通過層流進行的維持多能性的單個分散細胞的培養(yǎng)法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種不依賴于凋亡劑的添加而進行的、基于人胚胎干細胞(hESCs)和人類人工多能干細胞(hiPSCs)的單個分散培養(yǎng)的新型克隆化方法。更具體地說，本發(fā)明的課題為提供一種基于利用剪切應力的hESCs和hiPSCs的單個分散培養(yǎng)而進行的克隆化方法。通過提供下述方法來解決上述課題，其是使多能性細胞單個分散來進行培養(yǎng)的方法，其中，將單個分散的細胞在層流條件下進行培養(yǎng)。
【專利說明】通過層流進行的維持多能性的單個分散細胞的培養(yǎng)法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及多能性細胞的單個分散細胞培養(yǎng)法。更具體地說，本發(fā)明涉及人胚胎干細胞(hESCs)或人類人工多能干細胞(hiPSCs)的單個分散細胞培養(yǎng)法。
【背景技術】
[0002]預計在不久的將來hESCs (非專利文獻I)和hiPSCs (非專利文獻2)會被用于再生醫(yī)療中，對于這些細胞，在通常的維持培養(yǎng)條件下破壞細胞-細胞間粘附來分散成單個細胞的情況下，在由于肌球蛋白的過度活化而形成細胞的小泡后，會產生凋亡所致的細胞死亡。該半胱天冬酶依賴性細胞死亡受到由E-鈣粘蛋白介導的細胞粘附來源的信號傳遞所帶來的Rho抑制和Rac活性的抑制(非專利文獻3)。由此，介導細胞-細胞間相互作用的細胞外信號傳遞在hiPSCs和hESCs的單個分散細胞培養(yǎng)中發(fā)揮出重要的作用。因此，在為了進行克隆化而進行hESC和hiPSC的單個分散細胞培養(yǎng)時，使用作為抗凋亡劑的ROCK抑制劑(Y-27632)和肌球蛋白抑制劑(Blebbistatin)。
[0003]近年來有報告指出，在脊椎動物的胚胎內由纖毛產生的液體的流動與胚胎的非對稱分化相關(非專利文獻4)，明確了對于針對細胞的外部刺激的應答與細胞命運的確定相關。進一步地，還有報告指出，藉由對細胞表面的硫酸肝素蛋白多糖的刺激而產生的剪切應力與小鼠ES細胞的自身復制相關(非專利文獻5)。但是，hESCs和hiPSCs可以說是與小鼠ES細胞不同的上胚層干細胞，因此有報告指出，在針對細胞因子的應答等中，其顯示出不同的反應等該性質上的差異(非專利文獻6)。從而，目前還無法設想hESCs和hiPSCs針對剪切應力的應答。根據上述內容，在目前的情況下尚未明確利用剪切應力進行的基于hESCs和hiPSCs的單個分散的克隆化方法。
[0004]現(xiàn)有技術文獻
[0005]非專利文獻
[0006]非專利文獻1:Thomson, J.A.et al,.Science, 1998，282:1145-1147
[0007]非專利文獻2:Takahashi K and Yamanaka S.，Cell.，2006，126:663-676
[0008]非專利文獻3:0hgushi M, st al.，Cell Stem Cell.，2010，7:225-239
[0009]非專利文獻4:Burdine RD and Schier AF., Genes Dev., 2000, 14:763-776
[0010]非專利文獻5:Toh YC and Voldman J.，F(xiàn)ASEB J.，201，25:1208-1217[0011 ]非專利文獻 6:Tesar PJ.st al., Nature.，2007，448:196-199

【發(fā)明內容】

[0012]發(fā)明所要解決的課題
[0013]本發(fā)明的課題在于提 供一種不依賴于抗凋亡劑的添加而進行的、基于hESCs和hiPSCs的單個分散培養(yǎng)的新型克隆化方法。更具體地說，本發(fā)明的課題在于提供一種利用了剪切應力的基于hESCs和hiPSCs的單個分散培養(yǎng)的克隆化方法。
[0014]解決課題的手段[0015]本發(fā)明人為了解決上述課題進行了深入研究，結果首先發(fā)現(xiàn)，通過在hESCs和hiPSCs的培養(yǎng)中采用層流條件，能夠進行基于hESCs和hiPSCs的單個分散培養(yǎng)的克隆化。本發(fā)明是基于這樣的技術思想而完成的。
[0016]gp，本發(fā)明提供下述方案:
[0017](I) 一種使多能性細胞單個分散來進行培養(yǎng)的方法，在該方法中，將單個分散的細胞在層流條件下進行培養(yǎng)；
[0018](2)如(I)所述的方法，其中，將細胞在基質膠(Matrigel)上進行培養(yǎng)；
[0019](3)如(I)或(2)所述的方法，其中，使胚胎干細胞維持培養(yǎng)基經層流流通；
[0020](4)如(3)所述的方法，其中，上述胚胎干細胞維持培養(yǎng)基含有纖維原細胞的培養(yǎng)上清；
[0021](5)如(I)至(4)的任意I項所述的方法，其中，將細胞在圓筒形容器內進行培養(yǎng)，該圓筒形容器的截面是直徑為1_以下的圓；
[0022](6)如(5)所述的方法，其中，將細胞在寬0.1mm~1_、高0.1mm~1_、長5_~40mm的容器內進行培養(yǎng)；
[0023](7)如(6)所述的方法，其中，將細胞在寬0.5mm、高0.5mm、長20mm的容器內進行
培養(yǎng)；
[0024](8)如⑴至(7)的任意I項所述的方法，其中，上述層流為50 μ I/分鐘以下的流速；
[0025](9)如⑶所述的方法，其中，上述層流為Inl/分鐘以上50μ I/分鐘以下的流速；
[0026](10)如⑶所述的方法，其中，上述層流為50nl/分鐘以上5μ I/分鐘以下的流速；
[0027](11)如⑴至(10)的任意I項所述的方法，其中，上述層流為在細胞表面產生8X 10?以下的微小剪切應力的流速；
[0028](12)如⑴至(11)的任意I項所述的方法，其中，上述層流為在細胞表面產生8X 10_5Pa以上的微小剪切應力的流速；
[0029](13)如(I)至(12)的任意I項所述的方法，其中，上述多能性細胞為人多能性細胞；
[0030](14)如(13)所述的方法，其中，上述多能性細胞為胚胎干細胞或人工多能干細胞；以及
[0031](15)如權利要求⑴至(14)的任意I項所述的方法，其中，上述層流是由蠕動方式的泵產生的。
[0032]發(fā)明的效果
[0033]本發(fā)明的培養(yǎng)法能夠將多能性細胞以單個分散狀態(tài)進行培養(yǎng)、得到該克隆細胞。因而，利用本發(fā)明，能夠進行適用于再生醫(yī)療的iPSCs的品質管理、基因操作的效率化、克隆化的效率化等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為示出微流體器件的一個方式的圖。
[0035]圖2為示出微流體芯片的構造的圖。[0036]圖3為微流體芯片的放大圖(a)、和示出微流體芯片中的流體的流動的圖(b、c)。箭頭表示培養(yǎng)基流動的方向。b表示通道部分的截面圖，c表示將培養(yǎng)基利用蠕動泵5從蓄液池6中吸上來、使培養(yǎng)基在通道I中流通、并進一步將培養(yǎng)基從通道I灌流到蓄液池6中的流動。
[0037]圖4為示出人工多能干細胞(hiPSCs)在微流體器件內的存活的圖。圖4(a)表示在有無培養(yǎng)基的納米流體流動的培養(yǎng)條件下的hiPSCs的菌落形態(tài)(照片)。圖4(b)表示在納米流體流動條件與靜止條件下的hiPSCs存活率的比較。圖4 (c)表示基于免疫組織化學的在納米流體流動條件下存活的hiPSCs內的多能性標記蛋白質的表達(照片)。圖4 (d)表示基于RT-PCR的多能性標記基因的表達(照片)。
[0038]圖5表示在納米流體流動條件下的針對hiPSCs (人工多能干細胞)的剪切應力的評價。圖5(a)表示利用微流體器件的通道培養(yǎng)的hiPSCs的代表性共聚焦切片(照片)。Φ:直徑、H:高度。圖5(b)表示針對粘附于通道底的hiPSCs的剪切應力分布的模擬。利用白色虛線強調細胞邊界。灰色箭頭表示500nl/分鐘下的流體流動方向。圖5(c)表示粘附在通道底的hiPSCs的周圍的速度矢量和大小的模擬。圖5(d)表示在并非為培養(yǎng)基的微流體流動而為納米流體流動下的hiPSCs的存活(照片)。hiPSCs在播種24小時后從培養(yǎng)底剝落，但在納米流體流動條件下能夠以正常細胞形態(tài)存活。
[0039]圖6表示hiPSCs在各流速下的存活率。存活率為第3天的Nanog陽性活細胞數(shù)相對于第I天的該細胞數(shù)的比例。存活率分別表示n=4的平均值。各誤差線使用標準偏差。
【具體實施方式】
[0040]<多能性細胞>
[0041]本發(fā)明中使用的“多能性細胞”是指具有分化為2種以上細胞的能力的細胞。例如，多能性細胞包括胚胎干細胞(ESCs)、精子干細胞(GSCs)、胚胎生殖細胞(EGCs)、人工多能干細胞(iPSCs)、培養(yǎng)纖維原細胞或骨髓干細胞來源的多能性細胞(Muse細胞)和體性干細胞，但并不限定于此。多能性細胞可以來自各種生物。優(yōu)選為來自包括人的哺乳類動物的多能性細胞，更優(yōu)選為來自小鼠的多能性細胞或來自靈長類的多能性細胞。特別優(yōu)選來自人的多能性細胞。
[0042](A)胚胎干細胞
[0043]ES細胞為由人或小鼠等哺乳動物的早期胚胎(例如胚泡)的內部細胞團確立的、具有多能性和基于自身復制的增殖能力的干細胞。ES細胞為來自屬于受精卵的8細胞期、桑椹胚后的胚胎的胚泡的內部細胞團的胚胎來源的干細胞，其具有可分化為構成成體的所有細胞的能力的所謂分化多能性、以及基于自身復制的增殖能力。ES細胞于1981年在小鼠中發(fā)現(xiàn)(M.J.Evans and Μ.H.Kaufman (1981)，Nature292:154-156)，其后在人、猿等靈長類中也確立了 ES 細胞株(J.A.Thomson et al.(1998)，Science282:1145-1147 ;J.A.Thomson et al.(1995), Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 92:7844-7848 ； J.A.Thomson etal.(1996), Biol.Reprod., 55: 254-259 ； J.A.Thomson and V.S.Marshall (1998), Curr.Top.Dev.Bio，l., 38:133-165)。
[0044]ES細胞可通過從對象動物的受精卵的胚泡中取出內部細胞團并在纖維原細胞的飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)內部細胞團來確立。此外，基于傳代培養(yǎng)的細胞的維持可使用添加有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、堿性纖維原細胞成長因子(basicfibroblast growth factor (bFGF))等物質的培養(yǎng)液來進行。人和猿的ES細胞的確立和維持的方法例如記載于:USP5, 843，780 ;Thomson JA, et al.(1995), Proc Natl.Acad.Sc1.U S A.92:7844-7848 !Thomson JA, et al.(1998), Science.282:1145-1147 ；H.Suemori etal.(2006), Biochem.Biophys.Res.Commun., 345:926-932 ；M.Ueno et al.(2006),Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 103:9554-9559 ；H.Suemori et al.(2001), Dev.Dyn., 222:273-279 ；H.Kawasaki et al.(2002), Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 99:1580-1585 ；Klimanskaya I, etal.(2006) ,Nature.444:481-485 等中。
[0045]作為用于制作ES細胞的培養(yǎng)液，例如可使用添加了 0.lmM2-巰基乙醇、
0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酸、20%KSR和4ng/ml bFGF的DMEM/F-12培養(yǎng)液，在37 0C、2%C02/98% 空氣的濕潤氣氛下維持人 ES 細胞(0.Fumitaka et al.(2008)，Nat.Biotechnol.,26:215-224)。此外，ES細胞需要每3~4天進行傳代，此時，傳代例如可在含有ImM CaCl2和20%KSR的PBS中使用0.25%胰島素和0.lmg/ml膠原酶IV來進行。
[0046]ES細胞的選擇通?？梢砸詨A性磷酸酶、Oct-3/4、Nanog等基因標記的表達為指標利用實時PCR法來進行。特別是在人ES細胞的選擇中，可以以0CT-3/4、NANOG、ECAD等基因標記的表達為指標(E.Kroon et al.(2008)，Nat.Biotechnol.，26:443-452)。
[0047]人ES 細胞株中，例如 WAOl(Hl)和 WA09(H9)可由 WiCell Reserch Institute 獲得，KhES-l、KhES-2和KhES-3可由京都大學再生醫(yī)科學研究所(日本京都)獲得。
[0048](B)精子干細胞
[0049]精子干細胞為睪丸來源的多能干細胞，是用于精子形成的起源細胞。該細胞與ES細胞同樣地能夠分化誘導成各種系列的細胞，例如具有將其移植到小鼠胚泡中時能夠制作出嵌合體小鼠等的性質(M.Kanatsu-Shinohara et al.(2003)Biol.Reprod., 69:612-616 ；K.Shinohara et al.(2004)，Cell, 119:1001-1012)。其可利用含有神經膠質細胞系來源的神經營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))的培養(yǎng)液進行自身復制，并且通過在與ES細胞同樣的培養(yǎng)條件下反復進行傳代，能夠得到精子干細胞(竹林正則等(2008)，實驗醫(yī)學，26卷，5號(增刊)，41~46頁，羊土社(日本東京))。
[0050](C)胚胎生殖細胞
[0051]胚胎生殖細胞是由胚胎期的原始生殖細胞確立的、具有與ES細胞同樣的多能性的細胞，可通過在LIF、bFGF、干細胞因子(stem cell factor)等物質的存在下對原始生殖細胞進行培養(yǎng)來確立(Y.Matsui et al.(1992)，Cell, 70:841-847 J.L.Resnick etal.(1992)，Nature, 359:550-551)。
[0052](D)人工多能干細胞
[0053]人工多能性干(iPS)細胞可通過將特定的初始因子以DNA或蛋白質的形態(tài)導入到體細胞中來制作，其是與ES細胞具有大致相同的特性、例如具有分化多能性與基于自身復制的增殖能力的體細胞來源的人工干細胞(K.Takahashi andS.Yamanaka(2006)Cell, 126:663-676 ;K.Takahashi et al.(2007)，Cell, 131:861-872 ;J.Yu et al.(2007), Scie nce, 318: 1917-1920 ；Nakagawa,M.等，Nat.Biotechnol.26:101-106 (2008);國際公開W02007/069666)。初始因子可以由如下物質構成:在ES細胞中特異性表達的基因、其基因產物或者非編碼RNA ;或在ES細胞的未分化維持中發(fā)揮重要作用的基因、其基因產物或者非編碼RNA ;或者低分子化合物。作為初始因子所含有的基因，例如可示例出Oct3/4、Sox2、SoxU Sox3、Soxl5、Soxl7、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc, L-Myc, Nanog、Lin28、Fbxl5、ERas, ECAT15-2, Tell、β -連鎖蛋白基因(beta-catenin)、Lin28b、SallK Sall4、Esrrb> Nr5a2> Tbx3 或 Glisl 等，這些初始因子可單獨使用、也可組合使用。作為初始因子的組合，可示例出下述文件中記載的組合:冊2007/069666、W02008/118820, W02009/007852, W02009/032194, W02009/058413,W02009/057831, W02009/075119, W02009/079007, W02009/091659, W02009/101084,W02009/101407, W02009/102983, W02009/114949, W02009/117439, W02009/126250,W02009/126251, W02009/126655, W02009/157593, W02010/009015, W02010/033906,W02010/033920, W02010/042800, W02010/050626, W02010/056831, W02010/068955,W02010/098419, W02010/102267, W02010/111409, W02010/111422、W02010/115050、W02010/124290、W02010/147395、W02010/147612、Huangfu D, et al.(2008), Nat.Biotechnol.，26:795-797、Shi Y, et al.(2008), Cell Stem Cell,2:525-528、Eminli S，et al.(2008), Stem Cells.26: 2467-2474、Huangfu D, et al.(2008), NatBiotechnol.26: 1269-1275、Shi Y, et al.(2008), Cell Stem Cel1，3，568-574、Zhao Y, et al.(2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell StemCell, 3，132-135、Feng B, et al.(2009)，Nat Cell Biol.11:197-203、R.L.Judsonet al., (2009)，Nat.Biotech.，27:459-461、Lyssiotis CA, et al.(2009), Proc NatlAcad Sci U S A.106:8912-8917、Kim JB, et al.(2009)，Nature.461:649-643、IchidaJK, et al.(2009), Cell Stem Cel 1.5:491-503、Heng JC, et al.(2010), Cell StemCell.6:167-74、Han J, et al.(2010)，Nature.463:1096-100、MaliP, et al.(2010), StemCells.28:713-720、Maekawa M,et al.(2011)，Nature.474:225-9。 [0054]在上述初始因子中，也可以含有出于提高確立效率的目的而使用的下述因子:組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑[例如，丙戊酸(VPA)、曲古柳菌素A、丁酸鈉、MC1293、M344等低分子抑制劑、針對 HDAC 的 siRNA 和 shRNA (例如:HDAClsiRNA Smartpool (Millipore)、針對HDACl的HuSH29mer shRNA構建體(OriGene)等)等核酸性表達抑制劑等];MEK抑制劑(例如PD184352、PD98059、U0126、SL327和PD0325901);糖原合成酶激酶_3抑制劑(例如，Bio和CHIR99021) ;DNA甲基轉移酶抑制劑(例如，5-氮雜胞苷)；組蛋白甲基轉移酶抑制劑(例如:BIX-01294等低分子抑制劑、針對Suv39hl、Suv39h2、SetDBl和G9a的siRNA和shRNA等的核酸性表達抑制劑等)；L-型鈣通道激動劑(例如Bayk8644) ;丁酸；TGF β抑制劑或ALK5抑制劑(例如LY364947、SB431542、616453和Α-83-01) ;p53抑制劑(例如針對p53 的 siRNA 和 shRNA) ;ARID3A 抑制劑(例如針對 ARID3A 的 siRNA 和 shRNA) ;miR-291_3p、miR-294、miR-295和mir_302等miRNA ；ffnt信號通路(例如可溶性Wnt3a);神經肽Y ;前列腺素類(例如，前列腺素E2和前列腺素J2) ;hTERT、SV40LT、UTFU IRX6、GLIS1, PITX2、DMRTBl等，在本說明書中，對于這些出于改善確立效率的目的而使用的因子，與初始因子不進行特別區(qū)分。
[0055]在初始因子為蛋白質形態(tài)的情況下，例如可通過脂質體轉染、與細胞膜透過性肽(例如HIV來源的TAT和聚精氨酸)的熔合、顯微注射等方法導入到體細胞內。另一方面，在為DNA形態(tài)的情況下，例如可通過病毒、質粒、人工染色體等載體、脂質體轉染、脂質體、顯微注射等方法導入到體細胞內。作為病毒載體，可示例出逆轉錄病毒載體、慢病毒載體(以上記載于 Cell, 126，pp.663-676，2006 ；Cell, 131，pp.861-872，2007 ；Science, 318，pp.1917-1920，2007)、腺病毒載體(Science, 322，945-949，2008)、腺伴隨病毒載體、仙臺病毒載體(W02010/008054)等。此外，作為人工染色體載體，例如包括人工染色體(HAC)、酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC、PAC)等。作為質粒，可使用哺乳動物細胞用質粒(Science，322:949-953, 2008)。在載體中可以含有啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子、多聚腺苷化位點等調節(jié)序列以使其能夠表達核初期化物質，進一步可根據需要含有藥劑耐性基因(例如卡那霉素耐性基因、氨芐青霉素耐性基因、嘌呤霉素耐性基因等)、胸苷激酶基因、白喉毒素基因等選擇標記序列、綠色熒光蛋白(GFP)、β葡糖醛酸酶(GUS)、FLAG等報告基因序列等。此外，在上述載體中，為了在導入到體細胞中之后一起切除編碼初始因子的基因或者編碼啟動子和其上結合的初始因子的基因，在其前后可以具有LoxP序列。
[0056]此外，在RNA形態(tài)的情況下，例如可通過脂質體轉染、顯微注射等方法導入到體細胞內，為了抑制分解，可以使用插入了 5-甲基胞苷和假尿苷(TriLink Biotechnologies)的 RNA(Warren L, (2010)Cell Stem Cell.7:618-630)。
[0057]作為用于iPS細胞誘導的培養(yǎng)液，例如包括:含有10%~15%FBS的DMEM、DMEM/F12或DME培養(yǎng)液(在這些培養(yǎng)液中可以進一步適當含有LIF、青霉素/鏈霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸類、β -巰基乙醇等)或市售的培養(yǎng)液[例如:小鼠ES細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液(TX-WES培養(yǎng)液、THR0MG0X社)、靈長類ES細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液(靈長類ES/iPS細胞用培養(yǎng)液、Reprocell社)、無血清培養(yǎng)基(mTeSR、Stemcell Technology社)]等。
[0058]作為培養(yǎng)法的示例，例如可在37°C、5%C02存在下在含有10%FBS的DMEM或DMEM/F12培養(yǎng)液上使體細胞與初始因子接觸并進行約4~7天的培養(yǎng)，其后將細胞重新播種在飼養(yǎng)細胞(例如絲裂霉素C處理STO細胞、SNL細胞等)上，在體細胞與初始因子接觸起約10天后利用含有bFGF的靈長類ES細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，在該接觸起約30天~約45天或其以上后，可產生iPS樣菌落。
[0059]或者可在37°C、5%C02存在下在飼養(yǎng)細胞(例如絲裂霉素C處理STO細胞、SNL細胞等)上利用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液(其中可以進一步適當含有LIF、青霉素/鏈霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸類、β_巰基乙醇等)進行培養(yǎng)，在約25天~約30天或其以上后，可產生ES樣菌落。優(yōu)選可示例出不使用飼養(yǎng)細胞而使用初期化的體細胞本身(Takahashi K, et al.(2009)，PLoS One.4:e8067或W02010/137746)、或者使用細胞外底物(例如，層粘蛋白-5 (W02009/123349)和基質膠(BD社))的方法。
[0060]除此之外，還可示例出使用不含有血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的方法(Sun N, etal.(2009), Proc Natl Acad Sci U S A.106:15720-15725)。進一步地，為了提高確立效率，也可以通過缺氧條件(0.1%以上、15%以下的氧濃度)來確立iPS細胞(Yoshida Y, etal.(2009)，Cell Stem Cell.5:237-241 或 W02010/013845)。
[0061]在上述培養(yǎng)之間，在從培養(yǎng)開始第2天以后，每天進行I次與新鮮的培養(yǎng)液的培養(yǎng)液交換。此外，在核初期化中使用的體細胞的細胞數(shù)沒有限定，在每IOOcm2的培養(yǎng)皿中為約5 X IO3~約5 X IO6細胞的范圍。
[0062]iPS細胞可利用所形成的菌落的形狀進行選擇。另一方面，在導入與體細胞被初期化的情況下所表達的基因(例如，Oct3/4、Nanog)連動表達的藥劑耐性基因作為標記基因的情況下，可通過利用含有對應的藥劑的培養(yǎng)液(選擇培養(yǎng)液)進行培養(yǎng)來選擇所確立的iPS細胞。此外，在標記基因為熒光蛋白基因的情況下，可通過利用熒光顯微鏡進行觀察來選擇iPS細胞；在為發(fā)光酶基因的情況下，可通過加入發(fā)光底物來選擇iPS細胞；并且在為顯色酶基因的情況下，可通過加入顯色底物來選擇iPS細胞。
[0063]本說明書中使用的“體細胞”這一術語是指除去卵子、卵母細胞、ES細胞等生殖系列細胞或分化全能性細胞之外的所有動物細胞(優(yōu)選為包括人的哺乳動物細胞)。在體細胞中，非限制性地包含胎兒(仔)的體細胞、新生兒(仔)的體細胞、以及成熟健全的或者疾病性的體細胞中的任意一種，并且還包含原代培養(yǎng)細胞、傳代細胞和株化細胞中的任意一種。具體地說，體細胞可示例出例如(I)神經干細胞、造血干細胞、間葉系干細胞、齒髄干細胞等組織干細胞(體性干細胞)；(2)組織前體細胞、(3)淋巴細胞、上皮細胞、內皮細胞、肌肉細胞、纖維原細胞(皮膚細胞等)、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、胰腺細胞(胰腺外分泌細胞等)、腦細胞、肺細胞、腎細胞和脂肪細胞等分化后的細胞等。
[0064]此外，在使用iPS細胞作為移植用細胞的材料的情況下，從不會產生排斥反應這樣的方面考慮，優(yōu)選使用移植目的的個體的HLA基因型相同或者實質上相同的體細胞。此處，“實質上相同”是指HLA基因型呈現(xiàn)出按照針對移植后的細胞能夠利用免疫抑制劑抑制免疫反應的程度的一致，例如為具有HLA-A、HLA-B和HLA-DR的3基因座或者加上HLA-C的4基因座一致的HLA型的體細胞。
[0065](E)通過核移植得到的克隆胚來源的ES細胞
[0066]nt ES細胞為通過核移植技術制作的克隆胚來源的ES細胞，其與受精卵來源的 ES 細胞具有大致相同的特性(T.Wakayama et al.(2001)，Science, 292:740-743 ;
S.Wakayama et al.(2005), Biol.Reprod., 72:932-936 ；J.Byrne etal.(2007), Nature, 450:497-502)。即，由通過將未受精卵的核取代為體細胞的核而所得到的克隆胚來源的胚泡的內部細胞團而確立的ES細胞為nt ES(核移植ES)細胞。為了制作ntES細胞，利用核移植技術(J.B.Cibelli et al.(1998)，Nature Biotechnol.，16:642-646)與ES細胞制作技術(上述)的組合(若山清香等(2008)，實驗醫(yī)學，26卷，5號(增刊)，47~52頁)。在核移植中，可通過在哺乳動物的去核未受精卵中注入體細胞的核并進行數(shù)小時培養(yǎng)來進行初期化。
[0067](F)多系分化持續(xù)應激細胞(Muse細胞)
[0068]Muse細胞為按照W02011/007900所述的方法制造出的多能干細胞，詳細地說，其是對纖維原細胞或骨髓間質細胞進行長時間的胰島素處理、優(yōu)選進行8小時或16小時的胰島素處理后進行懸浮培養(yǎng)而得到的具有多能性的細胞，SSEA-3和CD105為陽性。
[0069]<單個分散細胞培養(yǎng)法>
[0070]本發(fā)明中使用的“單個分散細胞培養(yǎng)法”是指對分散的單細胞進行培養(yǎng)使其增殖的方法，其包括對2個以上的細胞未藉由鈣粘蛋白粘合而發(fā)生分離的細胞進行增殖并克隆化的行為。為了使細胞分散，可以使用力學方法，或者也可使用藥劑。作為此時使用的藥劑，可示例出具有蛋白酶活性的酶或者含有EDTA的試劑。例如可舉出胰島素/EDTA、Accutase (TM)和 Accumax (TM),但并不限定于此。
[0071]本發(fā)明中提供了在層流條件下進行多能性細胞的單個分散細胞培養(yǎng)的方法。層流可通過使培養(yǎng)基相對于粘附在細胞培養(yǎng)容器上的多能性細胞進行流動來實施。優(yōu)選通過在該條件下的培養(yǎng)來維持增殖細胞的多能性。本發(fā)明中，多能性的維持可通過細胞中持續(xù)表達多能性標記來確認。多能性標記沒有特別限定，可以舉出例如Oct3/4、Nanog。
[0072]本發(fā)明中的“層流”是指流體的流線與壁面平行，其是指并非為紊流的流場。優(yōu)選層流越靠近壁流速越小，通過與壁面離開一定距離以上，成為流速均勻的流場。因而，在本發(fā)明中，層流的流速是指離開壁面一定距離以上的均勻的流速。
[0073]層流的流速例如為在距離細胞表面10μπι以上的點測定出的流速。本發(fā)明中的層流的流速例如為50 μ l/分鐘以下、40 μ l/分鐘以下、30 μ l/分鐘以下、25 μl/分鐘以下、20 μ l/分鐘以下、10 μ l/分鐘以下、5 μ l/分鐘以下、3 μ l/分鐘以下、2.5 μ l/分鐘以下、2μ l/分鐘以下、1μ l/分鐘以下、900nl/分鐘以下、800nl/分鐘以下、700nl/分鐘以下、650nl/分鐘以下、600nl/分鐘以下、500nl/分鐘以下、400nl/分鐘以下、300nl/分鐘以下、200nl/分鐘以下、IOOnl/分鐘以下、50nl/分鐘以下、25nl/分鐘以下、1nl/分鐘以下，但并不限定于此。優(yōu)選為5 μl/分鐘以下的流速。更優(yōu)選在距離細胞表面10μπι以上的點為3 μ l/分鐘以下、2.5 μl/分鐘以下的流速。進一步優(yōu)選為2 μl/分鐘以下。還進一步優(yōu)選為?μl/分鐘以下。并且，進一步優(yōu)選的是，層流的流速在距離細胞表面ΙΟμπι以上的點為650nl/分鐘以下、600nl/分鐘以下。更優(yōu)選在距離細胞表面1Oym以上的點為500nl/分鐘或其附近區(qū)域的流速。層流的流速例如還為Inl/分鐘以上、25nl/分鐘以上、50nl/分鐘以上、IOOnl/分鐘以上、120nl/分鐘以上、150nl/分鐘以上、200nl/分鐘以上、300nl/分鐘以上、400nl/分鐘以上、450nl/分鐘以上、500nl/分鐘以上、600nl/分鐘以上、700nl/分鐘以上、800nl/分鐘以上、900nl/分鐘以上、1 μl/分鐘以上、10 μl/分鐘以上、20 μl/分鐘以上、25 μl/分鐘以上、30 μl/分鐘以上、40 μl/分鐘以上、45 μ l/分鐘以上、50 μl/分鐘以上，但并不限定于此。優(yōu)選為50nl/分鐘以上。更優(yōu)選為IOOnl/分鐘以上。進一步優(yōu)選為120nl/分鐘以上。更優(yōu)選為150nl/分鐘以上。并且進一步優(yōu)選為300nl/分鐘以上、450ηI/分鐘以上。
[0074]通過層流在細胞表面產生剪切應力。在本發(fā)明中，通過層流的流速產生的剪切應力例如為8X 10?以下、5X KT3Pa以下、4X KT3Pa以下、3X KT3Pa以下、2X KT3Pa以下、
1X KT3Pa 以下、9 X KT4Pa 以下、8.5 X KT4Pa 以下、1 X KT4Pa 以下、1X KT5Pa 以下、1 X KT6Pa以下、1X KT7Pa以下、1X KT8Pa以下，但并不限定于此。優(yōu)選為8X KT3Pa以下。更優(yōu)選為產生5X10_3Pa以下的微小剪切應力的速度，并且進一步優(yōu)選為4X10_3Pa以下。更進一步優(yōu)選為3 X KT3Pa以下。并且還優(yōu)選為2 X KT3Pa以下、1 X KT3Pa以下、9 X KT4Pa以下、8.5 X KT4Pa以下。通過層流的流速而產生的剪切應力例如還為IXlO-8Pa以上、1X KT7Pa以上、1 X KT6Pa 以上、1 X KT5Pa 以上、8 X KT5Pa 以上、1 X KT4Pa 以上、1.5 X KT4Pa 以上、2X IO^4Pa 以上、2.4X KT4Pa 以上、4X KT4Pa 以上、4.5X KT4Pa 以上、7X KT4Pa 以上、
7.5X KT4Pa以上，但并不限定于此。優(yōu)選為8X KT5Pa以上。更優(yōu)選為1.5X KT4Pa以上。進一步優(yōu)選為2X 10_4Pa以上，并且更優(yōu)選為2.4X 10_4Pa以上。此外還優(yōu)選為4X 10_4Pa以上、4.5X IO^4Pa 以上、7.5X IO^4Pa 以上。
[0075]在本發(fā)明中，對于為了維持多能性而使用的培養(yǎng)基，只要是一般用于維持胚胎干細胞的多能性的胚胎干細胞維持培養(yǎng)基，就可以為任意培養(yǎng)基。這樣的培養(yǎng)基可通過以動物細胞的培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基并向其中添加所期望的物質來制備。作為基礎培養(yǎng)基，例如包括頂DM培養(yǎng)基、Med1uml99培養(yǎng)基、伊格爾最低必需培養(yǎng)基(EMEM)、a MEM培養(yǎng)基、杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、Ham’ s F12培養(yǎng)基、RPM11640培養(yǎng)基、F1scher’s培養(yǎng)基、和它們的混合培養(yǎng)基等。作為所添加的物質，例如包括1種以上的選自血清、白蛋白、鐵傳遞蛋白、Knockout血清替代物(KSR) (ES細胞培養(yǎng)時的FBS的血清代替物)、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前體、微量元素、2-巰基乙醇、3’-硫醇甘油、脂質、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax (invitrogen)、非必需氨基酸、維生素、bFGF、L1F、抗生物質、抗氧化劑、乙酰甲酸、緩沖劑、無機鹽類中的物質。胚胎干細胞維持培養(yǎng)基還可以為含有纖維原細胞、STO細胞等飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)上清的馴化培養(yǎng)基。
[0076]在本發(fā)明中，單個分散細胞培養(yǎng)可使用與能夠在培養(yǎng)基中產生層流的送液裝置組合而成的細胞培養(yǎng)容器來進行。優(yōu)選對培養(yǎng)容器進行涂覆處理，作為涂覆劑，可以舉出例如基質膠(BD)、膠原蛋白、明膠、層粘蛋白、肝素硫酸蛋白多糖或巢蛋白、以及它們的組合。優(yōu)選基質月父。
[0077]能夠在培養(yǎng)基中產生層流的機器為本領域技術人員公知的輸液泵即可，例如可以舉出基于蠕動方式的輸液泵。
[0078]細胞培養(yǎng)容器只要具有能夠進行多能性細胞的單個分散細胞培養(yǎng)的大小即可，大小和形狀沒有特別限定，根據使層流穩(wěn)定流通的目的，可以為在密閉系的流路(通道)內進行培養(yǎng)基的送液來培養(yǎng)細胞的細胞培養(yǎng)容器。此時，該流路的截面形狀沒有特別限定，可以為三角形、四邊形、五邊形等多邊形或圓形。從易于進行成形的方面考慮，優(yōu)選為4邊形。并且，通道的截面大小優(yōu)選小于直徑1mm的圓形、優(yōu)選大于直徑0.1_。另外在為多邊形的情況下,一邊可以為1nm~500 μ m。通道的截面面積例如可以舉出0.01mm2~1mm2的范圍。優(yōu)選為0.25mm2。在本發(fā)明中，將比直徑為1mm的圓形小的通道稱為微通道。優(yōu)選為具有一邊為500 μ m的四邊形截面的通道。通道沒有特別限定，可以為直線、可以為曲線、也可以是彎曲。進一步地，通道還可以與其它通道交叉。通道的長度沒有特別限定，為1mm以上即可，例如可以舉出5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm或其以上的長度。優(yōu)選為20mm。
[0079]具有通道的細胞培養(yǎng)容器可以由塑料、例如由硅樹脂(例如聚甲基硅氧烷(PDMS))、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚苯乙烯、SU-8或玻璃之類的材料來制作。此時，對于材料，考慮到要進行培養(yǎng)基的送液，將其變?yōu)橛H水性，因而可利用本領域技術人員公知的方法對通道內壁部進行氧等離子體處理。細胞培養(yǎng)容器的通道可通過將具有作為通道的槽的層與平坦層組合來制作。該槽可使用通過利用負型光致抗蝕劑、例如SU-8光致抗蝕劑而制備出的模具來進行成型。例如，將光致抗蝕劑涂覆至玻璃母盤，留下作為通道所期望的形狀進行遮蓋，由所得到的非涂覆面進行曝光，在去除未曝光的抗蝕劑時，在玻璃母盤上留有隆起圖案，可以使用該隆起作為槽的模具。槽的高度可通過光致抗蝕劑的涂覆厚度進行調整。
[0080]在使用具有通道的細胞培養(yǎng)容器的情況下，優(yōu)選設置接受所送液的培養(yǎng)基的溶液儲存部、和用于將細胞等送達至通道內的投入口。
[0081]進一步優(yōu)選進行加壓以使密閉系的通道內不會產生氣泡。加壓可通過利用泵增加送液壓、或對通道進行壓迫等本領域技術人員公知的方法來進行。例如，在使用基于蠕動方式的輸液泵的情況下，作為利用泵增加送液壓的方法，可通過使設于該泵內的用于進行擠壓送液的軟質管的管厚比通常更厚(400μm左右)來進行。此外，作為壓迫通道的方法，例如可通過使隔膜(例如厚度30 μ m的聚乙烯膜)與通道接合來進行。
[0082]上述的細胞培養(yǎng)容器和送液裝置例如設于371:、5%0)2存在的條件下。進一步地，為了進行維持培養(yǎng)，可設于缺氧狀態(tài)的狀況下。此處缺氧狀態(tài)是氧分壓為1%至10%的狀態(tài)，優(yōu)選為5%。
[0083]在粘附有通過上述單個分散細胞培養(yǎng)法進行維持培養(yǎng)的單個分散狀態(tài)的多能性細胞的細胞培養(yǎng)容器中，進一步流通添加有作為篩選對象的候選藥劑的培養(yǎng)基，基于此進行多能性細胞的變化的觀察，由此可以檢查候選藥劑的效果。此處，多能性細胞的變化可以舉出例如在內胚層細胞、外胚層細胞、中胚層細胞、脊索中胚層、軸旁中胚層、中間中胚層細胞、側板中胚層、神經細胞、膠質細胞、造血細胞、肝細胞、胰腺β細胞、腎前體細胞、內皮細胞、周皮細胞、上皮細胞、骨原細胞、肌原細胞、軟骨細胞等特定細胞中的變化。這種情況下，可將候選藥劑作為針對各細胞的分化誘導劑進行選擇。作為其它方式，例如可以舉出，使用W02010/035885所述的方法來確認多能性細胞的增殖的變化，從而對候選藥劑的催畸形性進行檢查的方法。因而，本發(fā)明提供了用于進行藥劑篩選的含有單個分散狀態(tài)的多能性細胞的細胞培養(yǎng)容器。出于使候選藥劑的量為盡可能少量的目的，優(yōu)選為具有含有多能性細胞的微通道的細胞培養(yǎng)容器。
[0084]實施例
[0085]通過下述的實施例進一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不受這些實施例的限制。
[0086](實施例1)微流體器件的制作 [0087]<微流體芯片>
[0088]將聚乙烯(PE)膜102、聚甲基硅氧烷(PDMS)層103和作為涂覆有SU8的玻璃板的SU8層104利用壓板101和105夾在中間，構建微流體芯片100 (圖2)。具體地說，PDMS層是如下得到的:向形成有通過SU8的平板印刷法制作的6個槽(寬0.5mm、長度20mm、高度0.5mm)的模具中注入熱固化性的PDMS(Slipotl84, Toray-Daw Corning, Japan)使其為3mm的厚度，在80°C在干燥器中固化4小時進行制作。將其從模具中取出時，得到形成有6個通道的PDMS層。進一步地，PDMS層是如下制作的:使用不銹鋼性的直徑Imm的活檢針將注入口和排出口在通道的兩側開孔。SU8層是在玻璃板上涂覆SU8(SU-82010，Microchem)后照射紫外線進行固化來制作的。通過SU8平板印刷來印上用于在與PDMS層接合時對準XY軸的十字印。接下來通過利用氧等離子體對SU8層進行表面處理來附加親水性特性。PE膜是為了緩和由壓板所致的壓力而設置的。壓板在底面的通道部分開孔從而能夠利用顯微鏡確認流路，夾住各層進行固定。
[0089]<微流體器件的裝配>
[0090]在管式泵機構中將使用了管厚為400 μ m的硅橡膠管的蠕動泵5利用管(PTFE管TUF-100 系列 AWG-30, Chukoh Chemical Industries, Japan)與通過上述方法制作的微流體芯片100的注入口 2聯(lián)結。進一步地，各注入口與用于設置注射器(用于裝填細胞)的一個注射閥7連接。并且，排出口 3與蓄液池6聯(lián)接(圖3)。在注入口和排出口帶有隔膜4(厚度30μπι的聚乙烯膜)以使得流路內不會產生氣泡。如此制作的微流體器件A(圖1)可對通道I內的培養(yǎng)基的納米流體流動進行穩(wěn)定且精確的調節(jié)。罐流培養(yǎng)系所用的微流體器件使用來自3.0電壓電池的DC電源，在CO2培養(yǎng)箱內設置數(shù)天。[0091](實施例2)使用微流體器件的iPS細胞培養(yǎng)及其評價
[0092]〈iPS細胞的制備〉
[0093]使用由JCRB細胞庫提供的人胎兒肺纖維原細胞(TIG3)，利用逆轉錄病毒導入0CT3/4、S0X2、KLF4和c_MYC，誘導hiPSCs株。在包覆有基質膠的培養(yǎng)皿上，在MEF (小鼠胚性纖維原細胞)馴化hES培養(yǎng)基(添加有20%KnoCkout血清替代品(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-巰基乙醇和IOng/mlbFGF(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)的 DMEM/F12)中進行 TIG3_iPSC 的培養(yǎng)。
[0094]<免疫染色法>
[0095]使用4%PFA(多聚甲醛)/PBS(磷酸緩沖生理食鹽水)，在室溫下將回收的細胞固定10分鐘，利用PBST (PBS中、0.l%Triton X-100)清洗后，在4 °C在封閉溶液(PBST中、3%BSA和2%脫脂乳(DIFCO，USA))中進行一晚預處理。接下來與一次抗體:抗 0CT4(1:50，Santa Cruz Biotechnology, USA)> 抗 S0X2(1:500，Abeam, Cambridge, UK)或抗NANOG (1.200, Abeam, Cambridge, UK)發(fā)生免疫反應后，利用熒光二次抗體(I: 500, Invitrogen)進行染色。進一步使用DAPI (4，6- 二脒基-2-苯基吲哚)進行核的對比染色，使用SlowFade light防褪色試劑盒(Invitrogen)防止光褪色,之后使用1X70倒立顯微鏡得到熒光圖像。
[0096]〈RT-PCR 法 >
[0097]將細胞回收，使用TRIzoI試劑(Invitrogen，USA)提取培養(yǎng)細胞的全RNA。按照制造商的說明，使用隨機六核苷酸，利用Superscript III (Invitrogen, USA)由l.0yg的全RNA得到cDNA。將所得到的cDNA作為模板，使用表1記載的引物組，通過PCR法擴增目的基因。
[0098]【表1】
【權利要求】
1.一種使多能性細胞單個分散來進行培養(yǎng)的方法，在該方法中，將單個分散的細胞在層流條件下進行培養(yǎng)。
2.如權利要求1所述的方法，其中，將細胞在基質膠上進行培養(yǎng)。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，使胚胎干細胞維持培養(yǎng)基經層流流通。
4.如權利要求3所述的方法，其中，所述胚胎干細胞維持培養(yǎng)基含有纖維原細胞的培養(yǎng)上清。
5.如權利要求1~4的任意I項所述的方法，其中，將細胞在圓筒形容器內進行培養(yǎng)，該圓筒形容器的截面是直徑為1_以下的圓。
6.如權利要求5所述的方法,其中，將細胞在寬0.1mm~1mm、高0.1mm~1mm、長5mm~40mm的容器內進行培養(yǎng)。
7.如權利要求1~6的任意I項所述的方法，其中，所述層流為50μ I/分鐘以下的流速。
8.如權利要求7所述的方法，其中，所述層流為Inl/分鐘以上50μI/分鐘以下的流速。
9.如權利要求7所述的方法，其中，所述層流為50nl/分鐘以上5μI/分鐘以下的流速。
10.如權利要求1~9的任意I項所述的方法，其中，所述層流為在細胞表面產生8X 10_3Pa以下的微小剪切應力的流速。
11.如權利要求1~10的任意I項所述的方法，其中，所述層流為在細胞表面產生8X10_5Pa以上的微小剪切應力的流速。
12.如權利要求1~11的任意I項所述的方法，其中，所述多能性細胞為人多能性細胞。
13.如權利要求12所述的方法，其中，所述多能性細胞為胚胎干細胞或人工多能干細胞。
14.如權利要求1~13的任意I項所述的方法，其中，所述層流是由蠕動方式的泵產生的。
【文檔編號】C12N5/00GK103917641SQ201280051375
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年10月22日 優(yōu)先權日:2011年10月21日
【發(fā)明者】小寺秀俊, 巽和也, 橫川隆司, 多田高, 長田翔伍, 興津輝, 小此木孝仁, 野田雄一郎, 中西直之, 松村拓, 大隅孝志 申請人:愛科來株式會社