氧化還原敏感的鈣傳感蛋白及其用途方法
【專利摘要】本文提供了組合物，其涉及在氧化條件下顯示出顯著減少的熒光的，并且在暴露于細(xì)胞間鈣離子時，產(chǎn)生具有提高的信噪比的熒光信號的基因編碼的鈣指示劑蛋白的生產(chǎn)和用途，及其使用方法。
【專利說明】氧化還原敏感的鈣傳感蛋白及其用途方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本公開涉及組合物，其涉及在氧化條件下能夠顯示出顯著減少的熒光的，并且在暴露于胞內(nèi)鈣離子時，產(chǎn)生具有提高的信噪比的熒光信號的基因編碼的鈣指示劑蛋白，及其使用和生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鈣(Ca2+)在細(xì)胞的生理學(xué)和生物化學(xué)中發(fā)揮重要作用。鈣離子在幾種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為第二信使，參與神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以便于神經(jīng)傳導(dǎo)，介導(dǎo)所有肌細(xì)胞類型的收縮，并在生殖功能中發(fā)揮重要作用，使精子獲能和精子活力以及卵子的機制能夠預(yù)防多精入卵。此外，許多酶需要鈣離子作為輔因子以正確行使功能。因此，對伴隨著這些不同細(xì)胞和生理現(xiàn)象的胞內(nèi)鈣濃度的動態(tài)變化進行監(jiān)測的方法在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)上具有廣泛的用途。
[0003]已經(jīng)開發(fā)了兩類Ca2+指示劑:小分子熒光染料和基因編碼的鈣指示劑(GECI)。小分子熒光染料，例如fura-2和fluo-3，在與鈣結(jié)合時改變它們的熒光特性。它們的寬動態(tài)范圍、高靈敏度和快速動力學(xué)使得它們成為非常受歡迎的工具。但是，染料不能靶向特定的細(xì)胞，并且染料加樣可能引起細(xì)胞毒性。另一方面，GECIs提供了染料的替代選擇，其能夠通過簡單地將信號肽與GECI蛋白融合，從而容易地針對任何亞細(xì)胞區(qū)室。此外，GECIs可以靶向生物活體的特定的細(xì)胞類型或組織，并且它們在靶細(xì)胞中的表達水平穩(wěn)定持續(xù)數(shù)天至數(shù)月，從而可以進行長時間的延時拍攝實驗。
[0004]單熒光蛋白GECIs含有一個環(huán)形重新排列的熒光蛋白，其熒光受到發(fā)色團環(huán)境中鈣結(jié)合依賴性變化的調(diào)節(jié)。一種類型的單熒光蛋白GECI是GCamP，其由環(huán)形重新排列的增強GFP(cpEGFP)部分，鈣結(jié)合蛋白鈣調(diào)蛋白(CaM)，和被稱為M13的Ca2+-CaM-結(jié)合肽組成(Nakai et al., Nature Biotech.，2001，19:137-41;Akerboom et al., 2009, J.Biol.Chem.，284:6455-64)。天然EGFP的發(fā)色團位于11-鏈的β -桶狀結(jié)構(gòu)桶狀結(jié)構(gòu)的中心，其保護發(fā)色團不接觸大量溶劑。在GCamP傳感蛋白的cpEGFP結(jié)構(gòu)域中，EGFP原有的N-和C-末端通過連接肽連接在一起，并且通過在桶的一側(cè)打開一個β -折疊產(chǎn)生新的N-和C-末端，導(dǎo)致發(fā)色團暴露于溶劑。Μ13和CaM結(jié)構(gòu)域分別與cpEGFP新的N-和C-末端融合。在Ca2+-結(jié)合時，cpEGFP結(jié)構(gòu)域上的人工開口被Ca2+_CaM/M13復(fù)合體部分堵塞，以保護發(fā)色團不接觸溶劑，并且使得該發(fā)色團在熒光的、去質(zhì)子化的形式中是穩(wěn)定的。相反，apo-CaM結(jié)構(gòu)域在缺乏鈣的條件下將不與M13結(jié)合，導(dǎo)致由于接觸溶劑而介導(dǎo)的cpEGFP發(fā)色團變暗。
[0005]雖然GECIs例如GCamP的開發(fā)和使用為研究者提供了有價值的工具，以檢測胞內(nèi)鈣離子濃度的波動，但是現(xiàn)有的GECIs具有嚴(yán)重的缺陷，限制了其實際應(yīng)用，例如低信噪t匕、溫度靈敏度、次優(yōu)的動 力學(xué)、非線性和低光穩(wěn)定性。特別是，低信噪比是GCamP和其他GECIs的主要缺點。死亡細(xì)胞或受損細(xì)胞干擾鈣特異性熒光信號的測量。作為壞死或程序性細(xì)胞死亡的結(jié)果，這些細(xì)胞經(jīng)常表現(xiàn)出增加的胞內(nèi)鈣水平，因此它們的熒光能夠增加背景熒光檢測并降低使用GECIs進行的基于鈣的檢測的整體靈敏度。[0006]因此，所需要的是在胞內(nèi)鈣水平的測量過程中顯示出提高的信噪比的GECI蛋白，特別是當(dāng)檢測中包括死亡的、垂死的、或受損的細(xì)胞時。
[0007]本說明書通篇引用了各種專利、專利申請和其他類型的出版物(例如期刊文章)。為所有目的，本文所引用的所有專利、專利申請和出版物的公開通過引用被整體并入本文。
[0008]發(fā)明簡沭
[0009]本文提供的本發(fā)明公開了，尤其是GCamP鈣傳感蛋白鈣傳感蛋白，在死亡的、垂死的或受損的細(xì)胞中通常所觀察到的氧化條件下，其顯示出減少的熒光，并且與未改造的GCamP鈣傳感蛋白相比具有總體上更高的信噪比。本發(fā)明另外提供了在檢測中使用GCamP鈣傳感蛋白的方法，所述檢測的目的是為了篩選能夠調(diào)節(jié)(例如增加或減少)胞內(nèi)鈣濃度的化合物。
[0010]相應(yīng)地，本文提供了分離的核酸，其包括編碼鈣傳感蛋白的核苷酸序列，所述鈣傳感蛋白從N末端到C末端包括Ml3結(jié)構(gòu)域、環(huán)形排列的綠色滅光蛋白結(jié)構(gòu)域和鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)構(gòu)域，其中在鈣傳感蛋白中位于N77和Y95、L134和T201、T331和T365，和/或T332和E348的至少一對氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代，其中氨基酸殘基的位置對應(yīng)于SEQ ID N0:1的位置，并且其中與還原條件下顯示出的熒光水平相比，鈣傳感蛋白在氧化條件下顯示出減少的熒光。在另一個方面，本文提供了包括本文所述的任何核酸的載體。在還另一個方面提供了包含本文所述的任何核酸或載體的分離的細(xì)胞。在一個方面，本文提供了包括本文所述的任何細(xì)胞的非人動物。在另一個方面，本文提供了包括本文所述的任何細(xì)胞的組織切片。
[0011]在另一個方面，本文提供了分離的鈣傳感蛋白，其包括的氨基酸序列從N末端到C末端包含M13結(jié)構(gòu)域、環(huán)形排列的綠色熒光蛋白結(jié)構(gòu)域和鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)構(gòu)域，其中位于N77和Y95、L134和T201、T331和T365和/或T332和E348的至少一對氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代，其中氨基酸殘基的位置對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置，并且其中與還原條件下顯示出的熒光水平相比，鈣傳感蛋白在氧化條件下顯示出減少的熒光。
[0012]在還另一個方面，本文提供了用于篩選能夠增加或減少細(xì)胞中胞內(nèi)鈣濃度的試劑的方法，所述方法包括:(i)使所述試劑與表達由本文所述的任何核酸編碼的鈣傳感蛋白的細(xì)胞接觸；以及(ii)確定熒光水平，其中熒光的增加表示所述試劑能夠增加胞內(nèi)鈣濃度，熒光的減少表示所述試劑能夠減少胞內(nèi)鈣濃度。
[0013]在另一個方面，本文提供了試劑盒，其包括以下各成分的一種或更多種:(i)本文所述的一種或更多種核酸，例如載體；(ii)本文所述的一種或更多種鈣傳感蛋白本文所述的一種或更多種細(xì)胞；(iv)本文所述的一種或更多種非人動物；(V)和/或本文所述的一種或更多種組織切片。
[0014]應(yīng)當(dāng)理解本文所述的各個實施方案的一個、一些或全部特征可以組合以形成本發(fā)明的其他實施方案。本發(fā)明的這些和其他方面對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將會變得顯而易見。
[0015]附圖簡沭
[0016]圖1描述GCaMP2的一級氨基酸序列的示意圖，其說明結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。示意圖下方的插入符號示出結(jié)構(gòu)域間連接肽的位置。
[0017]圖2描述redoxGCamP鈣傳感蛋白的體外篩選。加入⑷10 μ M離子霉素或(B) 100 μ M乙酰膽堿并記錄轉(zhuǎn)染的ΗΕΚ293細(xì)胞的熒光變化。Fmax代表最大熒光信號疋0代表背景熒光信號。(C)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞在MOPS緩沖液中的粗裂解物分別在存在100 μ M DTT或100 μ M H2O2的條件下的熒光強度。(D)轉(zhuǎn)染的ΗΕΚ293細(xì)胞在存在或不存在100 μ MH2O2的條件下用細(xì)胞死亡檢測緩沖液處理30分鐘后的熒光變化。 [0018] 圖3描述轉(zhuǎn)染的ΗΕΚ293細(xì)胞的粗裂解物分別在存在2mM CaCl2或IOmM EGTA的條件下的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜(A-F:未轉(zhuǎn)染、GCamP、N77C/Y95C、L134C/T E201C、T331C/T365C和 T332C/E348C)。激發(fā)光譜(300_500nm)在 520nm 檢測，發(fā)射光譜(500_600nm)在 470nm激發(fā)。
[0019]圖4描述用于表征redoxGCamP 鈣傳感蛋白的體外鈣滴定實驗的結(jié)果。
[0020]圖5描述在可變鈣、還原條件和氧化條件下測量分離的GCamP蛋白的熒光光譜的實驗結(jié)果。(A)代表在525nm檢測的激發(fā)光譜，而(B)代表在470nm激發(fā)的發(fā)射光譜。
[0021]圖6描述在可變鈣、還原條件和氧化條件下測量分離的N77C/Y95C redoxGCamP鈣傳感蛋白的熒光光譜的實驗結(jié)果。(A)代表在525nm檢測的激發(fā)光譜，而(B)代表在470nm激發(fā)的發(fā)射光譜。
[0022]圖7描述在可變鈣、還原條件和氧化條件下測量分離的L134C/T201C redoxGCamP鈣傳感蛋白的熒光光譜的實驗結(jié)果。(A)代表在525nm檢測的激發(fā)光譜，而(B)代表在470nm激發(fā)的發(fā)射光譜。
[0023]圖8描述在可變鈣、還原條件和氧化條件下測量分離的T331C/T365C redoxGCamP鈣傳感蛋白的熒光光譜的實驗結(jié)果。(A)代表在525nm檢測的激發(fā)光譜，而(B)代表在470nm激發(fā)的發(fā)射光譜。
[0024]圖9描述在可變鈣、還原條件和氧化條件下測量分離的T332C/E348C redoxGCamP鈣傳感蛋白的熒光光譜的實驗結(jié)果。(A)代表在525nm檢測的激發(fā)光譜，而(B)代表在470nm激發(fā)的發(fā)射光譜。
[0025]圖10描述觀察到的用GCamP或redoxGcamP 鈣傳感蛋白和5HT2a受體共轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的熒光強度。
[0026]詳細(xì)描沭
[0027]本發(fā)明提供了，尤其是在氧化條件下能夠顯示出顯著減少的熒光的基因編碼的鈣指示劑(GECI)，及其使用和生產(chǎn)方法。發(fā)明人已構(gòu)建了一系列GCamP鈣傳感蛋白，與對氧化條件不敏感的GCamP鈣傳感蛋白相比，其具有總體上提高的信噪比。發(fā)明人鑒別了用半胱氨酸殘基對取代GCamP嵌合蛋白的一級氨基酸序列的幾個位點。不受理論的限制，相信那些半胱氨酸殘基上的硫醇基在氧化條件下易于形成二硫鍵，那些二硫鍵的形成導(dǎo)致GCamP的三級和/或四級結(jié)構(gòu)發(fā)生重要的構(gòu)象變化，從而降低了蛋白發(fā)出熒光的能力。但是，在活細(xì)胞中通常觀察到的還原條件下，相信替換的半胱氨酸的硫醇基保持質(zhì)子化狀態(tài)，因此防止對暴露于胞內(nèi)鈣時的突光發(fā)射或激發(fā)可能有負(fù)面影響的GCamP的任何結(jié)構(gòu)破壞。
[0028]這些獨特的鈣傳感蛋白可以在體外或在生物活體內(nèi)靶向特定的細(xì)胞或組織，以測量胞內(nèi)鈣水平。而且，在使用胞內(nèi)鈣作為第二信使的細(xì)胞類型中表達的鈣傳感蛋白可被用于篩選能夠通過與例如質(zhì)膜結(jié)合蛋白受體(例如但不限于G蛋白偶聯(lián)受體)的相互作用選擇性改變胞內(nèi)鈣水平的化合物。
[0029]1.通用技術(shù)
[0030]本發(fā)明的實施將采取，除非另外指出，分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻中有詳細(xì)說明，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室手冊)，，，second edition (Sambrook et al., 1989) ; “Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)”(M.J.Gait，ed.，1984) ; “Animal Cell Culture (動物細(xì)胞培養(yǎng))”(R.1.Freshney, ed.，1987) ; “Methods in Enzymology (酶學(xué)方法)”(AcademicPress, Inc.) ; “Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗指南)，，(F.M.Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates) ; iiPCR: The PolymeraseChain Reaction (PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))”，(Mullis et al., eds., 1994).Singleton etal., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典)2nd ed., J.ffiley&Sons(New York, N.Y.1994), March, “Advanced Organic ChemistryReactions, Mechanisms and Structure (高等有機化學(xué)反應(yīng)、機理和結(jié)構(gòu))” 4th ed., Johnffiley&Sons (New York, N.Y.1992)和 “Neuronal Calcium Sensor Proteins (神經(jīng)兀鈣傳感蛋白)，”NOVA Publishers, (Philippov&Koch, eds., 2006)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了關(guān)于本申請中所使用的許多術(shù)語的一般指導(dǎo)。
[0031]II.定義
[0032]如本文所使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括多肽、肽、蛋白片段和融合蛋白。
[0033]如本文所使用的，“分離的”分子或細(xì)胞(例如分離的蛋白、分離的核酸或分離的細(xì)胞)是已被鑒別并從其天然環(huán)境的成分中分離和/或回收的。
[0034]術(shù)語“異源蛋白”指來源于與宿主細(xì)胞不同的生物體、物種或菌株的蛋白。在一些實施方案中，異源蛋白與在相同的天然宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的野生型蛋白不同。
[0035]如本文所使用的，“核酸”指在單鏈或雙鏈形式中共價結(jié)合在一起的兩個或更多個脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
[0036]術(shù)語“重組核酸”指感興趣的核酸，其不含有在作為所述感興趣的核酸的來源的生物體中天然存在的基因組中位于所述感興趣的核酸側(cè)翼的一個或多個核酸(例如基因)。該術(shù)語因此包括，例如，整合到載體中、自主復(fù)制質(zhì)粒或病毒中、或原核或真核生物的基因組DNA中的，或者以獨立于其他序列的單獨的分子(例如cDNA、基因組DNA片段或通過PCR或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA片段)形式存在的重組DNA。
[0037]“異源核酸”指來源于與宿主細(xì)胞不同的生物體、物種或菌株的核酸。在一些實施方案中，異源核酸與在相同的天然宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的野生型核酸不同。例如，編碼在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化的或整合到宿主細(xì)胞染色體中的鈣傳感蛋白的核酸是異源核酸。
[0038]如本文所使用的，“表達控制序列”指指導(dǎo)感興趣的核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達控制序列可以是啟動子，例如組成型或誘導(dǎo)型啟動子，或增強子。表達控制序列可以是“天然的”或異源的。天然的表達控制序列來源于與被表達的基因相同的生物體、物種或菌株。異源表達控制序列來源于與被表達的基因不同的生物體、物種或菌株?！罢T導(dǎo)型啟動子”是受到環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)時被激活的啟動子。
[0039]“可操作地連接”是核酸表達控制序列(例如啟動子)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中表達控制序列指導(dǎo)對應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。
[0040]“突變”包括確定的一級氨基酸序列中至少一個氨基酸的氨基酸缺失、氨基酸插入和氨基酸取代。在一些方面，一級氨基酸序列中一個或更多個氨基酸的突變可以導(dǎo)致由該氨基酸序列編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中具有改變的活性或表達水平。在其他方面，一級氨基酸序列中一個或更多個氨基酸的突變(例如保守突變)可能不會導(dǎo)致由該氨基酸序列編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的活性或表達水平有實質(zhì)變化。
[0041]氨基酸的“取代”指確定的一級氨基酸序列中的至少一個氨基酸成分被另一個氨基酸(例如半胱氨酸)替換。在一些方面，一級氨基酸序列中一個或更多個氨基酸的取代可以導(dǎo)致由該氨基酸序列編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中具有改變的活性或表達水平。在其他方面，一級氨基酸序列中一個或更多個氨基酸的取代(例如保守取代)可能不會導(dǎo)致由該氨基酸序列編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的活性或表達水平有實質(zhì)變化。
[0042]如本文所使用的，蛋白質(zhì)或氨基酸序列的“氨基酸序列同一性百分比(%) ”指候選序列中與特定蛋白質(zhì)或氨基酸序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，在對序列進行比對并且如果需要的話，導(dǎo)入缺口，以達到最大百分比的序列同一性之后獲得，同時不將保守取代視為序列同一性的一部分。為確定氨基酸序列同一性百分比的目的進行的比對可以以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式實現(xiàn)，例如，使用公眾可獲得的計算機軟件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN?(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定用于測量比對的合適的參數(shù)，包括為了達到所比較序列全長上的最大比對所需要的任何算法。[0043]如本文所使用的，DNA或RNA序列的“核苷酸序列同一性百分比(%) ”指候選序列中與特定DNA或RNA序列中核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比，在對序列進行比對并且如果需要的話，導(dǎo)入缺口，以達到最大百分比的序列同一性之后獲得，同時不將保守取代視為序列同一性的一部分。為確定核苷酸序列同一性百分比的目的進行的比對可以以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式實現(xiàn)，例如，使用公眾可獲得的計算機軟件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定用于測量比對的合適的參數(shù)，包括為了達到所比較序列全長上的最大比對所需要的任何算法。
[0044]“嵌合蛋白”是包括來源于一種或更多種不同蛋白質(zhì)的一個或更多個部分的蛋白質(zhì)，例如GCamP嵌合蛋白。嵌合蛋白可以通過培養(yǎng)用編碼該嵌合蛋白的核酸轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞產(chǎn)生。
[0045]“G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR) ”指通過與G蛋白偶聯(lián)從而介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體超家族的任何成員。一類影響胞漿鈣水平的GPCR的一個實例是通過Gq類型的G蛋白發(fā)揮作用，其激活磷脂酶C(PLC)通路，導(dǎo)致磷酸肌醇水解產(chǎn)生兩類不同的第二信使，即二酰甘油和肌醇磷脂。二酰甘油依次激活特定的蛋白激酶Cs (PKCs)，而肌醇磷脂(例如但不限于IP3)刺激鈣從胞內(nèi)庫例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌質(zhì)網(wǎng)(肌細(xì)胞的)和/或線粒體移動。
[0046]除非本文另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的具有相同的意義。
[0047]如本文所使用的，單數(shù)術(shù)語“一(a，an)”和“這(the) ”包括復(fù)數(shù)引用，除非上下文另外明確指出。
[0048]本說明書通篇給出的每一最大數(shù)值限度包括每一較低的數(shù)值限度，如同該較低的數(shù)值限度在本文中明確記載一樣。本說明書通篇給出的每一最小數(shù)值限度包括每一較高的數(shù)值限度，如同該較高的數(shù)值限度在本文中明確記載一樣。本說明書通篇給出的每一數(shù)值范圍包括落入該較寬數(shù)值范圍內(nèi)的每一較窄數(shù)值范圍，如同該較窄數(shù)值范圍在本文中全部明確記載一樣。[0049]II1.本發(fā)明的組成
[0050]A.蛋白質(zhì)
[0051]在一些方面，本文提供了分離的鈣傳感蛋白，其包括M13結(jié)構(gòu)域、環(huán)形排列的綠色熒光蛋白(cpGFP)結(jié)構(gòu)域和鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)構(gòu)域，其中至少一對半胱氨酸殘基被加入到鈣傳感蛋白的一級氨基酸序列中，并且其中與還原條件下顯示出的熒光水平相比，所述鈣傳感蛋白在氧化條件下顯示出減少的熒光。在該上下文中，術(shù)語“環(huán)形排列”(“cp”)指天然GFP的N-和C-末端連接起來(例如通過氨基酸連接肽序列連接起來)，并通過GFP氨基酸序列中的兩個肽鍵的斷裂產(chǎn)生新的N-和C-末端。正如圖1所示出的示意圖中所能觀察到的，鈣傳感蛋白的CpGFP結(jié)構(gòu)域包括第一 cpGFP結(jié)構(gòu)域(天然GFP以前的C-末端)和第二 cpGFP結(jié)構(gòu)域(天然GFP以前的N-末端)。
[0052]相應(yīng)地，在一個方面，cpGFP結(jié)構(gòu)域包括第一 cpGFP結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO: 11中示出的氨基酸序列的氨基酸殘基149-238，和第二 cpGFP結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO: 11中示出的氨基酸序列的氨基酸殘基1-144。在一個實施方案中，cpGFP結(jié)構(gòu)域包括第一 cpGFP結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO: 12中示出的氨基酸序列的氨基酸殘基148-237，和第二 cpGFP結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO: 12中示出的氨基酸序列的氨基酸殘基1-143。參見Tsien，Annu.Rev.Biochem.(生物化學(xué)綜述年刊)，1998,67:509-44的第513頁中示出的氨基酸序列，其公開通過引用被整體并入本文。在一個實施方案中，cpGFP結(jié)構(gòu)域包括第一 cpGFP結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO: 13中示出的氨基酸序列的氨基酸殘基148-237，和第二 cpGFP結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO: 13中不出的氨基酸序列的氨基酸殘基1-143 (Tsien, Annu.Rev.Biochem.(生物化學(xué)綜述年刊)，1998，67:509-44的第513頁)。
[0053]在另一個實施方案中，鈣傳感蛋白結(jié)構(gòu)域的排列使得M13結(jié)構(gòu)域位于CaM結(jié)構(gòu)域和cpGFP結(jié)構(gòu)域的C-末端。在一些實施方案中，鈣傳感蛋白結(jié)構(gòu)域可以排列成M13結(jié)構(gòu)域位于cpGFP結(jié)構(gòu)域和CaM結(jié)構(gòu)域的N-末端。在其他實施方案中，鈣傳感蛋白的GFP環(huán)形排列在SEQ ID NO: 11，12或13示出的氨基酸序列的氨基酸殘基135-155之間的任何位置。在特定的實施方案中，GFP環(huán)形排列在SEQ ID NO: 11顯示的氨基酸序列的氨基酸殘基位置144 處。
[0054]在一些實施方案中，分離的鈣傳感蛋白還包括可選的標(biāo)簽(例如純化標(biāo)簽)。用于分離和純化所表達的蛋白質(zhì)的蛋白純化標(biāo)簽有許多，且是本領(lǐng)域中常用的。非限制性實施例包括組氨酸標(biāo)簽(His tag)、麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽或谷胱甘肽標(biāo)簽。在一個實施方案中，蛋白純化標(biāo)簽是包括至少六個組氨酸殘基的組氨酸標(biāo)簽。在另一個實施方案中，蛋白標(biāo)簽含有蛋白酶識別位點，以使蛋白純化標(biāo)簽?zāi)軌驈拟}傳感蛋白的其余部分上被除去。
[0055]在一些實施方案中，連接肽可以在環(huán)形排列的位點處被插入到cpGFP的一級氨基酸序列中。在一些實施方案中，環(huán)形排列的位點處的連接肽的長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸的任一種。在一個實施方案中，環(huán)形排列的位點處的連接肽的長度為6個氨基酸。在還另一個實施方案中，環(huán)形排列的位點處的連接肽包括氨基酸序列:G G T G GS(SEQ ID NO: 14)。在另一個實施方案中，連接肽可以被插入到可選的蛋白純化標(biāo)簽和M13結(jié)構(gòu)域之間。在一些實施方案中，可選的蛋白純化標(biāo)簽和M13結(jié)構(gòu)域之間的連接肽的長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸的任一種。在一個實施方案中，可選的蛋白純化標(biāo)簽和M13結(jié)構(gòu)域之間的連接肽的長度為3個氨基酸。在還另一個實施方案中，可選的蛋白純化標(biāo)簽和M13結(jié)構(gòu)域之間的連接肽包含氨基酸序列:M V D0在還另一個實施方案中，連接肽可以被插入到M13結(jié)構(gòu)域和第一 cpGFP結(jié)構(gòu)域之間。在一些實施方案中，M13結(jié)構(gòu)域和第一 cpGFP結(jié)構(gòu)域之間的連接肽的長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸的任一種。在其他實施方案中，M13結(jié)構(gòu)域和第一 cpGFP結(jié)構(gòu)域之間的連接肽的長度為2個氨基酸。在還另一個實施方案中，M13結(jié)構(gòu)域和第一 cpGFP結(jié)構(gòu)域之間的連接肽包括氨基酸序列:L E0在另一個實施方案中，連接肽可以被插入到第二 cpGFP結(jié)構(gòu)域和CaM結(jié)構(gòu)域之間。在一些實施方案中，第二 cpGFP結(jié)構(gòu)域和CaM結(jié)構(gòu)域之間的連接肽的長度為約1、2、3、4、5、
6、7、8、9或10個氨基酸的任一種。在其他實施方案中，第二 cpGFP結(jié)構(gòu)域和CaM結(jié)構(gòu)域之間的連接肽包括氨基酸序列:TR。
[0056]在一些方面，向鈣傳感蛋白的一級氨基酸序列加入至少一對半胱氨酸殘基可以采用以下形式:將半胱氨酸殘基對插入到一級氨基酸序列中或者用半胱氨酸殘基取代一級氨基酸序列中的殘基對。在一些實施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10對半胱氨酸殘基的任一種被插入到鈣傳感蛋白的一級氨基酸序列中或者替換其中至少兩個氨基酸。在另一個實施方案中，所述一個或更多個插入的或替換的半胱氨酸殘基對位于鈣傳感蛋白的cpGFP結(jié)構(gòu)域中。在再另一個實施方案中，所述一個或更多個插入的或替換的半胱氨酸殘基對位于鈣傳感蛋白的CaM結(jié)構(gòu)域中。在另一個實施方案中，所述一個或更多個插入的或替換的半胱氨酸殘基對位于鈣傳感蛋白的M13結(jié)構(gòu)域中。在其他實施方案中，所述至少一個或更多個插入的或替換的半胱氨酸殘基對的一個成員位于cpGFP結(jié)構(gòu)域中，而另一個成員位于CaM結(jié)構(gòu)域中。在另一個實施方案中，所述至少一個或更多個插入的或替換的半胱氨酸殘基對的一個成員位于cpGFP結(jié)構(gòu)域中，而另一個成員位于M13結(jié)構(gòu)域中。在還另一個實施方案中，所述至少一個或更多個插入的或替換的半胱氨酸殘基對的一個成員位于CaM結(jié)構(gòu)域中，而另一個成員位于M13結(jié)構(gòu)域中。
[0057]在一些方面，鈣傳感蛋白的一級氨基酸序列中的至少兩個殘基被至少兩個半胱氨酸殘基取代。在一個實施方案中，選自由N77/Y95、L134/T201、T365/T332和T332/E348組成的組的鈣傳感蛋白的一級氨基酸序列的一個或更多個氨基酸殘基對的任意組合被半胱氨酸殘基取代，其中氨基酸殘基位置對應(yīng)于SEQ ID NO:1中的位置。
[0058]在一些方面，鈣傳感蛋白包括氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID N0:l、2、3、4或5 中出示的氨基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。在另一個方面，鈣傳感蛋白包括氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的氨基酸殘基36-451具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性。在一個實施方案中，鈣傳感蛋白包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列。在另一個實施方案中，鈣傳感蛋白包括SEQ ID NO:2的氨基酸殘基36-451。在另一個實施方案中，鈣傳感蛋白包括SEQID N0:3的氨基酸序列。在另一個實施方案中，鈣傳感蛋白包括SEQ ID N0:3的氨基酸殘基36-451。在還另一個實施方案中，鈣傳感蛋白包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在另一個實施方案中，鈣傳感蛋白包括SEQ ID NO:4的氨基酸殘基36-451。在再另一個實施方案中，鈣傳感蛋白包括SEQ ID N0:5的氨基酸序列。在另一個實施方案中，鈣傳感蛋白包括SEQID NO: 5的氨基酸殘基36-451。在另一個實施方案中，鈣傳感蛋白包括氨基酸序列，該氨基酸序列與 Souslova et al., BMC Biotechnology (BMC 生物技術(shù))，2007，7:37 中公開的任何鈣傳感蛋白具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性,該文獻的內(nèi)容通過引用被整體并入本文。
[0059]在一些實施方案中，鈣傳感蛋白包括N77/Y95、L134/T201、T365/T332和/或T332/E348的約5個氨基酸殘基內(nèi)的一個或更多個半胱氨酸殘基對的插入，其中氨基酸殘基的位置對應(yīng)于SEQ ID NO:1中的位置。
[0060]蛋白質(zhì)的修飾，包括特定的氨基酸取代或插入，通過本領(lǐng)域熟知的方法進行。例如，可以通過編碼鈣傳感蛋白的多核苷酸中核苷酸的位點特異性突變進行修飾，從而產(chǎn)生編碼該修飾的DNA，并隨后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達該DNA。在具有已知序列的DNA中的預(yù)定位點進行取代的技術(shù)也是本領(lǐng)域熟知的，例如引物突變和PCR突變。
[0061]本文所述的鈣傳感蛋白可以包括保守取代。保守取代如以下的“氨基酸取代表”所示，其標(biāo)題詞為“優(yōu)選取代”。
[0062]氨基酸取代
[0063]
【權(quán)利要求】
1.分離的核酸，所述分離的核酸包括編碼鈣傳感蛋白的核苷酸序列，所述鈣傳感蛋白從N末端至C末端包括M13結(jié)構(gòu)域、環(huán)形排列的綠色熒光蛋白結(jié)構(gòu)域和鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)構(gòu)域， 其中所述鈣傳感蛋白中位于N77和Y95、L134和T201、T331和T365和/或T332和E348的至少一對氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代，其中所述氨基酸殘基的位置對應(yīng)于SEQID NO:1中的位置，并且 其中與在還原條件下顯示出的熒光水平相比，所述鈣傳感蛋白在氧化條件下顯示出減少的熒光。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述鈣傳感蛋白包括與SEQID NO:1具有至少90%或至少95%同一性的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述鈣傳感蛋白包括SEQID NO:2, SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
4.包括權(quán)利要求1-3任一項所述的核酸的載體。
5.如權(quán)利要求4所述的載體，其中所述載體是表達載體。
6.如權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的載體，其中所述載體來源于細(xì)菌、病毒、粘粒、酵母或植物。
7.如權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的載體，其中所述表達載體是病毒載體。
8.如權(quán)利要求7所述的載體，其中所述病毒載體選自由以下載體組成的組:AAV載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、HSV載體和慢病毒載體。
9.如權(quán)利要求4-8任一項所述的載體，其中所述載體是低拷貝載體或高拷貝載體。
10.包括權(quán)利要求1-3任一項所述的核酸的分離的細(xì)胞。
11.包括權(quán)利要求4-8任一項所述的載體的分離的細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自由動物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、線蟲細(xì)胞和酵母細(xì)胞組成的組。
13.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞,其中所述動物細(xì)胞是人細(xì)胞或非人細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其中所述人細(xì)胞是在細(xì)胞培養(yǎng)物中。
15.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞，其中所述非人細(xì)胞選自由嚙齒動物細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞和非人靈長動物細(xì)胞組成的組。
16.如權(quán)利要求15所述的細(xì)胞，其中所述非人細(xì)胞是在細(xì)胞培養(yǎng)物或在非人動物中。
17.如權(quán)利要求13-16任一項所述的細(xì)胞，其中所述動物細(xì)胞是肌肉細(xì)胞、生殖細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、癌細(xì)胞或內(nèi)分泌細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求17所述的細(xì)胞，其中所述肌肉細(xì)胞選自由平滑肌、骨骼肌和心肌組成的組。
19.如權(quán)利要求10-18任一項所述的細(xì)胞，其中編碼所述鈣傳感蛋白的所述核酸被整合到所述細(xì)胞基因組中。
20.如權(quán)利要求10-19所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞還包括一種或更多種質(zhì)膜蛋白，所述質(zhì)膜蛋白選自由G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、受體酪氨酸激酶(RTK)、離子通道蛋白和離子泵蛋白組成的組。
21.如權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述一種或更多種質(zhì)膜蛋白是異源表達的或是內(nèi)源表達的。
22.如權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞還包括位于載體上的或位于所述細(xì)胞基因組中的編碼GPCR的核酸。
23.如權(quán)利要求22所述的細(xì)胞，其中所述GPCR選自由α-1腎上腺素受體(a1-AR)、尾加壓素(UT)受體、5-ΗΤ2和5-ΗΤ6血清素受體、下視丘分泌素(食欲素)受體、組胺HI受體、緩激肽BI和Β2受體、蛙皮素ΒΒ2受體、Ρ2Υ嘌呤受體、乙酰膽堿受體、mGluR5谷氨酸受體、加壓素V2和VI受體、血管緊張素AGTRl受體、膽囊收縮素CCKAR和CCKBR受體、內(nèi)皮素ENDRA受體、胃饑餓素GHSRla受體、褪黑素MTNRl A受體、神經(jīng)降壓素NTSRl受體、血小板活化因子PTAFR受體、泌乳素釋放肽受體PRLHR受體、G-偶聯(lián)5-ΗΤ2、5_ΗΤ2Α、5_ΗΤ6和5-ΗΤ7血清素受體、G1-偶聯(lián)GABA-BJiK Η3和mGluR2/4谷氨酸受體組成的組。
24.如權(quán)利要求10-14或19-23任一項所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是Hela細(xì)胞、KEK293細(xì)胞或人胚腎(HEK)細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求24所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是KEK293細(xì)胞。
26.包含權(quán)利要求10-25任一項所述的細(xì)胞的細(xì)胞群。
27.包含權(quán)利要求10-25任一項所述的細(xì)胞的非人動物。
28.包含權(quán)利要求10-25任一項所述的細(xì)胞的組織切片。
29.分離的鈣傳感蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列從N末端至C末端包括Ml3結(jié)構(gòu)域、環(huán)形排列的綠色熒光蛋白結(jié)構(gòu)域和鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)構(gòu)域， 其中位于N77和Y95、L134和T20UT331和T365和/或T332和E348的至少一對氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代，其中所述氨基酸殘基的位置對應(yīng)于SEQ ID ΝΟ:1中的位置，并且 其中與在還原條件下顯示出的熒光水平相比，所述鈣傳感蛋白在氧化條件下顯示出減少的熒光。
30.如權(quán)利要求29所述的鈣傳感蛋白，所述鈣傳感蛋白包括與SEQID NO:1具有至少90%或至少95%同一性的氨基酸序列。
31.如權(quán)利要求29所述的鈣傳感蛋白，所述鈣傳感蛋白包括SEQID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5示出的氨基酸序列。
32.—種篩選能夠增加或減少細(xì)胞中胞內(nèi)鈣濃度的試劑的方法，所述方法包括: (i)使所述試劑與表達由權(quán)利要求1-3任一項所述的核酸編碼的鈣傳感蛋白的細(xì)胞接觸；以及 (?)確定熒光水平，其中熒光的增加表示所述試劑能夠增加胞內(nèi)鈣濃度，并且熒光的減少表示所述試劑能夠減少胞內(nèi)鈣濃度。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述細(xì)胞選自由動物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、線蟲細(xì)胞和酵母細(xì)胞組成的組。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述動物細(xì)胞是人細(xì)胞或非人細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述人細(xì)胞是在細(xì)胞培養(yǎng)物中。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述非人細(xì)胞選自由嚙齒動物細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞和非人靈長動物細(xì)胞組成的組。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述非人細(xì)胞是在細(xì)胞培養(yǎng)物或在非人動物中。
38. 如權(quán)利要求32-37任一項所述的方法，其中所述動物細(xì)胞是肌肉細(xì)胞、生殖細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、癌細(xì)胞或內(nèi)分泌細(xì)胞。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述肌肉細(xì)胞選自由平滑肌、骨骼肌和心肌組成的組。
40.如權(quán)利要求32-39任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞還包括一種或更多種質(zhì)膜蛋白，所述質(zhì)膜蛋白選自由G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、受體酪氨酸激酶(RTK)、離子通道蛋白和離子泵蛋白組成的組。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述一種或更多種質(zhì)膜蛋白是異源表達的或是內(nèi)源表達的。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述核酸被整合到所述細(xì)胞基因組中。
43.如權(quán)利要求32-42任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞是在細(xì)胞培養(yǎng)物中。
44.如權(quán)利要求32-42任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞是在非人動物中。
45.如權(quán)利要求32-44任一項所述的方法，其中所述試劑是小分子化合物、抗體、蛋白質(zhì)、抑制性核酸或其任意組合。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抑制性核酸選自由三鏈形成寡核苷酸、適體、核酶、短干擾RNA(siRNA)、反義寡核苷酸和微小RNA(miRNA)組成的組。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述小分子化合物是來自于化學(xué)文庫的化合物。
48.如權(quán)利要求32-47任一項所述的方法，其中所述方法是高通量方法。
49.包括下述一種或更多種物質(zhì)的試劑盒: (i )權(quán)利要求4-9所述的一種或更多種載體； (? )權(quán)利要求29-31所述的一種或更多種鈣傳感蛋白； (iii )權(quán)利要求10-25所述的一種或更多種細(xì)胞； (iv )權(quán)利要求27所述的非人動物；和/或 (V )權(quán)利要求28所述的組織切片。
【文檔編號】C12N15/79GK103958684SQ201280051540
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月19日
【發(fā)明者】劉杰, 蔡斌 申請人:瑞健生物醫(yī)藥（蘇州）有限公司