具有溶菌酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有溶菌酶活性的分離的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體、載體以及包括這些多核苷酸的宿主細(xì)胞連同產(chǎn)生和使用這些多肽的方法。
【專利說明】具有溶菌酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸[0001 ] 參考序列表
[0002]本申請包含一個計算機可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。
[0003]原子坐標(biāo)的引用
[0004]本申請將Acremonium alkalophilum CBS114.92溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)列于圖6中。
[0005]發(fā)明背景
發(fā)明領(lǐng)域
[0006]本發(fā)明涉及具有溶菌酶活性的多肽、催化結(jié)構(gòu)域以及編碼這些多肽和催化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體、載體以及包括這些多核苷酸的宿主細(xì)胞連同生產(chǎn)和使用這些多肽和催化結(jié)構(gòu)域的方法。
[0007]相關(guān)技術(shù)說明
[0008]溶菌酶是一種由許多生物作為對抗細(xì)菌的防御性機制而產(chǎn)生的O-糖基水解酶。該酶通過裂解肽聚糖的糖苷鍵來水解細(xì)菌的細(xì)胞壁；肽聚糖是細(xì)菌中的一種重要的結(jié)構(gòu)分子。在細(xì)菌的細(xì)胞壁被溶菌酶作用弱化后，由滲透壓導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞溶解。
[0009]溶菌酶出現(xiàn)在許多生物中，例如病毒、植物、昆蟲、鳥類、爬行類以及哺乳類。在哺乳類中，已經(jīng)從鼻腔分泌物、唾液、眼淚、腸、尿和乳中分離到溶菌酶。該酶裂解N-乙酰胞壁酸的I號碳與N-乙酰-D-葡糖胺的4號碳之間的糖苷鍵。在體內(nèi)，這兩種碳水化合物聚合以形成細(xì)胞壁多糖。
[0010]在溶菌酶作為抗微生物劑的潛力方面的興趣日益增加。例如，已經(jīng)顯示溶菌酶活性對抗病原體，如肺炎鏈球菌、炭疽桿菌、屎腸球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、肉毒桿菌、丁酸梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、酪丁酸梭菌、以及單核細(xì)胞增生利斯特菌。
[0011]已經(jīng)將溶菌酶分類為五種不同的糖苷水解酶(GH)家族(CAZy,www.cazy.0rg):母雞蛋白溶菌酶(GH22)，鵝蛋白溶菌酶(GH23)，噬菌體T4溶菌酶(GH24)，鞘氨醇單胞菌鞭毛蛋白(GH73)以及Chalaropsis溶菌酶(GH25)。來自家族GH23和GH24的溶菌酶主要從噬菌體中已知并且還未在真菌中鑒別。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)溶菌酶家族GH25與其他溶菌酶家族在結(jié)構(gòu)上是不相關(guān)的。
[0012]已經(jīng)提出了溶菌酶在動物飼料(參見例如W000/21381和W004/026334)，在乳酪生產(chǎn)(參見例如W005/080559)、食品保藏(Hughey (休伊)和Johnson(約翰遜)(1987)ApplEnviron Microbiol (《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》)53:2165)、洗滌劑(參見例如US5，041，236和 EP0425016)，在口腔護理(參見例如 US4, 355，022、W004/017988 和 W008/124764)、美容和皮膚學(xué)、避孕、泌尿?qū)W、以及婦科(參見例如W008/124764)中的用途。
[0013] 已經(jīng)從擬鞘孢屬(Chalaropsis)報道了一種GH25溶菌酶(Felsch(費什)Jff, Ingagami (英戈米)T,和 Hash (哈什)JH.(1975), “The N, O-Diacetylmuramidaseof Chalaropsis species ；V The complete amino acid sequence(Chalaropsis 物種的N，O- 二乙酰胞壁質(zhì)酶；V，完整氨基酸序列)，J.Biol.Chem.(《生物化學(xué)雜志》)250(10):3713-3720)。
[0014]作為在商業(yè)市場可獲得的主要產(chǎn)品的母雞蛋白溶菌酶不裂解例如金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁中的N，6-0- 二乙酰胞壁質(zhì)酶并且因此尤其不能溶解這一重要的人類病原體(Masschalck(馬斯克)B, Deckers (德克斯)D, Michiels (米蓋爾思)CW(2002)，“Lyticand nonlytic mechanism of inactivation of gram-positive bacteria by lysozymeunder atmospheric and high hydrostatic pressure (在大氣壓和高流體靜力壓下由溶菌酶滅活革蘭氏陽性細(xì)菌的溶解和非溶解機制)”，J Food Prot.(《食品保護雜志》)65(12):1916-23)。
[0015]已經(jīng)觀察到不同的溶菌酶針對不同微生物具有不同的特異性。所以，令人希望的是使得若干溶菌酶可得，以便能夠針對每種具體的應(yīng)用選擇適合的酶。所以，具有溶菌酶活性的新的多肽是令人希望的。
[0016]發(fā)明概述
[0017]本發(fā)明涉及屬于GH25家族并且具有溶菌酶活性的分離的真菌多肽。
[0018]本發(fā)明進一步涉及具有溶菌酶活性的分離的多肽，這些多肽選自下組，該組由以下各項組成:
[0019](a)與SEQ ID NO:4的成熟多肽或與SEQ ID N0:8的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一種多 肽；
[0020](b)由以下一種多核苷酸編碼的一種多肽,該多核苷酸與SEQ ID NO: 3的成熟多肽編碼序列或與SEQ ID NO:7的成熟多肽編碼序列具有至少80%序列一致性；
[0021](c)由以下一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:7的成熟多肽編碼序列、或其全長互補體雜交；
[0022](d)SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:8的成熟多肽的一種變體，該變體在一個或多個(例如，若干個)位置處包括取代、缺失和/或插入；以及
[0023](e)具有溶菌酶活性的(a)、(b)、(C)、或(d)的多肽的一個片段。
[0024]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸；核酸構(gòu)建體；重組表達載體；包括這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些多肽的方法。
[0025]此外，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的多肽的組合物，例如洗滌劑組合物、動物飼料組合物以及細(xì)菌的基因組DNA提取組合物。
[0026]本發(fā)明還涉及具有抗微生物活性的本發(fā)明的多肽以及將本發(fā)明的這些多肽用作生物膜形成的抑制劑，在洗滌劑、在牙齒護理、在動物飼料中使用并且用于分解細(xì)菌的細(xì)胞壁的方法。
[0027]本發(fā)明還涉及一種編碼信號肽的多核苷酸，該信號肽包括SEQ ID N0:4的氨基酸I至19或SEQ ID NO: 8的氨基酸-23至-1或由其組成，該多核苷酸被可操作地連接至編碼一種蛋白質(zhì)的基因；涉及核酸構(gòu)建體、表達載體、以及包括這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及涉及產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)的方法。
[0028]序列表綜述
[0029]SEQ ID NO:1 是如從 Acremonium alkalophilum CBS114.92 中分離的 P244A7GH24基因的DNA序列。[0030]SEQ ID NO: 2是如從SEQ ID NO:1推導(dǎo)的氨基酸序列。
[0031]SEQ ID NO: 3 是如從 Acremonium alkalophilum CBS114.92 中分離的 P242M9GH25基因的DNA序列。
[0032]SEQ ID NO:4是如從SEQ ID NO:3推導(dǎo)的氨基酸序列。
[0033]SEQ ID NO:5 是正向引物 F-P242M9。
[0034]SEQ ID NO:6 是反向引物 R-P242M9。
[0035]SEQ ID NO: 7是合成地優(yōu)化的GH25基因的DNA序列。
[0036]SEQ ID NO:8是如從SEQ ID NO:7推導(dǎo)的氨基酸序列。
[0037]SEQ ID NO:9 是正向引物 BamHI。
[0038]SEQ ID NO: 10 是反向引物 EcoRI。
[0039]附圖簡要說明
[0040]圖1 不出了 Acremonium alcalophilum GH24 溶菌酶(EXP03890, SEQ ID NO:2) >Acremonium alcalophilum GH25 溶菌酶(EXP03864, SEQ ID NO:4)以及一種來自煙曲霉GH25的參考溶菌酶在肉葡萄球菌和大腸桿菌上的徑向擴散測定(radial diffusionassays)。
[0041]圖 2 示出了 Acremonium alcalophilum GH25 溶菌酶 P242M9 (SEQ ID NO: 4)在 30或60秒鐘后在60°C、76°C、70°C、75°C、8(rC以及85°C下的溫度穩(wěn)定性，如在540nm在分光光度計中所測量的重懸滕黃微球菌ATTC N0.4698的溶液的光密度下降。
[0042]圖3 示出了 GH25 溶菌酶 P242M9 (SEQ ID NO: 4)在 50mM 乙酸鈉(pH4.5)、50mM 乙酸鈉(ρΗ5.5)以及50mM MES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)(ρΗ6.5)中如使用差示掃描量熱法(DSC)所確定的熱穩(wěn)定性。
[0043]圖4示出了 4個濃度的GH25溶菌酶Ρ242Μ9 (SEQ ID NO: 4),合成GH25溶菌酶(SEQID NO:8)以及SEQ ID NO:8的11個變體的溶菌酶活性，如通過重懸產(chǎn)氣莢膜梭菌ΝΝ01260的溶液的光密度下降所確定的。
[0044]圖5示出了 4個濃度的GH25溶菌酶Ρ242Μ9 (SEQ ID NO: 4),合成GH25溶菌酶(SEQID NO:8)以及SEQ ID Ν0:8的11個變體的溶菌酶活性，如通過重懸產(chǎn)氣莢膜梭菌臨床分離株的溶液的光密度下降所確定的。
[0045]圖6列出了 Acremonium alkalophilum CBS114.92GH25 溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)。這些原子坐標(biāo)可以協(xié)助生成描繪Acremonium alkalophilum CBS114.92GH25溶菌酶的結(jié)構(gòu)的三維模型以及同源結(jié)構(gòu)(例如上述溶菌酶的變體)的三維模型。
[0046]定義
[0047]溶菌酶:在此將術(shù)語“溶菌酶”活性定義為一種催化兩個或更多個碳水化合物之間、或碳水化合物與非碳水化合物部分之間的糖苷鍵的水解的O-糖基水解酶。溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的黏多糖和黏肽中的某些殘基之間的糖苷鍵，例如在肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸與N-乙酰-D-葡糖胺殘基之間以及在殼糊精中的N-乙酰-D-葡糖胺殘基之間的1，4- β -鍵，這導(dǎo)致溶菌作用。溶菌酶屬于EC3.2.1.17酶類。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)描述于實例4中的濁度測定確定溶菌酶活性。在一個方面中，本發(fā)明的多肽具有至少20%，例如至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、或至少100 %的SEQ ID Ν0:4或SEQ ID Ν0:8的成熟多肽的溶菌酶活性。[0048]等位變體:術(shù)語“等位變體”是指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可變形式中的任何。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?編碼的多肽中無改變)，或可以編碼出具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
[0049]抗微生物活性:在此將術(shù)語“抗微生物活性”定義為一種殺死微生物或抑制微生物的生長的活性，這些微生物是例如藻類、古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌和/或原生動物?？刮⑸锘钚钥梢允抢缫庠跉⑺兰?xì)菌的殺菌的或意在阻止細(xì)菌的生長的抑菌的?？刮⑸锘钚钥梢园ù呋陔木厶侵械腘-乙酰胞壁酸與N-乙酰-D-葡糖胺殘基之間以及在殼糊精中的N-乙酰-D-葡糖胺殘基之間的1，4-β-鍵的水解。抗微生物活性還可以包括溶菌酶結(jié)合在微生物的表面并抑制其生長。抗微生物作用還可以包括通過抑制或減少細(xì)菌毒素并且通過噬菌素作用使用本發(fā)明的溶菌酶作為免疫刺激劑激活細(xì)菌自溶素。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)描述于實例10中的抗微生物測定確定抗微生物活性。
[0050]改變的/修飾的特性:在此將“改變的/修飾的特性”定義為與相對于親本溶菌酶或鑒別的參考序列相比被改變或修飾的變體相關(guān)的特征。除非另行說明，改變的或修飾的特性可以是一種與相對于另一種參考溶菌酶或親本溶菌酶被改進的變體相關(guān)的特征。下面給出了可以被改變/修飾或改進的特性的實例。
[0051]熱穩(wěn)定性:術(shù)語“熱穩(wěn)定性”是指相對于親本或鑒別的參考序列在升高的溫度下，在緩沖液中或在例如在產(chǎn)品儲存/運輸過程中存在的那些條件下或類似于在工業(yè)使用該變體的過程中存在的那些條件下，在一段孵育期后的溶菌酶活性。變體可以或可以不展示出相對于親本的改變的熱活性曲線。在一個方面中，在選定的溫度下，具有溶菌酶活性的變體的熱穩(wěn)定性是親本或參考序列熱穩(wěn)定性的至少1.0倍，例如至少1.1倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、以及至少25倍。優(yōu)選地，使用描述于“材料與方法”部分中的溶菌酶濁度活性測定測試該活性。
[0052]溫度曲線/溫度穩(wěn)定性:術(shù)語“溫度曲線/溫度穩(wěn)定性”是指與親本或鑒別的參考序列相比，該變體酶顯示出改變的溫度曲線，其中將該溫度曲線確定為作為溫度的函數(shù)的溶菌酶活性。優(yōu)選地，將在每一溫度下的活性表示為標(biāo)準(zhǔn)化至在最適溫度下的值的相對活性(以％ )。最適溫度是在被測試溫度(即具有5°C -10°C跳躍的那些)內(nèi)該活性最高的溫度。
[0053]pH穩(wěn)定性:術(shù)語“pH穩(wěn)定性”是指在超出該酶在其中有活性的pH范圍(pH活性范圍)的PH下，在一段孵育期后，變體酶展示出相對于親本或鑒別的參考序列的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。這樣的一種變體可以或可以不展示出相對于親本的改變的PH活性曲線。例如，該變體在增加的或降低的PH下可以是沒活性的，但是能夠保持其三維結(jié)構(gòu)并且然后一旦它被回復(fù)到PH活性范圍便恢復(fù)活性?？商娲?，在增加的或降低的pH下孵育后，該變體可以具有相對于親本的改進的復(fù)性能力。
[0054]在一個方面中 ，pH穩(wěn)定性曲線被改變，這樣使得溶菌酶變體在酸性pH下具有改進的穩(wěn)定性。如在此使用，酸性pH意指從pH2至5.5，優(yōu)選是從2.5至5.25，更優(yōu)選是從3至
5,甚至更優(yōu)選是從3.5至4。優(yōu)選地，當(dāng)在給定的pH下孵育I小時后，當(dāng)與已經(jīng)在pH6.5下維持相同的時間的變體相比時，該變體溶菌酶維持至少40%，優(yōu)選是至少50%、60%、70%或80 %，更優(yōu)選是至少90 %，甚至更優(yōu)選是至少95 %的殘余活性。優(yōu)選地，該變體溶菌酶的殘余活性比已經(jīng)在相同條件下處理的親本溶菌酶或鑒別的參考序列的殘余活性高至少1.1倍、至少1.3倍、至少1.5倍，優(yōu)選是至少2倍，更優(yōu)選是至少5倍，最優(yōu)選是至少7倍，并且甚至最優(yōu)選是至少10倍。優(yōu)選地，使用描述于“材料與方法”部分中的溶菌酶濁度活性測定測試該活性。
[0055]pH活性:在此將術(shù)語“pH活性”定義為當(dāng)與親本溶菌酶或鑒別的參考序列的pH活性曲線相比時，變體溶菌酶展示出pH依賴性活性曲線的改變。pH活性曲線提供了在給定的條件(例如溫度和溶劑成分)下，在PH范圍內(nèi)該酶在阻止微生物生長、消除微生物細(xì)胞和/或催化水解反應(yīng)中的效率的量度。溶菌酶具有特定的PH范圍，在該范圍內(nèi)該多肽是穩(wěn)定的并且保留其酶活性，超出這一范圍，該溶菌酶變得不具有活性并且可能也不穩(wěn)定。在該PH范圍內(nèi)通常存在該溶菌酶顯示出最高活性的pH最佳值。
[0056]在堿性pH(例如從pH7.5至12，優(yōu)選是從8至11，更優(yōu)選是從8.5至10，甚至更優(yōu)選是從9至9.5)下具有改進的活性的溶菌酶變體將能夠在更具堿性的環(huán)境(例如洗滌劑)中起作用。
[0057]在酸性pH(例如從pH2至6.5，優(yōu)選是從2.5至6，更優(yōu)選是從3至5.5，甚至更優(yōu)選是從3.5至5)下具有改進的活性的變體將能夠在更具酸性的條件(例如在某些食物中的防腐劑)下起作用。
[0058]在中性或弱酸性pH(如從pH4至7.0，優(yōu)選是從4.5至6.5，更優(yōu)選是從5至6.5)下具有改進的活性的變體將能夠在弱酸性或中性條件下起作用，例如用于飼料中的益生分子，來穩(wěn)定動物的健康微生物菌落或通過抑制動物的GI道中的病毒性病原體、寄生蟲病原體或細(xì)菌性病原體的生長/腸道定植(intestinal colonization)。
[0059]在一個方面中，pH活性曲線被改變，這樣使得溶菌酶變體在更具堿性的pH下具有改進的活性。優(yōu)選地，在高至少0.5個單位、優(yōu)選高至少1.0pH單位、更優(yōu)選高至少1.5pH單位、甚至更優(yōu)選的高至少2.0pH單位的pH下，該溶菌酶變體的活性比親本酶或鑒別的參考序列的活性高至少1.1倍、優(yōu)選是至少1.5倍、更優(yōu)選是至少2倍、甚至更優(yōu)選是至少5倍并且最優(yōu)選是至少10倍。優(yōu)選地，該溶菌酶變體在相同時間維持親本溶菌酶或鑒別的參考序列在其pH最佳值下展示出的至少40 %，優(yōu)選是至少50 %、60 %、70 %或80 %、或90 %，更優(yōu)選是至少95%，甚至更優(yōu)選是至少100%的活性。優(yōu)選地，使用描述于“材料與方法”部分中的溶菌酶濁度活性測定測試該活性。
[0060]在另一個方面中，pH活性曲線被改變，這樣使得溶菌酶變體在更具酸性的pH下具有改進的活性。優(yōu)選地，在低至少0.5個單位、優(yōu)選低至少1.0pH單位、更優(yōu)選低至少1.5pH單位、甚至更優(yōu)選的低至少2.0pH單位的pH下，該溶菌酶變體的活性比親本酶或鑒別的參考序列的活性高至少1.1倍、優(yōu)選是至少1.5倍、更優(yōu)選是至少2倍、甚至更優(yōu)選是至少5倍并且最優(yōu)選是至少10倍。優(yōu)選地，該溶菌酶變體在相同時間維持親本溶菌酶或鑒別的參考序列在其pH最佳值下展示出的至少40 %，優(yōu)選是至少50 %、60 %、70 %或80 %、或90 %，更優(yōu)選是至少95%，甚至更優(yōu)選是至少100%的活性。優(yōu)選地，使用描述于“材料與方法”部分中的溶菌酶濁度活性測定測試該活性。
[0061] 底物特異性:術(shù)語“底物特異性”是指對于該溶菌酶可以殺死/抑制的細(xì)菌的類型和/或關(guān)于模型溶菌酶底物(例如P-NP- (NAG-NAM) η或p_NP_ (NAG) m寡聚體)的該溶菌酶的特異性。通過修飾該溶菌酶的底物特異性，可以改變該溶菌酶可以殺死和/或抑制的細(xì)菌的類型。在一個方面中，將該溶菌酶的底物特異性拓寬，由此允許殺死和/或抑制除了野生型溶菌酶可以殺死和/或抑制的細(xì)菌以外的其他類型的細(xì)菌。
[0062]糖化作用敏感性:非酶的糖化作用是一種自發(fā)的翻譯后過程，其中還原糖共價地結(jié)合至主要在賴氨酸(K)殘基上的蛋白質(zhì)中的游離氨基基團。糖化作用可以影響溶菌酶的活性。根據(jù)本發(fā)明，可以通過指定的氨基酸改變來減少溶菌酶對非酶的糖化作用的敏感性。
[0063]改進的特性還可以包括熱特性，例如造粒穩(wěn)定性、蒸汽穩(wěn)定性、更寬的溫度活性曲線。另外的改進的特性可以包括蛋白酶靈敏度、和/或糖基化模式。優(yōu)選地，關(guān)于所希望的應(yīng)用條件評估改進。
[0064] 催化結(jié)構(gòu)域:術(shù)語“催化結(jié)構(gòu)域”是指含有酶的催化機構(gòu)的酶的區(qū)域。
[0065]cDNA:術(shù)語“cDNA”是指可以通過得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反轉(zhuǎn)錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。早先的初始RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的步驟進行加工，包括剪接。
[0066]編碼序列:術(shù)語“編碼序列”是指多核苷酸，其直接明確多肽的氨基酸序列。編碼序列的邊界通常由開放讀碼框確定，其以起始密碼子例如ATG、GTG或TTG開始，并以終止密碼子例如TAA、TAG或TGA結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0067]控制序列:術(shù)語“控制序列”是指表達編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。各個控制序列可以相對于編碼多肽的多核苷酸是原生的(native)(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對于彼此是原生的或外源的。這樣的控制序列包括但不局限于前導(dǎo)子，聚腺苷酸化序列，前肽序列，啟動子，信號肽序列，和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號?？梢詾檫@些控制序列提供為了特定限制性位點引入的接頭，從而促進這些控制序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)連接。
[0068]表達:術(shù)語“表達”包括產(chǎn)生多肽涉及的任何步驟，包括但不局限于:轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、和分泌。
[0069]表達載體:術(shù)語“表達載體”是指包括編碼多肽的多核苷酸并且可操作地與提供了其表達的控制序列相連接的線性或環(huán)狀DNA分子。
[0070]片段:術(shù)語“片段”意指具有從成熟多肽或結(jié)構(gòu)域的氨基和/或羧基端缺失的一個或多個(例如，若干個)氨基酸的多肽或催化結(jié)構(gòu)域；其中，該片段具有溶菌酶活性。在一個方面中，片段包含至少184個氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:4的氨基酸25至208)、或至少195個氨基酸殘基(例如，SEQ ID N0:4的氨基酸22至216)。在另外的方面中，片段包含至少184個氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:8的氨基酸10至193)、或至少195個氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:8的氨基酸5至199)。
[0071]宿主細(xì)胞:術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指對轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等敏感的任何細(xì)胞類型，其具有包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0072]分離的:術(shù)語“分離的”是指處于非天然出現(xiàn)的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實例包括(I)任何非天然出現(xiàn)的物質(zhì)，(2)任何物質(zhì)，包括但不限于從與其性質(zhì)上相關(guān)的一種或多種或所有天然發(fā)生的組分至少部分地移除的任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；⑶相對于自然中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，由人手工修飾的物質(zhì)；或⑷通過相對于與其天然相關(guān)的其他組分，增加物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)(例如編碼該物質(zhì)的基因的多個拷貝；使用比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟動子更強的啟動子)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。
[0073]成熟多肽:術(shù)語“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后處于其最終形式的多肽。在一個方面中，基于預(yù)測SEQID NO:4的氨基酸I至19和SEQ ID NO:8的氨基酸-40至-18是信號肽的SignalP程序(Nielsen(尼爾森)等人，1997,Protein Engineering(蛋白質(zhì)工程)10:1-6),該成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸20至227或SEQ ID NO:8的氨基酸I至208。本領(lǐng)域已知，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達的兩種或更多種不同的成熟多肽的混合物(即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)。
[0074]成熟多肽編碼序列:術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有溶菌酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一個方面中，基于預(yù)測SEQ ID NO:3的核苷酸I至57和SEQ ID NO:7的核苷酸I至69編碼信號肽的SignalP程序(尼爾森等人，1997，同上)，該成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO: 3的核苷酸58至147和核苷酸302至835與SEQ ID NO: 7的核苷酸121至744的結(jié)合序列。
[0075]核酸構(gòu)建體:術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指從天然存在的基因中分離的、或以自然中不會另外出現(xiàn)的方式被修飾成包含核酸區(qū)段的、或合成的單鏈亦或雙鏈的核酸分子，它包含一個或多個控制序列。
[0076]可操作地連接:術(shù)語“可操作地連接”是指一種配置，其中控制序列位于相對于多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置處，這樣使得該控制序列指導(dǎo)該編碼序列的表達。
[0077]序列一致性:用參 數(shù)“序列一致性”來描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。
[0078]出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，J.Mol.Biol.(《分子生物學(xué)雜志》)48:443-453)來確定兩個氨基酸序列之間的序列一致性，該算法如 EMBOSS 軟件包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite (歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件)，Rice (賴斯)等人,2000, Trends Genet.(《遺傳學(xué)趨勢》)16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的Needle程序所實施的。使用的這些參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。標(biāo)記為“最長一致性”的Needle (尼德爾)的輸出(使用-nobrief選項獲得)被用作百分比一致性并且被計算如下:
[0079](一致的殘基X 100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))
[0080]出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，同上)確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性，該算法如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite (歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件)，賴斯等人，2000，同上)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的Needle程序所實施的。使用的這些參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。標(biāo)記為“最長一致性”的Needle (尼德爾)的輸出(使用-nobrief選項獲得)被用作百分比一致性并且被計算如下:
[0081](一致的脫氧核糖核酸X 100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))。[0082]嚴(yán)謹(jǐn)度條件:如下定義不同的嚴(yán)謹(jǐn)度條件。
[0083]術(shù)語“非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用2X SSC、0.2% SDS’在45°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0084]術(shù)語“低嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5XSSPE、0.3% SDS,200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用2X SSC、0.2% SDS，在50°C下洗滌三次，每 次15分鐘。
[0085]術(shù)語“中嚴(yán)謹(jǐn)度條件”意指對于至少100個核苷酸長度的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切和變性的鮭精DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用2XSSC、0.2% SDS，在55°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0086]術(shù)語“中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用2XSSC、0.2% SDS，在60°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0087]術(shù)語“高嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA 印跡(Southern blotting)程序，在 42°C下在 5XSSPE、0.3% SDS,200 毫克 /ml 剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用2XSSC,0.2% SDS，在65°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0088]術(shù)語“非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。載體材料最終使用2X SSC、0.2% SDS’在70°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0089]子序列:術(shù)語“子序列”是指具有從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失的一個或多個(例如，若干個)核苷酸的多核苷酸；其中子序列編碼具有溶菌酶活性的片段。在一個方面中，一個子序列包含至少552個核苷酸(例如，SEQ ID NO: 3的核苷酸73至147和核苷酸302至778的連接序列)，或至少585個核苷酸(例如，SEQ ID NO: 3的核苷酸64至147和核苷酸302至802的連接序列)。在一個另外的方面中，一個子序列包含至少552個核苷酸(例如，SEQ ID NO: 7的核苷酸148至699的序列)，或至少585個核苷酸(例如，SEQ ID NO:7的核苷酸133至717的序列)。
[0090]基本上純的多核苷酸:術(shù)語“基本上純的多核苷酸”意指不含其他外來的或不需要的核苷酸的多核苷酸制劑，并且處于適合在基因工程多肽生產(chǎn)系統(tǒng)內(nèi)使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸包含按重量計至多10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1%、以及至多0.5%的其他該多核苷酸與其天然地或重組地相關(guān)的多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選地，該多核苷酸按重量計至少90%純，例如至少92%純、至少94%純、至少95 %純、至少96 %純、至少97 %純、至少98 %純、至少99 %純、以及至少99.5 %純。優(yōu)選的是本發(fā)明的多核苷酸以實質(zhì)上純的形式存在。
[0091]基本上純的多肽:術(shù)語“基本上純的多肽”意指包含按重量計至多10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1%、以及至多0.5%的其他該多肽與其天然地或重組地相關(guān)的多肽材料的多肽。優(yōu)選地，該多肽按存在于該制劑中的總的多肽材料的重量計至少92%純，例如至少94%純、至少95%純、至少96%純、至少97%純、至少98%純、至少99%、至少99.5%純、以及100%純。優(yōu)選的是本發(fā)明的多肽以基本上純的形式存在。例如，這可以通過采用眾所周知的重組方法或采用經(jīng)典的純化方法制備多肽來完成。
[0092]變體:術(shù)語“變體”意指在一個或多個(例如，若干個)位置處包括一個或多個(若干個)氨基酸殘基的改變(即，取代、插入、和/或缺失)的具有溶菌酶活性的一個多肽。取代意指占據(jù)一個位置的氨基酸被一個不同的氨基酸替代；缺失意指占據(jù)一個位置的氨基酸的移除；并且插入意指鄰近于并且緊跟著占據(jù)位置的氨基酸之后添加I個、2個或3個氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的變體可以包括從I個至5個；從I個至10個；從I個至15個；從I個至20個；從I個至25個；從I個至30個；從I個至35個；從I個至40個；從I個至45個；從即I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個或45個改變。
[0093]本發(fā)明的這些變體具有至少一個選自下組的改變/修飾，該組由以下位置編號組成:6、10、11、28、30、33、37、39、59、60、61、62、63、92、93、94、96、98、99、100、101、106、133、134、135、136、137、139、140、142、143、158、161、162、178、183 和 / 或 190，其中該位置對應(yīng)于在SEQ ID N0:8的成熟序列中的位置。該變體多肽序列優(yōu)選是一種在自然界中未發(fā)現(xiàn)的多肽。
[0094]野生型溶菌酶:術(shù)語“野生型”溶菌酶意指由天然存在的微生物(例如在自然界中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌)表達的一種溶菌酶。
[0095]用于變體命名的規(guī)則
[0096]出于本發(fā)明的目的，使用在SEQ ID N0:8中披露的成熟多肽來確定另一種溶菌酶中的相應(yīng)氨基酸殘基。將另一種溶菌酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:8中披露的成熟多肽進行比對，并且基于該比對，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，《分子生物學(xué)雜志》48:443-453)來確定與SEQ ID NO: 8中披露的成熟多肽的任何氨基酸殘基相對應(yīng)的氨基酸位置編號，該算法如EMBOSS軟件包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴斯等人，2000，《遺傳學(xué)趨勢》16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的Needle程序所實施的。使用的這些參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。標(biāo)記為“最長一致性“的Needle (尼德爾)的輸出(使用-nobrief選項獲得)被用作百分比一致性并且被計算如下:(一致的殘基X 100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))。將尼德曼-翁施算法用于序列比較并且用于計算序列一致性。
[0097]可以使用若干計算機程序通過多種多肽序列的比對來確定在另一種溶菌酶中的對應(yīng)氨基酸殘基的識別，這些計算機程序包括,但不限于:MUSCLE(multiple sequencecomparison by log - expectation (基于日志-期望值的多序列比較)；版本3.5或更新版本；Edgar (埃德加)，2004, Nucleic Acids Research (《核酸研究》)32:1792-1797),MAFFT (版本6.857或更新版本；Katoh(卡托赫)和Kuma(庫瑪),2002, NucleicAcids Research (《核酸研究》)30: 3O59-3O66 ；Katoh (卡托赫)等人，2005, NucleicAcids Research(《核酸研究》)33:5Il-5I8 ;Katoh(卡托赫)和 Toh(都)，2007，Bioinformatics (《生物信息學(xué)》)23:372-374 ;Katoh (卡托赫)等人,2009, Methods inMolecular Biology (《分子生物學(xué)方法》)537:39-64 ；Katoh (卡托赫)和Toh (都),2010，Bioinformatics (《生物信息學(xué)》)26:1899-1900)，以及利用 ClustalW 的 EMBOSSEMMA (1.83 或更新版本；Thompson (湯普森)等人，1"4, Nucleic Acids Research (《核酸研究》)22:4673-4680)，使用它們各自的缺省參數(shù)。
[0098]當(dāng)其他酶與SEQ ID N0:8的成熟多肽分歧，使得傳統(tǒng)基于序列的比較不能檢測其關(guān)系(Lindahl(林達爾)和Elofsson (埃洛弗松)，2000，J.Mol.Biol.(《分子生物學(xué)雜志》)295:613-615)時，可以使用其他成對序列比較算法。在基于序列的搜索中的更大靈敏度可以使用搜索程序來獲得，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲線)來搜索數(shù)據(jù)庫。例如，PS1-BLAST程序通過一個迭代數(shù)據(jù)庫搜索過程來產(chǎn)生多個輪廓并且能夠檢測遠距離同源物(Atschul (阿特休爾)等人，1997，《核酸研究》25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中具有一個或多個代表，則可以實現(xiàn)甚至更大的靈敏度。程序(例如 GenTHREADER) (Jones (瓊斯)，1999，《分子生物學(xué)雜志》287:797-815 ;McGuff i (麥谷芬)和瓊斯，2003，《生物信息學(xué)》19:874-881)利用來自多種來源(PS1-BLAST，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、結(jié)構(gòu)比對輪廓、以及溶劑化可能性)的信息作為預(yù)測查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。類似地，Gough (高夫)等人，2000，《分子生物學(xué)雜志》313:903-919的方法可以用于比對未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于SCOP數(shù)據(jù)庫中的超家族模型。這些比對進而可以用于產(chǎn)生多肽的同源性模型，并且使用出于該目的而開發(fā)的多種工具可以評定這類模型的準(zhǔn)確度。
[0099]對于已知結(jié)構(gòu)的蛋白，若干工具和資源可用于檢索并產(chǎn)生結(jié)構(gòu)比對。例如，蛋白的SCOP超家族已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上進行比對，并且那些比對是可訪問的并且可下載的。使用多種算法(例如距離比對矩陣(Holm(赫爾姆)和Sander (桑德爾)，1998, Proteins (《蛋白雜志》)33:88-96)或者組合擴展(Shindyalov (辛迪亞洛夫)和Bourne (伯恩)，1998,《蛋白質(zhì)工程》11: 739-747))可以比對兩個或更多個蛋白結(jié)構(gòu)，并且可以額外利用這些算法的實施來隨所感興趣的結(jié)構(gòu)查詢結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫以便發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物(例如，赫爾姆和Park(帕克),2000,《生物信息學(xué)》16:566-567)。
[0100]在描述本發(fā)明的變體中，以下所述的命名法適于引用方便。采用了已接受的IUPAC
單個字母和三字母的氨基酸縮寫。
[0101]取代:對于氨基酸取代，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226處的蘇氨酸被丙氨酸取代被表示為“Thr226Ala”或者“T226A”。多個突變由加號(“ + ”)分開，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或者“G205R+S411F”代表分別在位置205和位置411上甘氨酸(G)被精氨酸(R)并且絲氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。 [0102]缺失:對于氨基酸缺失，使用了以下命名法。原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195上的甘氨酸缺失被表示為“Glyl95*”或者“G195*”。多個缺失由加號(“ + ”)分開，例如 “Glyl95*+Ser411*，，或 “G195*+S411*，，。[0103]插入:對于氨基酸插入，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195上的甘氨酸之后插入賴氨酸被表示為“Glyl95GlyLys”或者“G195GK”。多個氨基酸的插入被表示為[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2 ;等]。例如，在位置195上的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸被表示為“Glyl95GlyLysAla” 或者 “G195GKA”。
[0104]在這類情況下，通過將小寫字母添加到在所插入的一個或多個氨基酸殘基之前的氨基酸殘基的位置編號中來對所插入的一個或多個氨基酸殘基進行編號。在以上實例中，該序列因此將是:
[0105]
【權(quán)利要求】
1.一種具有溶菌酶活性的分離的多肽，該多肽選自下組，該組由以下各項組成: (a)與SEQID NO: 4的成熟多肽或SEQ ID NO: 8的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的一種多肽； (b)由以下一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸與SEQID NO: 3的成熟多肽編碼序列或SEQ ID NO:7的成熟多肽編碼序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性； (c)由以下一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與SEQID NO:3或SEQ ID NO:7的成熟多肽編碼序列、或其全長互補體雜交； (d)SEQID N0:4或SEQ ID NO:8的成熟多肽的一種變體，該變體在一個或多個(例如，若干個)位置處包括取代、缺失和/或插入；以及 (e)具有溶菌酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一個片段。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，選自包括SEQID N0:4或SEQ ID NO:8或者SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的成熟多肽或由其組成的多肽。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其中該成熟多肽選自SEQID NO: 4的氨基酸20至227或SEQ ID NO:8的氨基酸I至208。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多肽，該多肽是SEQID N0:4或SEQ ID NO:8的成熟多肽的一種變體，該變體在一個或多個(若干個)位置處包括取代、缺失、和/或插入。
5.一種組合物，該組合物包括如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物是一種洗滌劑組合物。
7.如權(quán)利要求6所述的用于衣物、餐具或清潔硬表面的洗滌劑組合物。
8.如權(quán)利要求6至7中任一項所述的洗滌劑組合物，其中該組合物包括一種或多種另外的選自下組的酶，該組包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果膠酶、果膠裂解酶、黃原膠酶、過氧化物酶、鹵代過氧酶、過氧化氫酶和甘露聚糖酶、或其任何混合物。
9.如權(quán)利要求6至8中任一項所述的洗滌劑組合物，包括一種或多種選自下組的組分，該組包括表面活性劑、助洗劑、助水溶劑、漂白系統(tǒng)、聚合物、織物調(diào)色劑、輔料、分散劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、熒光增白劑、污物釋放聚合物以及抗再沉積劑。
10.一種動物飼料組合物，該組合物包括如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的動物飼料組合物，該組合物進一步包括以下各項中的一種或多種:淀粉酶；植酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α -半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶，β -葡聚糖酶，或其任何混合物。
12.—種動物飼料添加劑，包括 至少一種如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽；以及 至少一種脂溶性維生素，和/或 至少一種水溶性維生素，和/或 至少一種痕量礦物質(zhì)。
13.如權(quán)利要求12所述的動物飼料添加劑，進一步包括以下各項中的一種或多種:淀粉酶；植酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶，β-葡聚糖酶,或其任何混合物。
14.如權(quán)利要求5所述的組合物，是一種細(xì)菌基因組DNA提取組合物。
15.如權(quán)利要求14所述的細(xì)菌基因組DNA提取組合物，其中該組合物另外包括一種或多種另外的溶菌酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽作為一種生物膜形成的抑制劑的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽在一種牙科組合物中的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽在一種洗滌劑組合物中的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽在動物飼料中的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽用于分解細(xì)菌的細(xì)胞壁的用途。
21.如權(quán)利要求20所述的多肽，其中該多肽在用于從細(xì)菌分離DNA的工藝中使用。
22.—種從細(xì)菌分離DNA的方法，包括: (a)用如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽處理該分離的細(xì)菌；并且 (b)回收該細(xì)菌DNA。
23.—種分離的多核苷酸,該多核苷酸編碼如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽。
24.一種核酸構(gòu)建體或表達載體，包括可操作地連接至一個或多個控制序列的如權(quán)利要求23所述的多核苷酸，該一個或多個控制序列指導(dǎo)該多肽在一種表達宿主中的產(chǎn)生。
25.一種重組宿主細(xì)胞，包括可操作地連接至一個或多個控制序列的如權(quán)利要求23所述的多核苷酸，該一個或多個控制序列指導(dǎo)該多肽的產(chǎn)生。
26.—種產(chǎn)生如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽的方法,該方法包括: (a)培養(yǎng)一種細(xì)胞，該細(xì)胞以其野生型形式在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下產(chǎn)生該多肽；并且 (b)回收該多肽。
27.—種產(chǎn)生具有溶菌酶活性的多肽的方法，該方法包括: (a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求25所述的宿主細(xì)胞；并且 (b)回收該多肽。
28.一種用編碼如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞。
29.—種產(chǎn)生具有溶菌酶活性的多肽的方法，該方法包括: (a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求28所述的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；并且 (b)回收該多肽。
【文檔編號】C12N9/36GK103957929SQ201280058088
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月25日
【發(fā)明者】K·M·施諾爾, J·E·尼爾森, M·克勞森 申請人:諾維信公司