專利名稱：表達(dá)人血清白蛋白的質(zhì)粒和重組菌以及它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)人血清白蛋白的質(zhì)粒和重組菌以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
天然人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)在肝臟中由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成,在血漿中的半壽期約為15-19天，是非糖蛋白，等電點(diǎn)(PI)為4.7。人血清白蛋白是由585個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋白質(zhì)，分子量為66.5kDa，為由α -螺旋組成的心形分子，包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域(1-195ΑΑ的結(jié)構(gòu)域Ι、196-383Α的結(jié)構(gòu)域I1、384_585Α的結(jié)構(gòu)域III)。通過(guò)比對(duì)不同來(lái)源的白蛋白氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，白蛋白中Gys位置十分保守，這就決定了它的三維結(jié)構(gòu)的保守性。此外，白蛋白分子會(huì)因結(jié)合的分子大小不同，環(huán)境條件不同而使形狀有所變化。在非變性條件下，白蛋白分子內(nèi)部的二硫鍵又會(huì)使其恢復(fù)原狀，所以白蛋白具有良好的彈性。人血清白蛋白是血液系統(tǒng)的重要組成部分，其獨(dú)特的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)，使其擁有了結(jié)合、運(yùn)輸內(nèi)源性和外源性物質(zhì)，維持血液膠體滲透壓，清除自由基，抑制血小板功能，抗凝血及影響血管滲透性等多樣的生化特性，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中十分重要的生物制品。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)有38%的白蛋白被用作治療急性血容量減少以及其他原因造成的血容量減少等。另夕卜，人血清白蛋白還可以抑制多核細(xì)胞產(chǎn)生自由基，對(duì)自由基進(jìn)行清除，維持體系統(tǒng)的正常秩序。它還是許多內(nèi)源性和外援性物質(zhì)的重要載體，臨床上廣泛應(yīng)用于高膽紅素血癥(新生兒)、白細(xì)胞增多癥、人血清白蛋白過(guò)少癥、以及呼吸窘迫綜合征等多種疾病的治療。因此，人血清白蛋白也逐漸成為了臨床用量最大的蛋白制劑。血漿來(lái)源的人血清白蛋白給人類帶了各種疾病傳播的危險(xiǎn)，尤其是HIV、HBV病毒，為疾病的治療帶來(lái)了不安全的因素。而從生物工程和基因重組技術(shù)為基點(diǎn)出發(fā)得到的人血清白蛋白就在根源上避免了病毒的污染，成為了近年來(lái)越來(lái)越多的科研工作者的研究目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于表達(dá)人血清白蛋白的質(zhì)粒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的用于表達(dá)人血清白蛋白的質(zhì)粒，包括表達(dá)盒甲和表達(dá)盒乙；所述表達(dá)盒甲自上游至下游依次包括:序列表的序列3所示的AOXl啟動(dòng)子、人血清白蛋白的編碼基因、序列表的序列4所示的CYCl翻譯終止子；所述表達(dá)盒乙自上游至下游依次包括:序列表的序列5所示的GAP啟動(dòng)子、所述人血清白蛋白的編碼基因、序列表的序列6所不的AOXl翻譯終止子；所述人血清白蛋白為如下(I)或(2):(I)由序列表中 序列11所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(2)將序列11的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列11衍生的蛋白質(zhì)。
所述人血清白蛋白的編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)或5)的DNA分子:I)編碼區(qū)如序列表中序列2自5’末端第13至1842位核苷酸所示的DNA分子；2)序列2自5’末端第7至1842位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列2所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；5)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在0.1 XSSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。所述用于表達(dá)人血清白蛋白的質(zhì)粒還包括可DNA片段丙；所述DNA片段丙包括序列表的序列7所示的ADE2啟動(dòng)子和序列表的序列8所示的ADE2基因，且由所述ADE2啟動(dòng)子啟動(dòng)所述ADE2基因的表達(dá)。

所述DNA片段丙中還可包括序列表的序列9所示的TRP2基因、序列表的序列10所示的氨芐青霉素抗性基因和PUC復(fù)制起點(diǎn)。所述重組質(zhì)粒的制備方法具體如下:將用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pGAGZ a A-HSA得到含有所述表達(dá)盒乙的片段(約2.Skb的片段)插入重組質(zhì)粒pPink-HC-HSA的BamHI酶切位點(diǎn)，得到所述重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒pPGH_HX02)；所述重組質(zhì)粒pPink-HC-HSA為在pPink_HC載體的EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列2自5’末端第7-1842位核苷酸所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒pGAGZ a A-HSA為在pGAGZ a A載體的BstBI和KpnI酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列2自5’末端第10-1842位核苷酸所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。將以上任一所述的用于表達(dá)人血清白蛋白的質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌得到的工程菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述宿主菌可為畢赤酵母，具體可為PichiaPink Strainl(ade2)。以上任一所述的工程菌在生產(chǎn)人血清白蛋白中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述應(yīng)用中，用所述工程菌生產(chǎn)人血清白蛋白的方法具體如下:將所述工程菌的種子液接種至基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在25-28°C，pH=6，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量(可為0-250L/h)和攪拌轉(zhuǎn)速(可為300-700r/min)使溶解氧體積分?jǐn)?shù)(DO)保持在20% ;培養(yǎng)10小時(shí)后開(kāi)始補(bǔ)加甘油，每小時(shí)補(bǔ)加一次，每次補(bǔ)加20mL，補(bǔ)加8-10次(具體可為9次);最后一次補(bǔ)加甘油4小時(shí)后開(kāi)始補(bǔ)加甲醇溶液(每升甲醇中含有12mL PTMl溶液)，每12小時(shí)補(bǔ)加一次，每次補(bǔ)加后甲醇在培養(yǎng)體系中的濃度為1% (體積比)。發(fā)酵時(shí)間具體可為192小時(shí)。基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的制備方法(pH為 6):取 5g NH4H2PO4、0.093g CaSO4U.82g K2SO4,1.49g MgSO4.7Η20、0.3g K0H、5g葡萄糖、0.5g KH2PO4和40ml甘油溶于水并用水定容至1L。在重組酵母的篩選過(guò)程中，在篩選平板上可同時(shí)看到白色和粉色的菌落。菌落的顏色直接反應(yīng)了人血清白蛋白的相對(duì)表達(dá)量，因?yàn)榫涞念伾c質(zhì)粒的拷貝數(shù)有關(guān)，也反應(yīng)了啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。粉色克隆表達(dá)的ADE2蛋白較少，白色克隆代表了整合入基因組的拷貝數(shù)多，產(chǎn)生的ADE2蛋白較多，盡量挑取白斑菌落。GAP啟動(dòng)子是組成型表達(dá)啟動(dòng)子，可使重組酵母菌在葡萄糖、甘油、油酸或甲醇存在下在生長(zhǎng)階段表達(dá)外源蛋白，控制的下游基因表達(dá)量比甲醇誘導(dǎo)下的AOXl啟動(dòng)子更高。AOXl啟動(dòng)子是受甲醇誘導(dǎo)的強(qiáng)效啟動(dòng)子，可用甲醇嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá)。酵母表達(dá)系統(tǒng)具有易于培養(yǎng)、繁殖速度較快、便于工程化操作等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又能進(jìn)行高密度發(fā)酵，且具有適于蛋白產(chǎn)物正確折疊的內(nèi)環(huán)境和翻譯后修飾加工系統(tǒng)，外源蛋白還可以分泌至胞外，更有利于下游純化工藝的操作。畢赤酵母內(nèi)源性蛋白少，最小生長(zhǎng)培養(yǎng)基簡(jiǎn)單，產(chǎn)生的有毒物質(zhì)少，外源蛋白表達(dá)能占培養(yǎng)液中蛋白的絕大部分。與釀酒酵母相比，畢赤酵母不存在過(guò)度糖基化問(wèn)題，對(duì)蛋白產(chǎn)物的糖基化修飾方式更接近高等真核生物，不易產(chǎn)生免疫原性，因而在臨床應(yīng)用中更安全。PichiaPink Strainl (ade2)不僅具有畢赤酵母菌的所有優(yōu)點(diǎn)，由于菌體內(nèi)部ade2基因部分啟動(dòng)子和完整的編碼序列缺失，不會(huì)因?yàn)榛蛲蛔兾稽c(diǎn)的偶然性突變而恢復(fù)成野生型，穩(wěn)定性高。采用本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒構(gòu)建重組酵母菌，利用ade2基因與缺陷型受體菌之間的互補(bǔ)特性進(jìn)行陽(yáng)性重組子篩選，安全、可靠。本發(fā)明提供的重組酵母菌在生長(zhǎng)和誘導(dǎo)階段均能表達(dá)人血清白蛋白，表達(dá)量高且遺傳穩(wěn)定性高。


圖1為重組質(zhì)粒pPink-HC-HSA的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為重組質(zhì)粒pGAGZ a A-HSA的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為重組質(zhì)粒pPGH-HX02的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為實(shí)施例3中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖5為實(shí)施例4中的western-blot結(jié)果。圖6為實(shí)施例4的質(zhì)譜鑒定中一級(jí)肽段裂解離子峰圖。圖7為實(shí)施例4的質(zhì)譜鑒定中二級(jí)肽段裂解離子峰圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。大腸桿菌T0P10購(gòu)自Invitrogen公司。PichiaPink Strainl(ade2),即缺失ade2基因的畢赤酵母菌株，購(gòu)自Invitrogen公司。pPink-HC載體(酵母表達(dá)載體)、pPink_LC載體(酵母表達(dá)載體)和pGAPZ a A載體(酵母表達(dá)載體)均購(gòu)自Invitrogen公司。氨節(jié)青霉素和博來(lái)霉素均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。酵母選擇性營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基PAD (不含腺嘌呤的篩選培養(yǎng)基):北京泛基諾公司。實(shí)施例中所用的商購(gòu)的HSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品:北京鼎國(guó)DH017。PTMl溶液:五水合硫酸銅6.0g、碘化鈉0.08g、一水硫酸錳3.lg、硼酸0.02g、氯化鈷0.5g、硫酸鋅20.0g、硫酸亞鐵(FeSO4.7H20)65.0g和VH (生物素)0.2g，用蒸餾水定容至 lOOOmL。5， AOXlprimer:5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，；

3’ CYClprimer:5’ -GTTACATGCGTACACGCGTTTGTACAG-3’。5’ GAP primer:5’ -GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’ ；
3’ AOXlprimer:5’ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。實(shí)施例1、優(yōu)化基因的獲得NCBI中的人血清白蛋白基因如序列表的序列I所示(GENBANK ACCESSIONN0.NM_000477),由1830個(gè)核苷酸組成。序列I中，自5’末端第I至72位核苷酸為信號(hào)肽，第73至1827位核苷酸為成熟蛋白的編碼區(qū)，第1828至1830位核苷酸為終止密碼子。將序列I所示DNA命名為HSA野生基因。根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性將序列表的序列I進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)去除序列I中具有的兩個(gè)限制性內(nèi)切酶BglII識(shí)別序列，同時(shí)在起始密碼子前增加Kozak序列(GAAACG)Jt化后的序列如序列表的序列2自5’末端第7至1842位核苷酸所示。因?yàn)閮?yōu)化后的序列同樣具有人血清白蛋白的功能，所以將該優(yōu)化后的序列命名為HSA優(yōu)化基因。序列表的序列I所示的DNA分子和序列表的序列2所示的DNA分子均編碼序列表的序列11所示的HSA蛋白。實(shí)施例2、重組質(zhì)粒pPGH-HX02的構(gòu)建

一、重組質(zhì)粒pPink-HC-HSA的構(gòu)建1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。2、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI雙酶切步驟I得到的雙鏈DNA分子，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI雙酶切pPink_HC載體，回收約7.7kb的載體骨架。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pPink-HC-HSA。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pPink-HC-HSA進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pPink_HC載體的EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2自5’末端第7-1842位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pPink-HC-HSA的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。二、重組質(zhì)粒pGAGZ a A-HSA的構(gòu)建1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。2、用限制性內(nèi)切酶BstBI和KpnI雙酶切步驟I得到的雙鏈DNA分子，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶BstBI和KpnI雙酶切pGAGZ a A載體，回收約3.1kb的載體骨架。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pGAGZ a A-HSA。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pGAGZ a A-HSA進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pGAGZ a A載體的BstBI和KpnI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2自5’末端第10-1842位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pGAGZ a A-HSA的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2。三、重組質(zhì)粒pPGH-HX02的構(gòu)建1、用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pGAGZ a A-HSA,回收約2.8kb的片段。2、用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切重組質(zhì)粒pPink-HC-HSA，回收約9.4kb的片段(線性化載體)。3、將步驟I回收的片段和步驟2回收的片段連接，得到重組質(zhì)粒PPGH-HX02。重組質(zhì)粒PPGH-HX02的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖3。重組質(zhì)粒pPGH-HX02中包括兩個(gè)HSA表達(dá)盒，分別命名為表達(dá)盒甲和表達(dá)盒乙。表達(dá)盒甲自上游至下游依次包括:序列表的序列3所示的AOXl啟動(dòng)子、序列2自5’末端第7至1842位核苷酸所示的HSA優(yōu)化基因、序列表的序列4所示的CYCl翻譯終止子。表達(dá)盒乙自上游至下游依次包括:序列表的序列5所示的GAP啟動(dòng)子、序列2自5’末端第7至1842位核苷酸所示的HSA優(yōu)化基因、序列表的序列6所示的AOXl翻譯終止子。重組質(zhì)粒pPGH-HXOl中還包括序列表的序列7所示的ADE2啟動(dòng)子、序列表的序列8所示的ADE2基因(報(bào)告基因)、序列表的序列9所示的TRP2基因(色氨酸合成酶基因)、序列表的序列10所示的Amp抗性基因(氨芐青霉素抗性基因)和pUC復(fù)制起點(diǎn)。實(shí)施例3、制備重組工程菌并表達(dá)HSA蛋白一、制備重組菌-11、用限制性內(nèi)切酶PmeI酶切重組質(zhì)粒pPGH_HX02，回收線性化的質(zhì)粒。2、制備酵母感受態(tài)細(xì)胞(1)挑取PichiaPink Strainl (ade2)的單菌落，接種至5mL YTO液體培養(yǎng)基，28°C、300rpm 振蕩培養(yǎng) 24h。(2)將步驟(I)得到的培養(yǎng)物接種至YPD液體培養(yǎng)基，28°C、300rpm振蕩培養(yǎng)，直至 OD600nm-1.3_1.5 ο(3)取步驟(2)得到的培養(yǎng)物，4°C、1500g離心5min，收集菌體。(4)用冰預(yù)冷的無(wú)菌水重懸步驟(3)得到的菌體，4°C、1500g離心5min，收集菌體。(5)用預(yù)冷的無(wú)菌水重懸步驟(4)得到的菌體，4°C、1500g離心5min,收集菌體。(6)用預(yù)冷的IM山梨醇水溶液重懸菌體，4°C、1500g離心5min，收集沉淀。(7)用預(yù)冷的IM山梨醇水溶液重懸菌體，冰上放置。3、制備重組菌(1)將步驟I得到的線性化質(zhì)粒和步驟2得到的菌體懸液混合后吸至0.1cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5min，然后660ν100 Ω電擊一次，立即加入ImL預(yù)冷的YPDS培養(yǎng)基，吹打均勻，28°C孵育3h ;然后吸取300 μ L涂布于酵母選擇性營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基PAD上，將平板倒置于培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。在重組酵母的篩選過(guò)程中，在篩選平板上可同時(shí)看到白色和粉色的菌落。菌落的顏色直接反應(yīng)了人血清白蛋白的相對(duì)表達(dá)量，因?yàn)榫涞念伾c質(zhì)粒的拷貝數(shù)有關(guān)，也反應(yīng)了啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。粉色克隆表達(dá)的ADE2蛋白較少，白色克隆代表了整合入基因組的拷貝數(shù)多，產(chǎn)生的ADE2蛋白較多，挑取白斑菌落。(2)挑取單克隆，接種至YPD液體培養(yǎng)基中，28°C、300rpm振蕩培養(yǎng)，然后12000rpm離心2min，收集菌體沉淀。(3)取步驟(2)得到的菌體沉淀，提取基因組DNA，采用5’ AOXlprimer和3’ CYClprimer組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定,或采用5’GAP primer和3’A0Xlprimer組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。如果采用5’AOXlprimer和3’CYClprimer組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定顯示2.2bp條帶，且采用5’GAP primer和3’A0Xlprimer組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定顯示2.0bp條帶，待測(cè)菌株即為目的菌株(重組菌-1)。
二、制備重組菌-1I1、用限制性內(nèi)切酶PmeI酶切重組質(zhì)粒pPink-HC-HSA，回收線性化的質(zhì)粒。2、制備酵母感受態(tài)細(xì)胞同步驟一的2。3、制備重組菌(I)同步驟一的3的(I)。(2)同步驟一的3的(2)。(3)提取步驟(2)得到的菌體沉淀的基因組DNA，采用5’ AOXlprimer和3’ CYClprimer組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。如果采用5’AOXlprimer和3’CYClprimer組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定顯示2.2bp條帶，待測(cè)菌株即為目的菌株(重組菌-1I)。三、制備重組菌-1II1、用限制性內(nèi)切酶MunI酶切重組質(zhì)粒pGAGZ a A-HSA,回收線性化的質(zhì)粒。2、制備酵母感受態(tài) 細(xì)胞用畢赤酵母GS115代替PichiaPink Strainl (ade2),其它同步驟一的2。3、制備重組菌(I)將步驟I得到的線性化質(zhì)粒和步驟2得到的菌體懸液混合后吸至0.1cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5min，然后660ν100Ω電擊一次，立即加入ImLlM山梨醇，吹打均勻，28 °C孵育3h ;然后吸取300 μ L涂布于含有50 μ g/ml博來(lái)霉素的YPD培養(yǎng)基平板上，將平板倒置于培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。(2)同步驟一的3的(2)。(3)提取步驟(2)得到的菌體沉淀的基因組DNA，采用5’ GAP primer和3’ AOXlprimer組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。如果采用5’GAP primer和3’AOXlprimer組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定顯示1.0bp條帶，待測(cè)菌株即為目的菌株(重組菌-1II)。四、表達(dá)HSA將重組菌-1、重組菌-1I或重組菌-1II的單菌落接種于IOOmL BMGY培養(yǎng)基中，28°C、300rpm振蕩培養(yǎng)24h，然后加入甲醇使甲醇濃度為1%(體積比)，之后每隔24h補(bǔ)加甲醇使甲醇濃度為1% (體積比)。從第一次加入甲醇開(kāi)始計(jì)時(shí)，144小時(shí)后，4°C、1500g離心IOmin,收集上清。將上清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，目標(biāo)蛋白的分子量為66.5kD。照片見(jiàn)圖4 (泳道I為重組菌III，泳道2為重組菌II，泳道3為重組菌I，泳道4為濃度為0.25g/L的商購(gòu)的HSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，泳道5為濃度為0.5g/L的商購(gòu)的HSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，泳道6為濃度為lg/L的商購(gòu)的HSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，泳道7為濃度為2g/L的商購(gòu)的HSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)品)?？梢杂^察到，各個(gè)重組菌得到的上清中均具有預(yù)期蛋白條帶，且重組菌-1中預(yù)期蛋白的表達(dá)量高于重組菌-1I和重組菌-1II。實(shí)施例4、western blot鑒定和質(zhì)譜鑒定一、搖瓶培養(yǎng)1、將重組菌-1的單克隆接種于IOmL BMGY培養(yǎng)基，28°C、300rpm振蕩培養(yǎng)24h。
2、取ImL步驟(I)的培養(yǎng)物，接種至IOOmL BMGY培養(yǎng)基，28°C、300rpm振蕩培養(yǎng)，24h后加入甲醇使培養(yǎng)體系中的甲醇濃度為1% (體積比)，之后每隔24h補(bǔ)加甲醇并使培養(yǎng)體系中的甲醇濃度為1% (體積比)。二、western blot 鑒定步驟一的2中，分別于振蕩培養(yǎng)的初始時(shí)刻(Oh)、振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后(24h)、振蕩培養(yǎng)48小時(shí)后(48h)、振蕩培養(yǎng)72小時(shí)后(72h)、振蕩培養(yǎng)96小時(shí)后(96h)、振蕩培養(yǎng)120小時(shí)后(120h)、振蕩培養(yǎng)144小時(shí)后(144h)取樣，采用白蛋白一抗(購(gòu)自SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY, SC46293)進(jìn)行 western blot。western-blot結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢杂^察到,重組菌-1表達(dá)的66.5kD條帶確實(shí)為人血清白蛋白條帶，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸增多。三、質(zhì)譜鑒定步驟一的2中，振蕩培養(yǎng)144小時(shí)后，取發(fā)酵上清，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。挖取SDS-PAGE凝膠上的蛋白點(diǎn)，采用膠內(nèi)胰蛋白酶酶切蛋白樣品獲得多肽段，然后取I μ L樣品和I μ L基質(zhì)混勻后點(diǎn)于MTP AnchorChip 800/384靶板，并用多肽標(biāo)準(zhǔn)品(Bruker Dalton, Peptide calibration standard II)作為校正內(nèi)標(biāo)，用 Autoflex IIIMALD1-T0F-T0F (Bruker Dalton)質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定，一級(jí)肽段裂解離子峰圖見(jiàn)圖6。二級(jí)肽段裂解離子峰圖見(jiàn)圖7。通過(guò)MASCOT搜索引擎檢索，參數(shù)設(shè)置，與理論序列比對(duì)，數(shù)據(jù)分析與運(yùn)算，一級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果得分為167，二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果得分為248，均在在可信范圍之內(nèi)，可以判斷表達(dá)的重組人血清白蛋白氨基酸序列正確。實(shí)施例5、重組菌-1的批式發(fā)酵表達(dá)1、制備培養(yǎng)基

YPD種子培養(yǎng)基由溶劑和溶質(zhì)組成，自然pH ;所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下:2g/100mL蛋白胨，lg/1OOmL酵母提取物,2g/100mL葡萄糖?；A(chǔ)鹽培養(yǎng)基的制備方法(pH為 6):取 5g NH4H2PO4、0.093g CaSO4U.82g K2SO4'1.49g MgSO4.7Η20、0.3g K0H、5g葡萄糖、0.5g KH2PO4和40ml甘油溶于水并用水定容至1L。1、挑取重組菌-1的單菌落至Yro種子培養(yǎng)基，28°C 300rpm振蕩培養(yǎng)24h，得到種子液。2、將步驟I得到的種子液以10% (體積比)的接種量接入基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度控制在25-28°C，pH=6，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量0-250L/h和攪拌轉(zhuǎn)速(300_700r/min)使溶解氧體積分?jǐn)?shù)(DO)保持在20%左右；培養(yǎng)10小時(shí)后開(kāi)始補(bǔ)加甘油，每小時(shí)補(bǔ)加一次，每次補(bǔ)加20mL，共補(bǔ)加9次(實(shí)際應(yīng)用中補(bǔ)加8-10次均可)；最后一次補(bǔ)加甘油4小時(shí)后開(kāi)始補(bǔ)加甲醇溶液(每升甲醇中含有12mL PTMl溶液)，每12小時(shí)補(bǔ)加一次，每次補(bǔ)加后甲醇在培養(yǎng)體系中的濃度為1% (體積比)；溫度、pH、溶氧、甲醇濃度分別由溫度電極、pH電極、溶氧電極、甲醇電極在線監(jiān)測(cè)控制；發(fā)酵全過(guò)程由發(fā)酵罐控制系統(tǒng)軟件進(jìn)行在線控制和數(shù)據(jù)采集；發(fā)酵192小時(shí)后取發(fā)酵上清。通過(guò)高效液相層析系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)酵上清中的HSA蛋白濃度。高效液相層析的參數(shù)如下:柱子型號(hào)TSK-GEL3000SW，長(zhǎng)度30cm，內(nèi)徑7.8mm ;填充介質(zhì)為5 μ m硅膠；具體洗脫過(guò)程、試劑配方和流速參考藥典三附錄VI Q。目標(biāo)峰的峰值對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間位置為17.6±0.2min。
用商購(gòu)的HSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=l.2X 10_6x,R2=0.998，y為白蛋白濃度(g/L)，X為峰面積。通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，發(fā)酵192小時(shí)后，每升發(fā)酵上清中的HSA蛋白濃度為IOg/L (三次重復(fù)實(shí)驗(yàn) 的平均值) 。
權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒，包括表達(dá)盒甲和表達(dá)盒乙； 所述表達(dá)盒甲自上游至下游依次包括:序列表的序列3所示的AOXl啟動(dòng)子、人血清白蛋白的編碼基因、序列表的序列4所示的CYCl翻譯終止子； 所述表達(dá)盒乙自上游至下游依次包括:序列表的序列5所示的GAP啟動(dòng)子、所述人血清白蛋白的編碼基因、序列表的序列6所不的AOXl翻譯終止子； 所述人血清白蛋白為如下(I)或(2): (O由序列表中序列11所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (2)將序列11的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列11衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于:所述人血清白蛋白的編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)或5)的DNA分子: 1)編碼區(qū)如序列表中序列2自5’末端第13至1842位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列2自5’末端第7至1842位核苷酸所示的DNA分子； 3)序列表中序列2所示的DNA分子； 4)在嚴(yán)格條件下與I)或2 )或3)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子； 5)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于:所述重組質(zhì)粒還包括DNA片段丙；所述DNA片段丙包括序列表的序列7所不的ADE2啟動(dòng)子和序列表的序列8所不的ADE2基因，且由所述ADE2啟動(dòng)子啟動(dòng)所述ADE2基因的表達(dá)。
4.將權(quán)利要求1至3中任一所述的重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌得到的工程菌。
5.如權(quán)利要求4所述的工程菌，其特征在于:所述宿主菌為畢赤酵母。
6.如權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于:所述畢赤酵母為PichiaPink Strainl(ade2)。
7.權(quán)利要求4或5或6所述的工程菌在生產(chǎn)人血清白蛋白中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于表達(dá)人血清白蛋白的質(zhì)粒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的用于表達(dá)人血清白蛋白的質(zhì)粒，包括表達(dá)盒甲和表達(dá)盒乙；表達(dá)盒甲依次包括序列3所示的AOX1啟動(dòng)子、人血清白蛋白的編碼基因、序列4所示的CYC1翻譯終止子；表達(dá)盒乙依次包括序列5所示的GAP啟動(dòng)子、所述人血清白蛋白的編碼基因、序列6所示的AOX1翻譯終止子；所述人血清白蛋白為如下(1)或(2)(1)由序列表中序列11所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(2)將序列11的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列11衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的重組酵母菌在生長(zhǎng)和誘導(dǎo)階段均能表達(dá)人血清白蛋白，表達(dá)量高且遺傳穩(wěn)定性高。
文檔編號(hào)C12N15/81GK103194481SQ201310078280
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月12日
發(fā)明者徐存拴, 史世領(lǐng), 史世會(huì), 張全義, 常翠芳, 趙茜怡 申請(qǐng)人:河南新鄉(xiāng)華星藥廠