專利名稱：一種核酸檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及核酸檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
1.核酸檢測(cè)的意義細(xì)菌、病毒及其他病原微生物均具有獨(dú)特的核酸序列，這些特定序列的檢測(cè)在食品安全、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域起著至關(guān)重要的作用。1.1食品安全食品和水與空氣 一樣是人類生活的必需品，是人類生命的能源。然而，在食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和銷售的各個(gè)環(huán)節(jié)中，微生物的大量繁殖會(huì)引起食品腐敗變質(zhì)，導(dǎo)致食源性感染或食物中毒。隨著近年來(lái)環(huán)境污染的不斷加劇，病原微生物對(duì)人類所造成的威脅越來(lái)越大，尤其是近年來(lái)世界各國(guó)相繼發(fā)生的重大食品安全事件，給食品安全敲響了警鐘。作為微生物分類和鑒定的重要依據(jù)之一，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生理生化方法操作繁瑣，需要時(shí)間較長(zhǎng)，其準(zhǔn)備和收尾工作繁重，且需要大量專業(yè)技術(shù)人員參與。核酸檢測(cè)技術(shù)可特異性識(shí)別病原體中的保守核酸序列，已被用于檢測(cè)大腸桿菌、痢疾桿菌等食物中常見(jiàn)的病原體。1.2疾病診斷分子生物學(xué)研究表明基因中核酸序列的微小變化可能導(dǎo)致諸如癌癥、心腦血管疾病、遺傳性疾病等一系列疾病，致病基因的改變通常發(fā)生在病變的早期，因此有可能根據(jù)核酸的改變來(lái)早期診斷疾病。此外，由于被細(xì)菌或病毒感染者攜帶有細(xì)菌或病毒的基因，通過(guò)分析個(gè)體中細(xì)菌或病毒特異的核酸，可診斷傳染性疾病，如肺結(jié)核、艾滋病等。而這些疾病的檢測(cè)，對(duì)于傳染疾病的控制與預(yù)防具有重大意義。1.3環(huán)境監(jiān)測(cè)隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，環(huán)境問(wèn)題日益突出。環(huán)境污染問(wèn)題不僅影響我國(guó)人民的生存環(huán)境和生存質(zhì)量，危害人民的身體健康，同時(shí)也制約著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此，加強(qiáng)環(huán)境保護(hù)工作顯得越來(lái)越重要。環(huán)境監(jiān)測(cè)是環(huán)境保護(hù)工作的基礎(chǔ)，環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)是環(huán)境管理與決策的基本依據(jù)?？梢哉f(shuō)，離開(kāi)了環(huán)境監(jiān)測(cè)工作的支持，整個(gè)環(huán)保工作都將陷入被動(dòng)的局面。核酸檢測(cè)可準(zhǔn)確檢測(cè)環(huán)境中的有害生物，如水樣中的霍亂弧菌，空氣中的產(chǎn)氣莢膜桿菌以及海洋中的已知病菌和有害生物(如某些藻類)等。這對(duì)于預(yù)防和控制赤潮、水質(zhì)污染、大氣污染等重大環(huán)境問(wèn)題具有重要意義。2.核酸檢測(cè)的方法發(fā)展簡(jiǎn)易、快速、低成本、可重復(fù)利用的核酸檢測(cè)方法對(duì)于以上應(yīng)用具有重要意義，也是目前核酸檢測(cè)的發(fā)展方向的主要趨勢(shì)。目前常用的核酸檢測(cè)方法主要包括電泳法，紫外分光光度法以及熒光法。前兩者主要用于終點(diǎn)檢測(cè)，而熒光法用于實(shí)時(shí)檢測(cè)，較前兩者對(duì)儀器的要求和成本要高。而電泳法操作較繁瑣，耗時(shí)也長(zhǎng)，因而主要用于實(shí)驗(yàn)室；紫外分光光度雖然操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)也短，但對(duì)樣品純度要求較高，易受雜質(zhì)干擾。因而世界各地都在積極研發(fā)簡(jiǎn)易、快速而低廉的核酸檢測(cè)方法，其中試紙法不僅完全滿足上述要求，而且靈敏度高，特異性好，最近幾年倍受專家學(xué)者關(guān)注；但其中一個(gè)突出的問(wèn)題就是其制備還依賴于昂貴而精密的儀器加工，并且一般只能一次性使用，因而對(duì)于一般家庭衛(wèi)生保健以及長(zhǎng)期跟蹤，還需要進(jìn)一步改進(jìn)和提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)易、快速、低成本、并且可重復(fù)利用的核酸檢測(cè)方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案。I)確定檢測(cè)所需的特異性核酸目標(biāo)片段，然后制備捕獲溶液、檢測(cè)溶液以及對(duì)照溶液，所述捕獲溶液含有與特異性核酸目標(biāo)片段的一端互補(bǔ)的捕獲探針，捕獲探針上連接有顯色顆粒，檢測(cè)溶液含有與特異性核酸目標(biāo)片段的另一端互補(bǔ)的檢測(cè)探針，對(duì)照溶液中含有與捕獲探針互補(bǔ)的對(duì)照探針，檢測(cè)探針以及對(duì)照探針上連接有用于與試紙結(jié)合的分子;2)將捕獲溶液、檢測(cè)溶液和對(duì)照溶液分別注入三支加樣筆的筆桿中，所述加樣筆還包括筆頭，筆頭的前端開(kāi)設(shè)有溶液流出孔，溶液流出孔內(nèi)設(shè)置有可以轉(zhuǎn)動(dòng)的球珠，筆頭的后端與筆桿相連通，注入捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤汉?，用密封油將筆桿密封；3)依次持三支加樣筆在試紙上書寫線條，由捕獲溶液構(gòu)成的線條A位于試紙的下端，由對(duì)照溶液構(gòu)成的線條C位于試紙的上端，由檢測(cè)溶液構(gòu)成的線條B位于線條A與線條C之間；

4)待構(gòu)成線條的溶液干燥后，將試紙的下端浸潤(rùn)于待測(cè)樣品中，保持線條A位于待測(cè)樣品的上方，待線條C顯色并穩(wěn)定后取出試紙，觀察線條B的顯色情況。所述加樣筆還包括用于連接筆頭與筆桿的連接裝置。所述書寫是指將筆頭前端接觸試紙，然后驅(qū)動(dòng)筆頭在試紙上移動(dòng)，使筆頭前端的球珠轉(zhuǎn)動(dòng)，帶動(dòng)筆桿內(nèi)的捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤毫鞒?，流出的捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤和糠笥谠嚰埳?。所述球珠的直徑為lOOnm-lcm。所述加樣筆的加樣量范圍為10-1000nL/cm。所述顯色顆粒包括天然顯色顆?；蚣ぐl(fā)顯色顆粒。本發(fā)明所述核酸檢測(cè)方法利用加樣筆在試紙上書寫微量的溶液形成捕獲線、檢測(cè)線和對(duì)照線，具有加樣儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，攜帶方便，操作容易，成本低廉，可重復(fù)使用等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)加樣器相比成本降低了一萬(wàn)多倍，同時(shí)微量加樣的準(zhǔn)確性、可靠性極佳，且容易控制，降低了核酸檢測(cè)的成本，提高了檢測(cè)速度，簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程。


圖1為本發(fā)明所述加樣筆的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明所述試紙上書寫的線條示意圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例核酸序列檢測(cè)結(jié)果；圖4為本發(fā)明所述加樣筆加樣量隨書寫速度的變化；圖5為本發(fā)明所述加樣筆加樣量隨前端球珠大小的變化；
圖6為本發(fā)明所述加樣筆加樣量隨筆桿內(nèi)填充物(捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤?高度的變化；圖中:I筆頭，2筆桿，3球珠，4連接裝置，5填充物，6密封油；19吸附墊，20硝酸纖維素膜，21對(duì)照線，22檢測(cè)線，23捕獲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明所述核酸檢測(cè)方法，包括以下步驟:1)確定檢測(cè)所需的特異性核酸目標(biāo)片段，然后制備捕獲溶液、檢測(cè)溶液以及對(duì)照溶液，所述捕獲溶液含有與特異性核酸目標(biāo)片段的一端互補(bǔ)的捕獲探針，捕獲探針上連接有顯色顆粒，所述顯色顆粒包括天然顯色顆粒(如金或四氧化三鐵納米顆粒)或激發(fā)顯色顆粒(如稀土納米顆粒等)，檢測(cè)溶液含有與特異性核酸目標(biāo)片段的另一端互補(bǔ)的檢測(cè)探針，對(duì)照溶液中含有與捕獲探針互補(bǔ)的對(duì)照探針，檢測(cè)探針以及對(duì)照探針上連接有用于與試紙結(jié)合的分子；2)將捕獲溶液、檢測(cè)溶液和對(duì)照溶液分別注入對(duì)應(yīng)三支加樣筆的筆桿2中，所述加樣筆還包括筆頭1，筆頭I的前端開(kāi)設(shè)有溶液流出孔，溶液流出孔內(nèi)設(shè)置有可以轉(zhuǎn)動(dòng)的球珠3，筆頭I的后端與筆桿2相連通，注入捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤汉?，用密封? (礦物油)將筆桿2密封，所述加樣筆還包括用于連接筆頭I與筆桿2的連接裝置4，參見(jiàn)圖1 ;3)依次持三支加樣筆在試紙上書寫線條，由捕獲溶液構(gòu)成的線條A位于試紙的下端，由對(duì)照溶液構(gòu)成的線條C位于試紙的上端，由檢測(cè)溶液構(gòu)成的線條B位于線條A與線條C之間，所述書寫是指將筆頭I前端接觸試紙，然后驅(qū)動(dòng)筆頭I在試紙上移動(dòng)，使筆頭I前端的球珠3轉(zhuǎn)動(dòng)，帶動(dòng)筆桿2內(nèi)的捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤毫鞒?，流出的捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤和糠笥谠嚰埳希梢詫?shí)現(xiàn)微量加樣；4)待構(gòu)成線條的溶液干燥后，將試紙的下端浸潤(rùn)于待測(cè)樣品中，保持線條A位于待測(cè)樣品的上方，待線條C顯色并穩(wěn)定后取出試紙，觀察線條B的顯色情況。所述球珠3的直徑為100nm-lcm。所述加樣筆的加樣量范圍為10_1000nL/cm。通過(guò)調(diào)整書寫速度(圖4)、球珠直徑(圖5)或筆桿內(nèi)溶液高度(圖6)改變加樣筆的加樣量，書寫速度是指筆頭前端在基底上移動(dòng)的速度，書寫速度可以通過(guò)驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)進(jìn)行控制，同時(shí)，可以在筆桿后端連接填充物補(bǔ)充機(jī)構(gòu)，使筆桿內(nèi)填充物保持穩(wěn)定的高度。實(shí)施例生物加樣筆的結(jié)構(gòu)如圖1所示，由6部分組成，筆頭I主要提供球珠3的支持點(diǎn)，筆桿2用于儲(chǔ)存填充物，球珠3在基底(試紙)上摩擦轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)提供足夠的剪切力，帶動(dòng)填充物5流出，連接裝置4用于連接筆桿2和筆頭1，密封油6防止填充物揮發(fā)。當(dāng)生物加樣筆在基底上書寫時(shí)(類似于圓珠筆或中性筆的書寫過(guò)程)，筆頭I前端的球珠3轉(zhuǎn)動(dòng)，帶動(dòng)填充物5流出。本發(fā)明在進(jìn)行快速、特異核酸檢測(cè)時(shí)使用生物加樣筆A、生物加樣筆B和生物加樣筆C，檢測(cè)過(guò)程，具體介紹如下: 步驟1:生物加樣筆的制備I)根據(jù)待測(cè)樣品，確定檢測(cè)所需的特異性核酸目標(biāo)片段，進(jìn)一步根據(jù)該目標(biāo)片段設(shè)計(jì)檢測(cè)所需的捕獲探針，檢測(cè)探針以及對(duì)照探針。捕獲探針的3’端烷巰基化，巰基用于結(jié)合納米金顆粒，捕獲探針與目標(biāo)片段的5’端互補(bǔ)，從而可以捕獲目標(biāo)片段；檢測(cè)探針與目標(biāo)片段的3’端互補(bǔ)，檢測(cè)探針5’端的生物素用于與鏈霉親和素結(jié)合；對(duì)照探針與捕獲探針互補(bǔ)，對(duì)照探針3’端的生物素用于與鏈霉親和素結(jié)合。2)將捕獲探針(0.0lnmol-1mmol)和納米金水溶液(0.01pmol-20nmol)混合,捕獲探針與納米金結(jié)合，構(gòu)成捕獲溶液。檢測(cè)探針和對(duì)照探針?lè)謩e和鏈霉親和素(目的是使檢測(cè)探針和對(duì)照探針和硝酸纖維素膜結(jié)合)水溶液混合，分別構(gòu)成檢測(cè)溶液和對(duì)照溶液(10μ M-lmM)。3)將捕獲溶液注入生物加樣筆A的筆桿中，將檢測(cè)溶液注入生物加樣筆B的筆桿中，將對(duì)照溶液注入生物加樣筆C的筆桿中，筆桿末端分別用礦物油封住以防止蒸發(fā)，從而制成捕獲筆(生物加樣筆A)，檢測(cè)筆(生物加樣筆B)和對(duì)照筆(生物加樣筆C)。步驟2:生物加樣筆的使用I)將硝酸纖維素膜20剪成合適大小，與吸附墊19以及支持墊組裝成空白試紙條。硝酸纖維素膜貼于支持墊一端，吸附墊貼于支持墊另一端，并壓住硝酸纖維素膜約2mm。硝酸纖維素膜主要用于固定檢測(cè)探針和對(duì)照探針，吸附墊提供足夠的毛細(xì)力，維持待測(cè)樣品的流動(dòng)，支持墊主要提供試紙條一定的力學(xué)性能。2)使用時(shí)，用生物加樣筆A、B和C分別在空白試紙條上依次畫三條線，即構(gòu)成捕獲線23，檢測(cè)線22和對(duì)照線21(圖2)，將試紙條浸潤(rùn)于待測(cè)樣品中，注意不要沒(méi)過(guò)捕獲線；15分鐘之后觀察試紙條顯色結(jié)果。3)檢測(cè)線和對(duì)照線均顯色，表明結(jié)果為陽(yáng)性；檢測(cè)線未顯色，對(duì)照線顯色，表明結(jié)果為陰性；對(duì)照線未顯色，結(jié)果不可靠，需重復(fù)上述步驟。例I檢測(cè)I型艾滋病病毒(HIV-1)特異性核苷酸序列步驟1:生物加樣筆的制備。I)根據(jù)相關(guān)資料確定HIV-15’長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)為待檢測(cè)的目標(biāo)片段，設(shè)計(jì)如表I所示的三條核酸探針以及目標(biāo)片段和對(duì)照片段。捕獲探針的3’端烷巰基化，巰基用于納米金顆粒結(jié)合，捕獲探針與目標(biāo)片段5’端互補(bǔ)，從而可以捕獲目標(biāo)核酸片段；檢測(cè)探針與目標(biāo)片段3’端互補(bǔ)，其5’端的生物素用于與鏈霉親和素結(jié)合；對(duì)照探針與捕獲探針互補(bǔ)，其3’端的生物素用于與鏈霉親和素結(jié)合。表I核酸序列
權(quán)利要求
1.一種核酸檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟 1)確定檢測(cè)所需的特異性核酸目標(biāo)片段，然后制備捕獲溶液、檢測(cè)溶液以及對(duì)照溶液，所述捕獲溶液含有與特異性核酸目標(biāo)片段的一端互補(bǔ)的捕獲探針，捕獲探針上連接有顯色顆粒，檢測(cè)溶液含有與特異性核酸目標(biāo)片段的另一端互補(bǔ)的檢測(cè)探針，對(duì)照溶液中含有與捕獲探針互補(bǔ)的對(duì)照探針，檢測(cè)探針以及對(duì)照探針上連接有用于與試紙結(jié)合的分子； 2)將捕獲溶液、檢測(cè)溶液和對(duì)照溶液分別注入三支加樣筆的筆桿(2)中，所述加樣筆還包括筆頭(1)，筆頭(I)的前端開(kāi)設(shè)有溶液流出孔，溶液流出孔內(nèi)設(shè)置有可以轉(zhuǎn)動(dòng)的球珠(3)，筆頭(I)的后端與筆桿(2)相連通，注入捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤汉?，用密封?6)將筆桿(2)密封; 3)依次持三支加樣筆在試紙上書寫線條，由捕獲溶液構(gòu)成的線條A位于試紙的下端，由對(duì)照溶液構(gòu)成的線條C位于試紙的上端，由檢測(cè)溶液構(gòu)成的線條B位于線條A與線條C之間； 4)待構(gòu)成線條的溶液干燥后，將試紙的下端浸潤(rùn)于待測(cè)樣品中，保持線條A位于待測(cè)樣品的上方，待線條C顯色并穩(wěn)定后取出試紙，觀察線條B的顯色情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種核酸檢測(cè)方法，其特征在于所述加樣筆還包括用于連接筆頭(I)與筆桿(2)的連接裝置(4)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種核酸檢測(cè)方法，其特征在于所述書寫是指將筆頭(I)前端接觸試紙，然后驅(qū)動(dòng)筆頭(I)在試紙上移動(dòng)，使筆頭(I)前端的球珠(3)轉(zhuǎn)動(dòng)，帶動(dòng)筆桿(2)內(nèi)的捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤毫鞒?，流出的捕獲溶液、檢測(cè)溶液或?qū)φ杖芤和糠笥谠嚰埳稀?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種核酸檢測(cè)方法，其特征在于所述球珠(3)的直徑為IOOnm-Icm0
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種核酸檢測(cè)方法，其特征在于所述加樣筆的加樣量范圍為IO-IOOOnL/cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種核酸檢測(cè)方法，其特征在于所述顯色顆粒包括天然顯色顆?；蚣ぐl(fā)顯色顆粒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種核酸檢測(cè)方法，將捕獲溶液、檢測(cè)溶液和對(duì)照溶液分別注入三支加樣筆的筆桿中，依次持三支加樣筆在試紙上書寫三條相互間隔的線條，將試紙的下端浸潤(rùn)于待測(cè)樣品中，保持線條A位于待測(cè)樣品的上方，待線條C顯色并穩(wěn)定后取出試紙，觀察線條B的顯色情況，本發(fā)明所述核酸檢測(cè)方法利用加樣筆在試紙上書寫微量的溶液形成捕獲線、檢測(cè)線和對(duì)照線，具有加樣儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，攜帶方便，操作容易，成本低廉，可重復(fù)使用等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)加樣器相比成本降低了一萬(wàn)多倍，同時(shí)微量加樣的準(zhǔn)確性、可靠性極佳，且容易控制，降低了核酸檢測(cè)的成本，提高了檢測(cè)速度，簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103255208SQ20131007779
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月12日
發(fā)明者王琳, 韓玉龍, 胡杰, 徐峰, 盧天健 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)