇素材群的前提。但由于肌肉脂肪酸在活體動(dòng)物上很難 直接測定，常規(guī)育種方法是通過宰殺，取新鮮胸肌肉樣，采用氣相色譜法進(jìn)行脂肪酸相對(duì)含量分析，而這種采用表現(xiàn)型間接對(duì)基因型進(jìn)行選擇的方法存在周期長、效率低、成本高等缺點(diǎn)，因此常規(guī)育種方法進(jìn)展較慢。為此，許多研究者正在不斷探索新的更為有效的動(dòng)物肌肉脂肪酸性狀選擇技術(shù)，以改變常規(guī)選擇方法的不足。分子遺傳標(biāo)記以物種基因突變?cè)斐蒁NA片段長度多態(tài)性為基礎(chǔ)，具有許多優(yōu)點(diǎn):(I)可以直接探測DNA水平的差異，不受時(shí)空的限制；(2)標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)性高；(3)共顯性標(biāo)識(shí)，可以區(qū)分純合子與雜合子；(4)可以解釋家系內(nèi)某些個(gè)體的遺傳變異；(5)可以鑒定不同性別、不同年齡的個(gè)體；(6)在選擇肌肉脂肪酸性狀的過程中，不必做昂貴的屠宰試驗(yàn)。由此可見，利用易于鑒定的遺傳標(biāo)記，在育種計(jì)劃中納入分子標(biāo)記信息進(jìn)行輔助選擇是提高選擇效率，縮短世代間隔，提高選擇強(qiáng)度，加快遺傳進(jìn)展的有效手段。近年來基因組研究的迅速發(fā)展，基因聚合、基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)手段的應(yīng)用使得分子標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用于遺傳改良已成為現(xiàn)實(shí)，并已取得了長足進(jìn)展(游小燕等，2007 ;Liu等，2008 ;Wu等，2006 ；Thue, 2002)。然而，目前國際上對(duì)于鵝肌肉脂肪酸性狀的標(biāo)記輔助選擇還鮮有報(bào)道，也不曾提出鵝肌肉脂肪酸性狀的有效評(píng)定選擇方法，在鵝肌肉脂肪酸性狀的分子標(biāo)記選擇領(lǐng)域尚屬空白。因此建立一種評(píng)定鵝肌肉脂肪酸性狀的有效分子標(biāo)記方法非常必要，同時(shí)也可為具有優(yōu)良肌肉脂肪酸性狀的肉鵝品種選擇提供可靠的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，針對(duì)有關(guān)利用分子標(biāo)記技術(shù)選擇鵝肌肉脂肪酸性狀尚屬空白的不足，提供一種在鵝的生命早期就可開始、準(zhǔn)確性高、選育周期短、成本低的利用THRSP a基因分子遺傳標(biāo)記技術(shù)選擇鵝肌肉脂肪酸性狀的方法。本發(fā)明所述的利用分子標(biāo)記輔助選擇鵝肌肉脂肪酸性狀的方法，是在完成下列基礎(chǔ)工作后取得的:
1)鵝肌肉脂肪酸性狀THRSPa基因的克隆與多態(tài)性分析:
根據(jù) GenBank N0.EU710582.1 鵝 THRSPa 基因序列，利用 Primer 和 Oligo 軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物序列ASF: 5 ; -GTGCTGCCTGTACCGTCCAA-3 '，下游引物序列ASR:5' -GGGAAGCAGTTACACCATCAGAG-3'，以鵝血液基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采用的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同于發(fā)明內(nèi)容中的技術(shù)方案；PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如

圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好，片段大小與預(yù)期的221bp相符。分離純化目的片段進(jìn)行直接測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列中包含鵝THRSPa基因的3’側(cè)翼區(qū)部分片段，對(duì)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的分析結(jié)果表明，在109bp處發(fā)生一個(gè)堿基突變(C/T)(見圖2)，具有CC、CT和TT三種基因型；
2)對(duì)鵝肌肉脂肪酸相對(duì)含量的測定:
采取鵝新鮮腿肌于-70°C冷凍保存，采用氣質(zhì)聯(lián)用法測定飽和脂肪酸(包括月桂酸、豆蘧酸、十五烷酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸和山崳酸)與不飽和脂肪酸(包括十五碳烯酸、棕櫚油酸、十七碳烯酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸)相對(duì)含量;
3)鵝THRSP°基因多態(tài)性與肌肉脂肪酸相對(duì)含量關(guān)聯(lián)性的分析: 采用SAS9.1軟件的GLM程序?qū)HRSPa基因多態(tài)性與肌肉脂肪酸相對(duì)含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，不同基因型對(duì)應(yīng)的各項(xiàng)指標(biāo)以最小二乘均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤(LSM±SE)表示，線性模型為:7" 二 P+Gi+Lj +(GL)ij +Sk+Eijk
其中:r"為性狀的觀察值，^為群體均值，Gi為基因型效應(yīng)，Lj為品種效應(yīng)，(GL)u為基因型與品種的互作效應(yīng)，Sk為性別效應(yīng)，瓦為隨機(jī)殘差。結(jié)果如表I所示，鵝THRSP a基因突變位點(diǎn)的3種基因型對(duì)肌肉脂肪酸相對(duì)含量存在不同程度的影響。其中CT基因型個(gè)體的飽和脂肪酸含量最高，與CC和TT基因型個(gè)體比較差異顯著0°〈0.01或7X0.05);而CC基因型個(gè)體的不飽和脂肪酸含量最高，與CT和TT基因型個(gè)體比較差異顯著0°〈0.01或/X0.05)； TT基因型個(gè)體飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸相對(duì)含量介于CT和CC基因型個(gè)體之間。
表I不同基因型浙東白鵝個(gè)體肌肉脂肪酸相對(duì)含量
權(quán)利要求
1.利用分子標(biāo)記輔助選擇鵝肌肉脂肪酸性狀的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行: (1)設(shè)計(jì)鵝THRSPa基因片段的特異性引物:根據(jù)GenBankN0.EU710582.1鵝THRSPa基因序列設(shè)計(jì)引物: 其上游引物序列為 ASF: 5' -GTGCTGCCTGTACCGTCCAA-3'； 其下游引物序列為 ASR: 5' -GGGAAGCAGTTACACCATCAGAG-3'； (2)PCR擴(kuò)增反應(yīng):在待選肉鵝群體中隨機(jī)選擇100-200只肉鵝個(gè)體，從各個(gè)體翅靜脈采集血液，按常規(guī)酚-氯仿方法提取血液基因組DNA，并采用上述引物和基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；采用的反應(yīng)體系為25 u L =IOXPCR Buffer (Mg2+ plus) 2.5 u L,.2.5 mmol.171 dNTPl.0-3.0 u L, 10 u mol*L_1 ± 游引物 0.4-0.6 y L，10 y mol.L—1 下游引物 0.4-0.6 ii L，50 ng.U I/1 模板 DNA 0.5 u L, 5.0U.u L-1 rTaq 酶 0.15-0.35 u L,ddH2017.45-20.05 u L ；PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為 95°C 預(yù)變性 5 min, 95°C 變性 30s, 50_60°C 退火30s，72oC延伸30s, 33-38次循環(huán)，72°C延伸10 min，4°C結(jié)束反應(yīng); (3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析:取各個(gè)體PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離純化約221bp的目的片段進(jìn)行直接測序，分析其S NPs單核苷酸多態(tài)性，明確各個(gè)體所屬的基因型； (4)優(yōu)勝肉鵝親本個(gè)體的選擇:選留CC基因型的個(gè)體作為肉鵝選擇親本，淘汰CT和TT基因型的個(gè)體。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用分子標(biāo)記輔助選擇鵝肌肉脂肪酸性狀的方法，屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。方法包括(1)設(shè)計(jì)鵝THRSPα基因片段的特異性引物；(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析；(4)優(yōu)勝肉鵝親本個(gè)體的選擇等步驟工藝。本發(fā)明是依據(jù)基因型進(jìn)行鵝肌肉脂肪酸性狀的選擇，具精確度高、操作簡單、選擇成本低(約0.3元/只)等特點(diǎn)，可在肉鵝生命早期開始選擇屠體性狀，縮短世代間隔，加速肉鵝育種進(jìn)程，每代可縮短選擇時(shí)間3個(gè)月左右。該方法可在鵝品質(zhì)育種領(lǐng)域中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103146829SQ20131007811
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月11日
發(fā)明者李國勤, 盧立志, 田勇, 沈軍達(dá), 陶爭榮, 李進(jìn)軍, 王德前, 陳黎, 徐堅(jiān) 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院