專利名稱：芽孢桿菌同步高密度發(fā)酵工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌的發(fā)酵工藝，尤其是一種操作方法簡單、可降低產(chǎn)品成本，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的芽孢桿菌同步高密度發(fā)酵工藝方法。
背景技術(shù)：
近年來，在養(yǎng)殖飼料中添加抗生素用于預(yù)防腸道疾病已很普遍，雖然取得了一定的效果，但與此同時(shí)，不僅造成細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)，而且藥物的殘留也威脅畜禽、水產(chǎn)品的食用安全，甚至直接影響人體健康。為此，人們采用了能夠替代抗生素改善養(yǎng)殖環(huán)境、減少和預(yù)防畜禽腸道疾病、降低藥殘的微生態(tài)飼料添加劑。如微生態(tài)飼料添加劑中的芽孢桿菌，就可以消耗腸道游離氧形成厭氧環(huán)境促進(jìn)腸道益生菌繁殖，產(chǎn)生多種酶，提高動(dòng)物免疫力，并能通過飼料高溫制粒，對(duì)提高飼料利用率，改善養(yǎng)殖環(huán)境和水質(zhì)等方面起到了明顯的作用。目前，在中國專利申請(qǐng)的公開文獻(xiàn)中，已經(jīng)公開了兩篇關(guān)于高密度發(fā)酵芽孢桿菌工藝，其中一篇是在芽孢桿菌發(fā)酵過程中不斷流加鐵離子營養(yǎng)液來提高活菌含量；另一篇是通過在發(fā)酵過程中添加復(fù)合微量元素提高活菌含量，由于需微濾，操作過程繁瑣，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。也有文獻(xiàn)資料顯示枯草芽孢桿菌經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)基其發(fā)酵活菌數(shù)最高可達(dá)400億/ml，但沒有進(jìn)行大罐發(fā)酵生產(chǎn)，也沒有關(guān)于芽孢率的描述。而芽孢率直接影響產(chǎn)品干燥的得率，間接影響芽孢桿菌能否更多通過飼料高溫制粒以及生產(chǎn)成本，是非常關(guān)鍵的指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種操作方法簡單、可降低產(chǎn)品成本，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的芽孢桿菌同步高密度發(fā)酵工藝方法。本發(fā)明的技術(shù)解 決方案是:一種芽孢桿菌同步超高密度發(fā)酵方法，其特征是按照以下步驟進(jìn)行:
a.發(fā)酵種子制備
在無菌環(huán)境下，將芽孢桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制備活菌數(shù)達(dá)到1(Γ20億/ml的芽孢桿菌液體種子，培養(yǎng)基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g ；
b.種子罐發(fā)酵
將芽孢桿菌液體種子接種到種子罐中,種子罐培養(yǎng)基計(jì)料體積與液體種子體積之比為500L:1000ml，培養(yǎng)基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g，121°C滅菌30min ;發(fā)酵培養(yǎng)工藝參數(shù):溫度30°C，罐壓0.Γθ.15Mpa，PH=6.5 8.0自動(dòng)調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)速60r / min，流量150m3 / h，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間5 6h ；
c.發(fā)酵罐發(fā)酵
將經(jīng)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)的芽孢桿菌移種至發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐中初始培養(yǎng)基由基為每升水中含有:大豆蛋白胨log、胰蛋白胨10g、酵母粉5g&K2HP042g，121°C滅菌30min，所述糖為每升水中含有麥芽糊精30g、葡萄糖10 g、MgS04l.5g、MnS04 0.8g、Zn SO4 0.2g, 121°C滅菌30min ;移種前調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、流量為發(fā)酵罐所設(shè)定的最大值，設(shè)定時(shí)校正DolOO點(diǎn)；
移種后初始轉(zhuǎn)速、流量為最大值的60%，發(fā)酵工藝參數(shù):溫度30°C，罐壓0.12Mpa，PH=7.0自動(dòng)調(diào)節(jié)；當(dāng)Do值降至60%時(shí)，按照每次增加轉(zhuǎn)速最大值的10%及流量最大值的10%調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和流量，使Do值維持在60%以上，直至達(dá)到發(fā)酵罐所設(shè)定的最大值并維持轉(zhuǎn)速及流量為最大值繼續(xù)發(fā)酵；當(dāng)Do降至50%時(shí)開始加糖，每半小時(shí)加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖總量與發(fā)酵罐中初始培養(yǎng)基中所加入糖的體積比為2:3 ;最后一次加糖后繼續(xù)培養(yǎng)；
d.菌體的收集
當(dāng)芽孢形成90%以上時(shí)，降轉(zhuǎn)速至80r/min，流量200m3/h，將菌液離心分離，取菌泥。本發(fā)明通過全自動(dòng)發(fā)酵在線監(jiān)測溶氧來確定糖(復(fù)合碳源和促芽孢生成劑)的流加時(shí)間，達(dá)到芽孢桿菌的緩釋利用碳源，最終達(dá)到發(fā)酵液活菌數(shù)600億/ml以上，發(fā)酵24h芽孢率即可達(dá)90%以上，整齊飽滿。產(chǎn)品干燥收率達(dá)90%，降低了產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:
a.發(fā)酵種子制備
在局部100級(jí)的無菌環(huán)境下，將從國家菌種庫得到的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的一株枯草芽孢桿菌(10035)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制備IOOOml活菌數(shù)達(dá)到1(Γ20億/ml的芽孢桿菌液體種子，培養(yǎng)基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g ；
b.種子罐發(fā)酵`
將芽孢桿菌液體種子接種到I噸種子罐中，種子罐培養(yǎng)基計(jì)料體積為500L，培養(yǎng)基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g，121°C滅菌30min ;發(fā)酵培養(yǎng)工藝參數(shù):溫度30°C，罐壓0.Γ0.15Mpa, PH=6.5 8.0自動(dòng)調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)速60r / min，流量150m3 / h，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間5 6h ；
c.發(fā)酵罐發(fā)酵
將經(jīng)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)的芽孢桿菌移種至5噸發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐中初始培養(yǎng)基由基本培養(yǎng)基與糖構(gòu)成，基本培養(yǎng)基計(jì)料體積為3000L，基本培養(yǎng)基為每升水中含有:大豆蛋白胨10g、胰蛋白胨10g、酵母粉58及K2HPO4 2g，121°C滅菌30min，所述糖為每升水中含有麥芽糊精 30g、葡萄糖 10、MgS040.5g> MnSO4 0.8g、Zn SO4 0.2g, 121°C滅菌 30min,滅菌后的糖為280L ;移種前調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至220 r / min (發(fā)酵罐設(shè)定的最大值)，流量260 m3 / h (發(fā)酵罐設(shè)定的最大值)，設(shè)定時(shí)校正DolOO點(diǎn)；
移種后初始轉(zhuǎn)速132r / min,流量156 m3 / h，發(fā)酵工藝參數(shù):溫度30°C，罐壓
0.12Mpa，PH=7.0自動(dòng)調(diào)節(jié)；當(dāng)Do值降至60%時(shí)，按照每次增加22 r / min調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和增加26 m 3 / h調(diào)節(jié)流量，使Do值維持在60%以上，直至最大轉(zhuǎn)速220r / min及最大流量260 m 3 / h，并維持轉(zhuǎn)速及流量為最大值繼續(xù)發(fā)酵；此時(shí)無法通過調(diào)節(jié)流量和轉(zhuǎn)速維持Do在60%以上，當(dāng)Do降至50%時(shí)開始加糖，每半小時(shí)加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖總量為420L，即每次加糖70L，最后一次加糖后繼續(xù)培養(yǎng)；
d.菌體的收集當(dāng)芽孢形成90%以上時(shí)，降轉(zhuǎn)速為80r/min，流量200m3/h，將菌液離心分離，取菌泥，經(jīng)檢測活菌數(shù)達(dá)600億/ml以上。菌體的收集干燥
取菌泥按質(zhì)量比為1:0.5加入載體(普通淀粉)經(jīng)高速混合后，再經(jīng)搖擺 制粒，在真空干燥機(jī)上干燥，干燥溫度85°C，真空度為0.08 Mpa,時(shí)間為2h，
產(chǎn)品干燥收率達(dá)90%以上。實(shí)施例2:
a.發(fā)酵種子制備
在局部100級(jí)的無菌環(huán)境下，將從國家菌種庫得到的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的一株枯草芽孢桿菌(10035)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制備IOOOml活菌數(shù)達(dá)到1(Γ20億/ml的芽孢桿菌液體種子，培養(yǎng)基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g ；
b.種子罐發(fā)酵
將芽孢桿菌液體種子接種到I噸種子罐中，種子罐培養(yǎng)基計(jì)料體積為500L，培養(yǎng)基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g，121°C滅菌30min ;發(fā)酵培養(yǎng)工藝參數(shù):溫度30°C，罐壓0.Γ0.15Mpa, PH=6.5 8.0自動(dòng)調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)速60r / min，流量150m3 / h，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間5 6h ；
c.發(fā)酵罐發(fā)酵
將經(jīng)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)的芽孢桿菌移種至10噸發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐中初始培養(yǎng)基由基本培養(yǎng)基與糖構(gòu)成，基本 培養(yǎng)基計(jì)料體積為6000L，基本培養(yǎng)基為每升水中含有:大豆蛋白胨10g、胰蛋白胨10g、酵母粉58及K2HPO4 2g，121°C滅菌30min，所述糖為每升水中含有麥芽糊精 30g、葡萄糖 10、MgS040.5g> MnSO4 0.8g、Zn SO4 0.2g, 121°C滅菌 30min,滅菌后的糖為280L ;移種前調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至180 r / min (發(fā)酵罐設(shè)定的最大值)，流量520 m 3 / h (發(fā)酵罐設(shè)定的最大值)，設(shè)定時(shí)校正DolOO點(diǎn)；
移種后初始轉(zhuǎn)速108r / min，流量208 m3 / h，發(fā)酵工藝參數(shù):溫度30°C，罐壓
0.12Mpa，PH=7.0自動(dòng)調(diào)節(jié)；當(dāng)Do值降至60%時(shí)，按照每次增加18 r / min調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和增加52 m 3 / h調(diào)節(jié)流量，使Do值維持在60%以上，直至最大轉(zhuǎn)速180r / min及最大流量
520m 3 / h，并維持轉(zhuǎn)速及流量為最大值繼續(xù)發(fā)酵；此時(shí)無法通過調(diào)節(jié)流量和轉(zhuǎn)速維持Do在60%以上，當(dāng)Do降至50%時(shí)開始加糖，每半小時(shí)加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖總量為420L，即每次加糖70L，最后一次加糖后繼續(xù)培養(yǎng)；
d.菌體的收集
當(dāng)芽孢形成90%以上時(shí)，降轉(zhuǎn)速為80r/min，流量200m3/h，將菌液離心分離，取菌泥，經(jīng)檢測活菌數(shù)達(dá)600億/ml以上。菌體的收集干燥
取菌泥按質(zhì)量比為1:0.5加入載體(普通淀粉)經(jīng)高速混合后，再經(jīng)搖擺制粒，在真空干燥機(jī)上干燥，干燥溫度85°C，真空度為0.08 Mpa,時(shí)間為2h，產(chǎn)品干燥收率達(dá)90%以上。
權(quán)利要求
1.一種芽孢桿菌同步超高密度發(fā)酵方法，其特征是按照以下步驟進(jìn)行: a.發(fā)酵種子制備 在無菌環(huán)境下，將芽孢桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制備活菌數(shù)達(dá)到1(Γ20億/ml的芽孢桿菌液體種子，培養(yǎng)基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g ； b.種子罐發(fā)酵 將芽孢桿菌液體種子接種到種子罐中,種子罐培養(yǎng)基計(jì)料體積與液體種子體積之比為500L:1000ml，培養(yǎng)基為每升水中含有:胰蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖IOg及K2HPO4 3g，121°C滅菌30min ;發(fā)酵培養(yǎng)工藝參數(shù):溫度30°C，罐壓0.Γθ.15Mpa，PH=6.5 8.0自動(dòng)調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)速60r / min，流量150m3 / h，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間5 6h ； c.發(fā)酵罐發(fā)酵 將經(jīng)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)的芽孢桿菌移種至發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐中初始培養(yǎng)基由基為每升水中含有:大豆蛋白胨log、胰蛋白胨10g、酵母粉5g&K2HP04 2g，121°C滅菌30min，所述糖為每升水中含有麥芽糊精30g、葡萄糖10、MgSO4L 5g、MnSO4 0.8g、Zn SO4 0.2g，121°C滅菌30min ;移種前調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、流量為發(fā)酵罐所設(shè)定的最大值，設(shè)定時(shí)校正DolOO點(diǎn)； 移種后初始轉(zhuǎn)速、流量為最大值的60%，發(fā)酵工藝參數(shù):溫度30°C，罐壓0.12Mpa，PH=7.0自動(dòng)調(diào)節(jié)；當(dāng)Do值降至60%時(shí)，按照每次增加轉(zhuǎn)速最大值的10%及流量最大值的10%調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和流量，使Do值維持在60%以上，直至達(dá)到發(fā)酵罐所設(shè)定的最大值并維持轉(zhuǎn)速及流量為最大值繼續(xù)發(fā)酵；當(dāng)Do降至50%時(shí)開始加糖，每半小時(shí)加一次糖，共加六次糖，每次加糖量均等，加糖總量與發(fā)酵罐中初始培養(yǎng)基中所加入糖的體積比為2:3 ;最后一次加糖后繼續(xù)培養(yǎng)； d.菌體的收集 當(dāng)芽孢形成90%以上時(shí)，降轉(zhuǎn)速至80r/min，流量200m3/h，將菌液離心分離，取菌泥。
全文摘要
本發(fā)明公開一種操作方法簡單、可降低產(chǎn)品成本，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的芽孢桿菌同步高密度發(fā)酵工藝方法，是經(jīng)過制備液體種子、種子罐發(fā)酵及發(fā)酵罐擴(kuò)大，本發(fā)明通過全自動(dòng)發(fā)酵在線監(jiān)測溶氧來確定糖(復(fù)合碳源和促芽孢生成劑)的流加時(shí)間，達(dá)到芽孢桿菌的緩釋利用碳源，最終達(dá)到發(fā)酵液活菌數(shù)600億/ml以上，發(fā)酵24h芽孢率即可達(dá)90%以上，整齊飽滿。產(chǎn)品干燥收率達(dá)90%以上，降低了產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12R1/125GK103114060SQ20131003091
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者莊國宏, 王效禹, 張琪, 吳磊, 潘艷妮, 李雙喜 申請(qǐng)人:大連三儀動(dòng)物藥品有限公司