專利名稱：一種用磁性微球固定化米糠谷氨酸脫羧酶制備γ-氨基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用磁性微球固定化米糠谷氨酸脫羧酶制備Y-氨基丁酸的方法，屬于米糠深加工技術(shù)領(lǐng)域。。
背景技術(shù)：
米糠作為稻谷的副產(chǎn)物，在中國(guó)來源十分豐富，可通過加工利用以實(shí)現(xiàn)其很高的附加值。米糠中的谷氨酸脫羧酶的酶活力很高，可以作為一種很好的催化劑，催化谷氨酸鈉通過脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化為GABA。GABA具有抗衰老、治療癲癇、改善失眠等生理作用。目前世界上已經(jīng)研究出GABA茶葉、高GABA糧食等，有良好的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用磁性微球固定化米糠谷氨酸脫羧酶制備Y-氨基丁酸的方法，用磁性殼聚糖微球固定從米糠中提取的谷氨酸脫羧酶，得到的GABA制備液中成分簡(jiǎn)單，且固定化酶易分離、可重復(fù)利用，從而實(shí)現(xiàn)GABA的制備與分離的同步進(jìn)行，可擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。 本發(fā)明的技術(shù)方案一種用磁性微球固定化米糠中谷氨酸脫羧酶制備Y -氨基丁酸的方法，先將米糠用酶提取液提取出谷氨酸脫羧酶，與制備好的磁性殼聚糖微球進(jìn)行微粒反應(yīng)，得到磁性固定化谷氨酸脫羧酶；將此固定化酶與反應(yīng)液混合，加入O. 01-0. 05mol/L的谷氨酸鈉作為底物，搖床反應(yīng)得到GABA制備液；(I)提取谷氨酸脫羧酶將新鮮米糠加入酶提取液中，提取谷氨酸脫羧酶。其中酶提取液為 pH5. 6,0. 05mol/LPBS 緩沖液，2mmol/L2_ 巰基乙醇，2mmol/LEDTA- 二鈉，Immol/LPLP, ImmoI/L PMSF 和 10%甘油。(2)磁性殼聚糖微球的制備0. 5g磁性納米微粒與20mL2. 5%的殼聚糖乙酸溶液混合，在攪拌下緩慢加入到80mL液體石臘和4mL Span-80混合溶液中，常溫?cái)嚢?0min,加入10mL8%的戊二醛，40°C攪拌lh，用lmol/L NaOH溶液調(diào)pH至9-10，70°C攪拌2h，用磁鐵吸出微球，并先后用石油醚、丙酮、蒸餾水反復(fù)洗滌，于60°C下真空干燥。磁性納米微粒應(yīng)粒徑分布均勻，以保證固定后的磁性殼聚糖微球粒徑分布均勻。(3)固定谷氨酸脫羧酶將制備好的磁性殼聚糖微球在pH4. 8-6. 4、0. 05mol/LPBS緩沖液中浸泡12h，加入I % -3%戊二醛交聯(lián)2-6h，用PBS緩沖液反復(fù)洗滌磁性微球，再加入一定濃度的谷氨酸脫羧酶酶液固定l_5h，用PBS緩沖液反復(fù)洗滌磁性微球。(4)制備GABA :將固定化酶與ρΗ5· 6,0. 01-0. 05mol/L HAc-NaAc緩沖液混合，加入O. 01-0. 05mol/L的谷氨酸鈉作為底物，在45°C下?lián)u床反應(yīng)6_14h得到GABA制備液。本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明方法制備的固定化谷氨酸脫羧酶，與游離酶相比，由于其具有磁性，可以利用磁鐵直接從反應(yīng)體系中完全分離，操作方便簡(jiǎn)單。本發(fā)明方法制備的GABA，與傳統(tǒng)的直接富集法相比，成分相對(duì)簡(jiǎn)單，蛋白含量和糖含量基本為零。并且在過程中實(shí)現(xiàn)了 GABA的制備與分離同步進(jìn)行，簡(jiǎn)化了操作，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。


圖1為一種用磁性微球固定化米糠谷氨酸脫羧酶制備Y -氨基丁酸的方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1稱取IOg磁性殼聚糖微球，在pH5. 6,0. 05mol/LPBS緩沖液中浸泡12h，使其充分溶脹。加入濃度為1. 5%的戊二醛溶液，常溫下避光交聯(lián)4h。用磁鐵吸出磁性微球，并用PBS緩沖液充分洗滌至檢測(cè)不到戊二醛。稱取冷凍干燥的谷氨酸脫羧酶，配制成蛋白質(zhì)含量為lmg/mL的溶液進(jìn)行復(fù)溶，離心取上清液IOOmL,加入上述磁性微球，4°C下固定3h。用磁鐵吸出磁性微球，并用PBS緩沖液充分洗滌至無游離酶存在。將該磁性微球加入IOOmL pH5. 6、O. 05mol/LHAc-NaAc緩沖液中，再加入O. 04mol/L谷氨酸鈉底物，在45°C水浴搖床上反應(yīng)8h，用磁鐵吸出磁性微球，溶液即為GABA制備液。實(shí)施例2稱取IOg磁性殼聚糖微球，在pH5. 2、0.05mol/LPBS緩沖液中浸泡12h，使其充分溶脹。加入濃度為2%的戊二醛溶液，常溫下避光交聯(lián)5h。用磁鐵吸出磁性微球，并用PBS緩沖液充分洗滌至檢測(cè)不到戊二醛。稱取冷凍干燥的谷氨酸脫羧酶，配制成蛋白質(zhì)含量為lmg/mL的溶液進(jìn)行復(fù)溶，離心 取上清液IOOmL,加入上述磁性微球，4°C下固定2h。用磁鐵吸出磁性微球，并用PBS緩沖液充分洗滌至無游離酶存在。將該磁性微球加入IOOmL pH5. 6、O. 05mol/L HAc-NaAc緩沖液中，再加入O. 03mol/L谷氨酸鈉底物，在45°C水浴搖床上反應(yīng)10h，用磁鐵吸出磁性微球，溶液即為GABA制備液。
權(quán)利要求
1.一種用磁性微球固定化米糠谷氨酸脫羧酶制備Y-氨基丁酸的方法，其特征是將米糠用酶提取液提取出谷氨酸脫羧酶，與制備好的磁性殼聚糖微球進(jìn)行微粒反應(yīng)，得到磁性固定化谷氨酸脫羧酶；將此固定化酶與反應(yīng)液混合，加入O. 01-0. 05mol/L的谷氨酸鈉作為底物，搖床反應(yīng)得到Y(jié)-氨基丁酸制備液，具體工藝如下(1)提取谷氨酸脫羧酶新鮮米糠加入酶提取液，提取谷氨酸脫羧酶；(2)磁性殼聚糖微球的制備0.5g磁性納米微粒與20mL2. 5%的殼聚糖乙酸溶液混合，在攪拌下緩慢加入到80mL液體石臘和4mL Span-80混合溶液中，常溫?cái)嚢?0min,加入 10mL8%的戊二醛，40°C攪拌lh，再用Imol/LNaOH溶液調(diào)pH至9_10，70°C攪拌2h，用磁鐵吸出微球，并先后用石油醚、丙酮、蒸餾水反復(fù)洗滌，于60°C下真空干燥；(3)固定谷氨酸脫羧酶0.05mol/LPBS緩沖液浸泡磁性殼聚糖微球12h，使其充分溶脹；加入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，用PBS緩沖液反復(fù)洗滌磁性微球；再加入一定濃度的酶液進(jìn)行固定，用PBS緩沖液反復(fù)洗滌磁性微球；(4)制備Y-氨基丁酸將固定化酶與反應(yīng)液混合，加入O.01-0. 05mol/L的谷氨酸鈉作為底物，搖床反應(yīng)得到Y(jié)-氨基丁酸制備液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磁性微球固定化米糠中谷氨酸脫羧酶制備Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述的磁性納米微粒指的是具有生物活性的磁性納米微粒，其粒徑分布均勻，平均粒徑為20nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磁性微球固定化米糠中谷氨酸脫羧酶制備Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述的磁性殼聚糖微球固定谷氨酸脫羧酶的反應(yīng)的PBS緩沖液的pH 值在4. 8-6. 4之間，戊二醛濃度為1% -3%，交聯(lián)2-6h，固定l_5h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磁性微球固定化米糠中谷氨酸脫羧酶制備Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述的固定化酶制備Y-氨基丁酸反應(yīng)的反應(yīng)液為PH5. 6、O.01-0. 05mo/LHAc-NaAc 緩沖液，反應(yīng)時(shí)間 6_14h，底物濃度為 O. 01-0. 05mol/L。
全文摘要
一種用磁性微球固定化米糠谷氨酸脫羧酶制備γ-氨基丁酸的方法，屬于米糠深加工技術(shù)領(lǐng)域。在傳統(tǒng)制備γ-氨基丁酸(GABA)的方法中，所得產(chǎn)品蛋白、糖等雜質(zhì)含量高，GABA純度低，因此需要一種方法來提高GABA產(chǎn)品的純度。本發(fā)明以稻谷加工后的副產(chǎn)物——新鮮米糠為原料，提取谷氨酸脫羧酶，以磁性殼聚糖微球作為固定化材料，來固定谷氨酸脫羧酶，并用此固定化酶來轉(zhuǎn)化底物谷氨酸鈉為GABA。該方法具有固定化酶易分離、可反復(fù)回收利用、反應(yīng)過程溫和，且GABA制備液成分相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)實(shí)現(xiàn)米糠的綜合利用價(jià)值和提高其經(jīng)濟(jì)效益有重要的意義。
文檔編號(hào)C12N9/88GK103045666SQ20131002389
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者張暉, 張媛媛, 齊希光, 錢海峰, 王立 申請(qǐng)人:江南大學(xué)