使用具有增強(qiáng)的鞭毛形成及運(yùn)動性級聯(lián)基因的表達(dá)的腸桿菌科細(xì)菌生產(chǎn)l-氨基酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種使用屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌，特別是屬于埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)或泛菌屬(Pantoea)的能動細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中細(xì)菌被修飾從而高表達(dá)至少一種鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)(motility?cascade)基因。
【專利說明】使用具有增強(qiáng)的鞭毛形成及運(yùn)動性級聯(lián)基因的表達(dá)的腸桿菌科細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法
[0001]發(fā)明【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，更具體地涉及一種腸桿菌科細(xì)菌，其中與鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)相關(guān)的基因的表達(dá)被去調(diào)控，并涉及通過發(fā)酵上述鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)基因的表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)菌來生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]傳統(tǒng)上，L-氨基酸是利用從自然資源獲得的微生物菌株，或其突變體，通過發(fā)酵方法生產(chǎn)的。典型地，將微生物加以修飾以提高L-氨基酸的產(chǎn)量。
[0004]已經(jīng)報(bào)道了許多用于提高L-氨基酸產(chǎn)量的技術(shù)，包括使用重組DNA轉(zhuǎn)化微生物(見例如美國專利N0.4，278，765)和改變調(diào)控區(qū)，例如啟動子、前導(dǎo)序列和/或衰減子或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的區(qū)域(見例如US20060216796和W09615246A1)。其它可用于提高產(chǎn)量的技術(shù)包括提高參與氨基酸生物合成的酶的活性，和/或使目標(biāo)酶對由產(chǎn)物L(fēng)-氨基酸所致的反饋抑制脫敏(見例如W09516042A1，EP0685555A1或美國專利Nos.4，346，170，5，661，012 和 6，040，160)。
[0005]可用于通過發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株是已知的，包括參與L-蘇氨酸生物合成的酶的活性增加的菌株(EP0219027A2 或美國專利 Nos.5，175，107; 5，661，012; 5，705，371; 5，939，307)，耐受化合物如L -蘇氨酸及其模擬物的菌株(W00114525A1，EP301572A2,美國專利N0.5，376，538)，目標(biāo)酶對由產(chǎn)生的L-氨基酸或其副產(chǎn)物所致的反饋抑制脫敏的菌株(美國專利Nos.5，175，107和5，661，012)，和蘇氨酸降解酶被失活的菌株(美國專利Nos.5，939，307 和 6，297，031)。
[0006]有文獻(xiàn)報(bào)道，運(yùn)動性細(xì)菌例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)等可顯示不同的生活方式，并可以是運(yùn)動性的單細(xì)胞(或浮游狀態(tài))，也可以是少動的細(xì)胞(sedentary cells)，利用粘附菌毛(adhesive fimbriae)彼此聚集在一起并在表面上形成生物膜(O，Toole G.A.etal., Annu.Rev.Microbiol., 2000:54, 49-79) ? 例如，大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞在對數(shù)后生長期(post-exponential growth phase)是高度可動的(Amsler C.D.et al., J.Bacteriol.，1993:175，6238-6244)，當(dāng)進(jìn)入靜止期時(shí)則會通過誘導(dǎo)粘附性的curli菌毛(curIi fimbriae)而聚集或黏著在表面上(01s6n A.et al.，Nature, 1989:338，652-655)。
[0007]已知在大腸桿菌中，鞭毛形成與運(yùn)動性、以及curli介導(dǎo)的粘附級聯(lián)均處于前饋調(diào)控級聯(lián)的控制之下，每一個級聯(lián)均在頂端有一個主調(diào)控子，其發(fā)揮大環(huán)境信號整合子(massive environmental signal integrator)的作用(Pesavento C.etal., Gen.Dev.，2011:22, 2434-2446)。curli菌毛控制的級聯(lián)是一般脅迫響應(yīng)中的一個模塊，其中oS因子(sigmaS, RpoS)發(fā)揮主調(diào)控子的作用(Hengge-Aronis R.2000.The general stress response in E.col1.1n Bacterial stress responses(eds.G.Storz and R.Hengge-Aronis), 161 - 178 頁.ASM Press, Washington, DC.)。CsgD 蛋白顯示是curli結(jié)構(gòu)基因操縱子(csgBAC)的主要激動子(Gerstel U.et al., Mol.Microbiol.，2003:49，639-654)。
[0008]對于鞭毛表達(dá)和運(yùn)動性級聯(lián)而言，主調(diào)控子是FlhDC復(fù)合體，其是由flhDC操縱子表達(dá)的，f IhDC操縱子被定義為鞭毛第I類操縱子。鞭毛主調(diào)控子FlhDC以FlhD與FlhC蛋白所成的異源寡聚復(fù)合體(FlhD4C2復(fù)合體)的形式發(fā)揮功能，來源于大腸桿菌的該復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析(Wang S.et al.，J.Mol.Biol.，2006，355:798-808)。FlhDC 復(fù)合體調(diào)控細(xì)菌中來自多個鞭毛和非鞭毛操縱子的轉(zhuǎn)錄，特別地，它激活第2類操縱子的表達(dá)，第2類操縱子負(fù)責(zé)鞭毛和多種因子(FliA, FlgM)的內(nèi)部部分(Pesavento C.et al.，Gen.Dev.，2011:22, 2434-2446)。在FlgM因子被分泌之后，F(xiàn)liA被釋放而激活第3類操縱子，這類操縱子編碼鞭毛發(fā)揮功能和趨化性所需的其他鞭毛蛋白的外部亞單位，以及若干功能仍然未知的蛋白(Aldrigde P.D.et al.，Gen.Dev.，2006:20，2315-2326)。
[0009]細(xì)胞運(yùn)動性和curli菌毛表達(dá)的另一個關(guān)鍵調(diào)控子是降解二 _(3’ _5’)_環(huán)二鳥苷單磷酸(c- 二 -GMP)的磷酸二酯酶(I3DE)，例如YhjH和YciR (后者除了 c_ 二 -GMP PDE活性之外，還發(fā)揮相反方向的二鳥苷酸環(huán)化酶的功能)。已經(jīng)證明過表達(dá)C-二-GMP PDE可以通過強(qiáng)烈抑制curli菌毛的表達(dá)和生物膜基質(zhì)組分纖維素而干擾腸內(nèi)細(xì)菌的運(yùn)動性(Romling U.et al., Mol.Microbiol., 2005:57, 629-639; Jenal U.and Malone J., Annu.Rev.Genet.，2006:40, 385-407)。在特殊的實(shí)例中，YhjH顯示在運(yùn)動性中發(fā)揮正向作用(KoM.and Park C.，J.Mol.Biol.，2000:303，371-382)。
[0010]FliZ蛋白由處于fliA的直接下游的基因表達(dá),它被證明是大腸桿菌中curli菌毛形成的高強(qiáng)度抑制物，抑制方式是通過干擾控制curli表達(dá)相關(guān)基因的O s因子的活性(Pesavento C.et al.，Gen.Dev.，2011:22，2434-2446)。更具體地，只要鞭毛基因持續(xù)表達(dá)，F(xiàn)liZ便會短暫地給予運(yùn)動性(并且因此給予覓食策略)以優(yōu)先于一般的脅迫響應(yīng)的優(yōu)先性。
[0011]被修飾而減弱了 CSgBAC或/和CSgDEFG操縱子的表達(dá)(RU2338782)或被修飾而不產(chǎn)生I型菌毛粘附蛋白(EP1838726A1)的腸桿菌科細(xì)菌已被用于生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸。
[0012]而且，從W02002097089A1已知，失活或刪除了一個或多個與鞭毛構(gòu)成或鞭毛運(yùn)動相關(guān)的基因的含鞭毛微生物可以用作生產(chǎn)有用物質(zhì)(例如氨基酸)的宿主(W02002097089A1)。
[0013]目前為止，尚沒有報(bào)道強(qiáng)調(diào)關(guān)于提高細(xì)菌中參與鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)的基因(flhDC, yhjH和fIiZ)的表達(dá)對L-氨基酸，更特別是L-蘇氨酸和L-苯丙氨酸，的生產(chǎn)的有利效果。
[0014]發(fā)明的公開
[0015]本發(fā)明的方面包括提供一種屬于腸桿菌科的細(xì)菌，特別是屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬的細(xì)菌，其中增強(qiáng)了鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)基因的表達(dá)，并提供了使用所述細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸和L-苯丙氨酸的方法。該目的是通過如下的發(fā)現(xiàn)而實(shí)現(xiàn)的，即大腸桿菌中鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)基因的表達(dá)增強(qiáng)導(dǎo)致L-氨基酸的產(chǎn)生增加，這樣的基因例如flhDC操縱子基因，它們編碼DNA結(jié)合性轉(zhuǎn)錄雙調(diào)控子FlhD和FlhC，F(xiàn)lhD和FlhC是鞭毛主調(diào)控子FlhD4C2復(fù)合體的一部分。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過將flhDC操縱子基因與其它具有增強(qiáng)的表達(dá)的鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)基因如yhjH和fliZ組合使用，可以實(shí)現(xiàn)L-氨基酸生產(chǎn)的增加。
[0016]本發(fā)明的一個方面是提供一種用于生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，其中所述細(xì)菌屬于腸桿菌科，并能夠產(chǎn)生L-氨基酸，和從培養(yǎng)基收集L-氨基酸，其中細(xì)菌已經(jīng)過修飾而增強(qiáng)了鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)的至少一種基因的表達(dá)。
[0017]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述至少一種基因選自下組:flhDC操縱子基因、yhjH基因、fIiZ基因，及其組合。
[0018]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述flhDC操縱子基因的表達(dá)是通過修飾基因的表達(dá)控制區(qū)而增強(qiáng)的。
[0019]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述flhDC操縱子基因的表達(dá)是通過增加所述基因的拷貝數(shù)而增強(qiáng)的。
[0020]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌屬于埃希氏菌屬。
[0021]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌。
[0022]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌屬于腸桿菌屬。
[0023]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌屬于泛菌屬。
[0024]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中flhD基因編碼選自下組的蛋白:
[0025](A)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白；
[0026](B)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、但是其中有一個或數(shù)個氨基酸殘基進(jìn)行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根據(jù)氨基酸序列SEQ ID N0:2的DNA結(jié)合性轉(zhuǎn)錄雙調(diào)控子活性；和
[0027](C)上述的組合。
[0028]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中flhC基因編碼選自下組的蛋白:
[0029](D)包含SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的蛋白；
[0030](E)包含SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列、但是其中有一個或數(shù)個氨基酸殘基進(jìn)行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根據(jù)氨基酸序列SEQ ID N0:4的DNA結(jié)合性轉(zhuǎn)錄雙調(diào)控子活性；和
[0031](F)上述的組合。
[0032]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中yhjH基因編碼選自下組的蛋白:
[0033](G)包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的蛋白；和
[0034](H)包含SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列、但是其中有一個或數(shù)個氨基酸殘基進(jìn)行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根據(jù)氨基酸序列SEQ ID N0:6的環(huán)-二 -GMP磷酸二酯酶活性；和
[0035](I)上述的組合。
[0036]本發(fā)明的另`一個方面是提供如上所述的方法，其中fliZ基因編碼選自下組的蛋白:[0037](J)包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的蛋白；和
[0038](K)包含SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列、但是其中有一個或數(shù)個氨基酸殘基進(jìn)行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根據(jù)氨基酸序列SEQ ID N0:8的調(diào)控子活性；和
[0039](L)上述的組合。
[0040]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸是芳香族L-氨基酸。
[0041]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。 [0042]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸是非芳香族L-氨基酸。
[0043]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中非芳香族L-氨基酸是L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。
[0044]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
[0045]本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸是L-蘇氨酸。
[0046]附圖簡述
[0047]圖1是構(gòu)建kan_Ptae7DNA片段的示意圖。
[0048]圖2是構(gòu)建cat-PyhjH_yhjH DNA片段的示意圖。
[0049]圖3是構(gòu)建Cat-Ptac7DNA片段的示意圖。
[0050]發(fā)明詳細(xì)說明
[0051]下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0052]1.根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌
[0053]詞語“L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌”可以意指當(dāng)該細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，能夠產(chǎn)生L-氨基酸并造成L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累的細(xì)菌。L-氨基酸生產(chǎn)能力的意思是，當(dāng)細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌在培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生L-氨基酸、并將L-氨基酸積累到能夠從培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中收集L-氨基酸的程度的能力。術(shù)語“L-氨基酸”可以包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸。
[0054]術(shù)語“芳香族L-氨基酸”可以包括L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、和L-色氨酸。術(shù)語“非芳香族氨基酸”可以包括L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、和L-精氨酸。L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸是特別的例子。
[0055]L-氨基酸可以包括游離形式或其鹽形式的L-氨基酸，例如硫酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽、銨鹽、鈉鹽和鉀鹽。
[0056]L-氨基酸可以通過本發(fā)明的方法單獨(dú)產(chǎn)生或者作為兩種或更多種L-氨基酸的混合物產(chǎn)生。
[0057]細(xì)菌可以本身具有L-氨基酸生產(chǎn)能力或者可以如本文所述使用突變方法或DNA重組技術(shù)加以修飾而具有L-氨基酸生產(chǎn)能力。
[0058]屬于腸桿菌科的細(xì)菌可以包括來自腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、摩根氏菌屬(Morganella)、泛菌屬(Pantoea)、沙門氏菌屬(Salmonella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)等,并具有前述的L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌。具體地，可以使用可根據(jù)NCBI (美國國家生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫
[0059](www.ncb1.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)中使用的分類法分類到腸桿菌科的細(xì)菌?？梢匀绫疚乃鲞M(jìn)行修飾的腸桿菌科菌株的實(shí)例包括來自埃希氏菌屬、腸桿菌屬或泛菌屬的細(xì)菌。 [0060]可以被修飾從而獲得根據(jù)本公開主題的埃希氏菌屬細(xì)菌的埃希氏菌屬菌株沒有特別的限制，具體地說，可以使用在Neidhardt等的工作中描述的那些(Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives ofE.coli K-12, 2460-2488 頁.該文收載于 F.C.Neidhardt 等(編輯)，Ε.coli andSalmonella:cellular and molecular biology,第二 版.ASM Press, Washington, D.C.，1996)。大腸桿菌物種是一個具體實(shí)例。大腸桿菌的具體實(shí)例包括大腸桿菌W3110(ATCC27325),大腸桿菌MG1655 (ATCC47076)等，其來自于原型野生型菌株K-12。這些菌株可以從例如美國典型微生物菌種保藏中心(P.0.Boxl549, Manassas, VA20108, United States of America)獲得。也就是說,每一個菌株均有登錄號，并且這些菌株可以通過這些登錄號進(jìn)行訂購(參考冊w.atcc.0rR)0菌株的登錄號在美國典型微生物菌種保藏中心的目錄中列出。
[0061]腸桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)和產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等。泛菌屬細(xì)菌的例子包括Pantoea ananatis等等。成團(tuán)腸桿菌的一些菌株最近根據(jù)其16S rRNA的核苷酸序列分析等被重新分類為成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis 或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)?？梢允褂脤儆谀c桿菌屬或泛菌屬中任一屬的細(xì)菌，只要它是可被歸類到腸桿菌科的細(xì)菌即可。當(dāng)通過遺傳工程技術(shù)繁育Pantoea ananatis菌株時(shí),可以使用Pantoea ananatis AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356 菌株(FERM BP-6615)、AJ13601 菌株(FERM BP-7207)及其衍生物。當(dāng)這些菌株首次被分離時(shí)，它們被鑒定為成團(tuán)腸桿菌，并以成團(tuán)腸桿菌的名義保藏。然而，根據(jù)如上所述的其16S rRNA的核苷酸序列等，它們最近被重新歸類為Pantoeaananatis。
[0062]詞語“運(yùn)動性細(xì)菌”(motile bacterium)可以是單細(xì)胞細(xì)菌或浮游細(xì)菌,其在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)處于或者進(jìn)入有限生長期(definite growth phase),在合適的環(huán)境下會使用多根或單根鞭毛顯示自我推進(jìn)的運(yùn)動，但不僅限于此。具體地，可以使用在《Bergey’sManual of Systematic Bacteriology》(第二版，Springer, New York)中描述的那些。本發(fā)明中采用的詞語“運(yùn)動性細(xì)菌”還指如下的細(xì)菌，其能夠或者具有向前移動(游動)的能力，以低于、等于或高于野生型或未經(jīng)修飾的親本細(xì)菌的速度通過培養(yǎng)基。詞語“運(yùn)動性細(xì)菌”還指如下的細(xì)菌，其能夠或者有能力以運(yùn)動性單細(xì)胞或浮游狀態(tài)存在，其存在時(shí)期短于、等于或長于野生型或未經(jīng)修飾的親本細(xì)菌。[0063]本發(fā)明可以通過增強(qiáng)或增加與鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)相關(guān)的基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
[0064]詞語“與鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)相關(guān)的基因”是指任何這樣的基因，其參與鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)，并且編碼通過各種機(jī)制直接或間接參與功能性鞭毛形成和組裝，或者編碼和促進(jìn)或延長細(xì)菌能動性的蛋白。與鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)相關(guān)的基因的實(shí)例可以是，但不限于，編碼鞭毛主調(diào)控子FlhD4C2復(fù)合體的flhDC操縱子基因，該復(fù)合體對細(xì)菌鞭毛形成有積極影響。與鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)相關(guān)的基因的其它實(shí)例包括編碼C-二-GMP PDE的yhjH基因，其減少細(xì)菌中的c-d1-GMP池，和干擾O s活性的fliZ基因。
[0065]詞語“功能性鞭毛”可以指能夠進(jìn)行旋轉(zhuǎn)或其它運(yùn)動、使得細(xì)菌可被視為運(yùn)動性細(xì)菌的正確組裝的鞭毛。
[0066]詞語“鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)的至少一種基因”可以指鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)的一種或多種基因，可以包括，但不限于，flhDC操縱子基因、yhjH基因和fliZ基因的任意組
口 o
[0067]詞語“flhDC操縱子基因、yhjH基因、和fliZ基因的任意組合”可以指從flhDC操縱子基因、yhjH基因、和fIiZ基因中選出的一個基因，或者從flhDC操縱子基因、yhjH基因、和fliZ基因中選出的兩個或多個不同的基因，但不僅限于這些組合。
[0068]詞語“經(jīng)過修飾從而增強(qiáng)了鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)的至少一種基因的表達(dá)”可以指，與未經(jīng)修飾的菌株，例如野生型或親本菌株相比，每個細(xì)胞中由flhDC操縱子基因和/或yhjH基因和/或fliZ基因編碼的分子數(shù)目提高，或者由這些基因編碼的蛋白中每個分子的活性(可以稱作比活性)提高。細(xì)菌可以被修飾，從而使每個細(xì)胞中蛋白的活性提高到未經(jīng)修飾菌株中活性的150%或更高，在另一個實(shí)例中被提高到200%或更高，在另一個實(shí)例中被提高到300%或更高。作為上述比較中的參照物的未經(jīng)修飾菌株的實(shí)例，例如屬于腸桿菌科微生物的野生型菌株，包括例如大腸桿菌MG1655菌株(ATCC47076)，W3110菌株(ATCC27325), Pantoea ananatis AJ13335 菌株(FERMBP-6614)等。
`[0069]可用于增強(qiáng)這些基因或操縱子基因的表達(dá)的方法包括增加操縱子基因的拷貝數(shù)和/或?qū)⑦@些基因或操縱子基因引入到能夠增加這些基因或操縱子基因在腸桿菌科細(xì)菌中的拷貝數(shù)的載體中。為了提高這些基因的表達(dá)，可以增加細(xì)胞中所述基因的拷貝數(shù)，例如通過利用基因重組技術(shù)來實(shí)現(xiàn)?？梢酝ㄟ^將含有基因的DNA片段連接到可在宿主細(xì)菌中發(fā)揮功能的載體，例如多拷貝載體中，制成重組DNA，并將其引入到細(xì)菌內(nèi)以轉(zhuǎn)化細(xì)菌，來增加基因的拷貝數(shù)?？稍诖竽c桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體實(shí)例包括pUC19，pUC18，pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG 和 pACYC 系列載體可以從 Takara Bio Inc.獲得)，RSFlO 10，pBR322, pMW219 (pMW219 可以從 Nippon Gene C0.Ltd 獲得)，pSTV29 (可以從Takara Bio Inc.獲得)等。
[0070]基因或操縱子基因表達(dá)的增強(qiáng)還可以通過將所述基因或操縱子基因的多個拷貝導(dǎo)入細(xì)菌染色體DNA中來實(shí)現(xiàn)，例如通過同源重組、Mu整合等。同源重組可以利用在染色體DNA中以多拷貝存在的序列來實(shí)施。在染色體DNA中具有多拷貝的序列包括，但不限于，存在于可轉(zhuǎn)座元件末端的重復(fù)DNA或倒位重復(fù)序列。此外，有可能將基因或操縱子基因組入轉(zhuǎn)座子中，并讓其轉(zhuǎn)移，從而將該基因或操縱子基因的多個拷貝導(dǎo)入染色體DNA中。通過使用Mu整合，在一次操作中可以向染色體DNA中引入最多達(dá)3個基因拷貝。
[0071]增強(qiáng)基因或操縱子基因的表達(dá)還可以通過將DNA置于強(qiáng)啟動子的控制之下來實(shí)現(xiàn)。例如，Iac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、λ噬菌體的Pk或Plj啟動子是公知的強(qiáng)啟動子?？梢允褂媚軌蛟趯儆谀c桿菌科的細(xì)菌中提供高水平基因表達(dá)的強(qiáng)啟動子?；蛘撸瑔幼拥男Ч梢酝ㄟ^如下方法加以增強(qiáng)，例如在細(xì)菌染色體基因或操縱子基因的啟動子區(qū)引入突變，從而獲得更強(qiáng)的啟動子功能，因此導(dǎo)致位于啟動子下游的基因或操縱子基因的轉(zhuǎn)錄水平提高。而且，已知核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)與起始密碼子之間的間隔區(qū)內(nèi)的，特別是起始密碼子直接上游的序列中的數(shù)個核苷酸替換對mRNA的可翻譯性有深遠(yuǎn)的影響。例如，發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平有20倍的范圍波動，這取決于起始密碼子的前三個核苷酸的性質(zhì)(Gold L.et al., Annu.Rev.Microbiol., 1981:35, 365-403; Hui A.et al., EMBOJ.，1984:3, 623-629)。強(qiáng)啟動子的使用可以與基因拷貝的增加組合使用。
[0072]用于制備質(zhì)粒DNA，消化、連接和轉(zhuǎn)化DNA，選擇寡核苷酸作為引物等的方法，可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的普通方法。這些方法在例如Sambrook J., FritschE.F.and Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二 版”，ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989)中有描述。分子克隆和異源基因表達(dá)的方法在 Bernard R.Glick, Jack J.Pasternak and Cheryl L.Patten, “MolecularBiotechnology: principles and applications of recombinant DNA”，第四版，Washington, D.C: ASM Press (2009) ; Evans Jr., T.C.and Xu M.-Q., “Heterologousgene expression in E.coli，，，第一版，Humana Press (2011)中有描述。
[0073]基因的表達(dá)水平可以通過使用各種已知的方法測量從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量加以確定，所述方法包括Northern印跡、定量RT-PCR等。由基因編碼的蛋白量可以通過已知的方法進(jìn)行測量，包括SDS-PAGE，隨后進(jìn)行免疫印跡測定(Western印跡分析)等。
[0074]鞭毛形成和運(yùn)動性 級聯(lián)的基因包括選自flhDC操縱子、yhjH和fliZ基因中的基因。
[0075]flhDC操縱子包括兩個基因，即flhD和flhC。
[0076]flhD 基因編碼 DNA 結(jié)合性轉(zhuǎn)錄雙調(diào)控子 FlhD (KEGG, Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes,登錄號 N0.bl892)。flhD 基因(GenBank 登錄號 N0.NC_000913.2;核苷酸位置:1,975,871-1，976，221，互補(bǔ)物;基因ID:945442)位于大腸桿菌K-12染色體flhC和insB基因之間。flhD基因的核苷酸序列和由flhD基因編碼的FlhD蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示。
[0077]fIhC 基因編碼 DNA 結(jié)合性轉(zhuǎn)錄雙調(diào)控子 FlhC(KEGG, Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes,登錄號 N0.bl891)。f IhC 基因(GenBank 登錄號 N0.NC_000913.2;核苷酸位置:1,975, 290-1,975, 868,互補(bǔ)物;基因ID:947280)位于大腸桿菌K-12染色體motA和flhD基因之間。fIhC基因的核苷酸序列和由f IhC基因編碼的FlhC蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[0078]yhjH基因編碼環(huán)-二-GMP憐酸二酯酶YhjH(KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes,登錄號 N0.b3525)。yhjH 基因(GenBank 登錄號 N0.NC_000913.2;核苷酸位置:3,676, 443-3，677，210，互補(bǔ)物;基因ID:948042)位于大腸桿菌K-12染色體上的yhjG和kdgK基因之間。yhjH基因的核苷酸序列和由yhjH基因編碼的YhjH蛋白的氨基酸序列分別如 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 所示。
[0079]f IiZ基因編碼RpoS拮抗劑和假定的FliA活性調(diào)控子FliZ (KEGG, KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes,登錄號 N0.bl921)。fliZ 基因(GenBank 登錄號N0.NC_000913.2;核苷酸位置:1，998，497-1，999，048，互補(bǔ)物；基因 ID:946833)位于大腸桿菌上的K-12染色體fIiY和fliA基因之間。fIiZ基因的核苷酸序列和由fIiZ基因編碼的FliZ蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。
[0080]因?yàn)槟c桿菌科各屬或菌株之間DNA序列可能存在一些差異，所以染色體上要增強(qiáng)的flhDC操縱子基因和yhjH和fliZ基因分別并不僅限于SEQ ID NO: 1，3，5或7所示的基因，而可以包含與NO: 1，3，5或7同源的基因，其編碼FlhD，F(xiàn)lhC, YhjH或FliZ蛋白的變體。詞語“變體蛋白”可以指序列發(fā)生改變，可以是一個或多個氨基酸殘基的缺失、插入、添加、替換或倒位，的蛋白，但是仍然保持分別與FlhD，F(xiàn)lhC, YhjH或FliZ蛋白相似的活性。變體蛋白中的改變數(shù)目取決于在蛋白三維結(jié)構(gòu)中的位置或氨基酸殘基的類型。在一個實(shí)例中，SEQ ID N0:2，4，6或8中是1-30個，在另一個實(shí)例中是1-15個，在另一個實(shí)例中是1-5個。
[0081]一個或多個氨基酸殘基的缺失、插入、添加或替換可以是保守突變，從而使flhDC操縱子基因和yhjH和fliZ基因編碼的蛋白的活性被保持。代表性的保守突變可以是保守取代。保守取代可以是如下取代，其中如果取代位點(diǎn)是芳香族氨基酸，則取代在Phe、Trp和Tyr之間相互發(fā)生；如果取代位點(diǎn)是疏水氨基酸，則發(fā)生于Leu、Ile和Val之間；如果是極性氨基酸，則發(fā)生于Gln和Asn之間；如果是堿性氨基酸，則發(fā)生于Lys、Arg和His之間；如果是酸性氨基酸，則發(fā)生于Asp和Glu之間；如果是具有羥基的氨基酸，則發(fā)生于Ser和Thr之間。視為保守取代的具體取代實(shí)例包括Ser或Thr取代Ala ；Gln, His或Lys取代 Arg ；Glu, Gin, Lys, His 或 Asp 取代 Asn ；Asn, Glu 或 Gln 取代 Asp ；Ser 或 Ala 取代 Cys ；Asn, Glu, Lys, His, Asp 或 Arg 取代 Gln ；Gly, Asn, Gin, Lys 或 Asp 取代 Glu ；Pro 取代 Gly ；Asn, Lys, Gin, Arg 或 Tyr 取代 His ；Leu, Met, Val 或 Phe 取代 He ；Ile, Met, Val 或 Phe 取代Leu ；Asn, Glu, Gin, His 或 Arg 取代 Lys ；Ile, Leu, Val 或 Phe 取代 Met ；Trp, Tyr, Met, Ile 或Leu 取代 Phe ；Thr 或 Ala 取代 Ser ；Ser 或 Ala 取代 Thr ；Phe 或 Tyr 取代 Trp ；His, Phe 或Trp取代Tyr ；Met, Ile或Leu取代Val。如上所述的這些氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加、倒位等突變還可以包括根據(jù)具有flhDC操縱子基因和yhjH和fliZ基因(突變體或變體) 的微生物的個體差異、物種差異自然發(fā)生的突變等。
[0082]變體中的這些變化可以發(fā)生在對蛋白質(zhì)功能不關(guān)鍵的蛋白區(qū)域內(nèi)。這是因?yàn)橐恍┌被崤c另一種高度同源，以至于三維結(jié)構(gòu)或活性不會因這種改變而受到影響。因此，由flhDC操縱子的每一個基因或yhjH或fliZ基因編碼的蛋白變體與SEQ ID N0s:2，4，6或8所示的整個氨基酸序列相比可以具有不小于80%的同源性，在另一個實(shí)例中不小于90%，在另一個實(shí)例中不小于95%，在另一個實(shí)例中不小于97%，或者在另一個實(shí)例中不小于99%的同源性，只要能夠保持如上所述的FlhD或FlhC蛋白的功能性，或者由FlhD和FlhC蛋白組裝的FlhD4C2復(fù)合體的功能性，以及YhjH或FlizH蛋白的功能性即可。兩條氨基酸序列之間的同源性可以使用眾所周知的方法加以確定，例如計(jì)算機(jī)程序BLAST (基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool), www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/),其計(jì)算三種參數(shù):得分、同一性和相似度。
[0083]而且，flhDC操縱子的每一個基因和yhjH和fliZ基因可以是這樣的變體，其在嚴(yán)格條件下同與SEQ ID N0s:l，3，5或7所示序列互補(bǔ)的核苷酸序列雜交，或者在嚴(yán)格條件下同從所述核苷酸序列中制備出的探針雜交，只要它能夠編碼功能性FlhD或FlhC蛋白，或者由FlhD和FlhC蛋白組裝的FlhD4C2復(fù)合體，或在失活之前的YhjH或FlizH蛋白即可?！皣?yán)格條件”包括如下的條件，在該條件下能夠形成特異的雜交體，例如同源性不小于80%的雜交體，在另一個實(shí)例中是同源性不小于90%的雜交體，在另一個實(shí)例中是同源性不小于95%的雜交體，在另一個實(shí)例中是同源性不小于97%的雜交體，在另一個實(shí)例中是同源性不小于99%的雜交體，而不會形成非特異的雜交體,例如同源性小于上述的雜交體。例如，嚴(yán)格條件的實(shí)例可以是在1XSSC，0.1%SDS的鹽濃度下，或者在另一個實(shí)例中在0.1XSSC,0.1%sds的鹽濃度下，在60°c，或者在另一個實(shí)例中在65°C下清洗I次或者更多次，或者在另一個實(shí)例中清洗2次或3次。清洗的持續(xù)時(shí)間取決于用于印跡的膜的類型，并且，原則上應(yīng)當(dāng)是制造商所推薦的。例如，對于Amersham Hybond?-N+正電荷尼龍膜(GE Healthcare),在嚴(yán)格條件下的推薦清洗持續(xù)時(shí)間為15分鐘。清洗步驟可以執(zhí)行2-3次。作為探針，也可以使用與SEQ ID N0:1，3，5或7所示序列互補(bǔ)的序列的一部分。這類探針可以通過PCR產(chǎn)生，使用根據(jù)SEQ ID N0:1，3，5或7所示序列制備的引物，和含有該核苷酸序列的DNA片段作為模板。探針的長度推薦為>50bp ;它可以根據(jù)雜交條件合適地選出，通常為100bp-lkbp。例如，當(dāng)使用長度為大約300bp的DNA片段作為探針時(shí)，雜交后的清洗條件的實(shí)例可以為2 X SSC, 0.1%SDS，50°C或60°C，或者在另一個實(shí)例中為65°C。
[0084]因?yàn)榫幋a大腸桿菌中FlhD，F(xiàn)lhC，YhjH和FliZ蛋白的基因已經(jīng)被闡明(見上文)，所以它們以及它們的變體蛋白可以通過PCR獲得(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；參考White T.J.etal.，Trends Genet.，1989:5，185-189)，分別使用根據(jù) flhD, flhC, yhjH 和 fIiZ 基因的核苷酸序列制備的引物。其它微生物中編碼FlhD，F(xiàn)lhC, YhjH和FliZ蛋白或其突變體蛋白的基因可以用類似的方式獲得。
[0085]下面描述賦予屬于腸桿菌科的細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸，例如L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-異亮氨酸和/或L-高絲氨酸的方法，和增強(qiáng)屬于腸桿菌科的細(xì)菌的生產(chǎn)上述L-氨基酸的能力的方法。
[0086]為了賦予生產(chǎn)L-氨基酸的能力，可以使用在埃希氏菌屬的棒狀桿菌型細(xì)菌選育中通常米用的方法(見“Amino acid fermentation，，, Gakkai Shuppan Center (Ltd.)，77-100頁，第一版，1986)。這些方法包括獲得營養(yǎng)缺陷突變體、L-氨基酸類似物抗性菌株、或代謝條件突變體的性質(zhì)，或者通過構(gòu)建重組菌株，使其過表達(dá)某種L-氨基酸生物合成酶。這里，在L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌的選育中，可以賦予上述的一種或多種性質(zhì)，例如營養(yǎng)缺陷、類似物抗性和代謝調(diào)控突變。L-氨基酸生物合成酶的表達(dá)可以單獨(dú)地提高，或者是兩種或更多種組合提高。而且，賦予營養(yǎng)缺陷、類似物抗性和代謝調(diào)控突變等性質(zhì)的方法可以和增強(qiáng)生物合成酶相組合。
[0087]具有生產(chǎn)L-氨基酸能力的營養(yǎng)缺陷突變體菌株、L-氨基酸類似物抗性菌株、或代謝調(diào)控突變體菌株可以通過這樣的方式獲得:使親本或野生型菌株經(jīng)歷常規(guī)的突變，例如暴露于X射線或UV輻射，或使用突變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS)，然后從所得的突變體菌株中選出顯示營養(yǎng)缺陷、類似物抗性或代謝調(diào)控突變，同時(shí)還具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的菌株。
[0088]L-蘇氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0089]可用于衍生L-蘇氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，例如大腸桿菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美國專利N0.5，175，107，美國專利 N0.5，705，371)，大腸桿菌 472T23/pYN7 (ATCC98081)(美國專利 N0.5，631，157)，大腸桿菌NRRL-21593 (美國專利N0.5，939，307)，大腸桿菌FERM BP-3756 (美國專利N0.5,474,918)，大腸桿菌 FERM BP-3519 和 FERM BP-3520 (美國專利 N0.5,376,538)，大腸桿菌 MG442 (Gusyatiner M.et al.，Genetika (俄語)，1978:14，947-956)，大腸桿菌 VL643和 VL2055 (EPl 149911A)等。
[0090]菌株TDH-6是thrC基因缺陷的,具有鹿糖同化性(sucrose assimilability),并且ilvA基因具有滲漏突變。該菌株在rhtA基因中也有突變，其賦予對高濃度蘇氨酸或高絲氨酸的抗性。菌株B-3996包含質(zhì)粒PVIC40，其通過將包含突變thrA基因的thrA*BC操縱子插入到RSF1010衍生載體中獲得。該突變thrA基因編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I，其對蘇氨酸所致的反饋抑制基本上脫敏(美國專利N0.5，175，107)。菌株B-3996于1987年11月19日以保藏號RIA1867保藏在抗生素聯(lián)合科學(xué)中心(All-Union Scientific Centerof Antibiotics)(Russian Federation,117105Moscow, Nagatinskaya Street3_A)。該菌株還于1987年4月7日以登錄號B-3996保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(Russian Federation,117545Moscow, 1st Dorozhny proezd, I)。 [0091]大腸桿菌VKPM B-5318(EP0593792B1)也可以用作用于衍生L-蘇氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株。菌株B-5318對異亮氨酸是自養(yǎng)的，溫度敏感型入噬菌體Cl阻遏物和PR啟動子代替了質(zhì)粒PVIC40中蘇氨酸操縱子的調(diào)控區(qū)。菌株VKPM B-5318于1990年5月3日以保藏號VKPM B-5318保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collectionof Industrial Microorganisms)(VKPM)。
[0092]細(xì)菌可以被額外修飾以增強(qiáng)下述一個或多個基因(RU2275424)的表達(dá):
[0093]-突變的thrA基因，其編碼對L-蘇氨酸所致的反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶I和高絲氨酸脫氫酶I ;
[0094]-thrB基因，其編碼高絲氨酸激酶；
[0095]-thrC基因,其編碼蘇氨酸合酶；
[0096]-rhtA基因，其編碼蘇氨酸和高絲氨酸外流系統(tǒng)(一種內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)子)蛋白；
[0097]_asd基因，其編碼天冬氨酸-0 -半醛脫氫酶；和
[0098]-aspC基因，其編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。
[0099]編碼大腸桿菌天冬氨酸激酶I和高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因已經(jīng)被闡明(KEGG條目號 b0002;GenBank 登錄號 NC_000913.2;核苷酸位置:337-2, 799;基因 ID:945803) ?在大腸桿菌K-12的染色體上，thrA基因位于thrL和thrB基因之間。
[0100]編碼大腸桿菌高絲氨酸激酶的thrB基因已經(jīng)被闡明(KEGG條目號b0003; GenBank登錄號NC_000913.2;核苷酸位置:2，801-3，733;基因ID:947498)。在大腸桿菌K-12的染色體上，thrB基因位于thrA和thrC基因之間。
[0101]編碼大腸桿菌蘇氨酸合酶的thrC基因已經(jīng)被闡明(KEGG條目號b0004;GenBank登錄號NC_000913.2;核苷酸位置:3，734-5，020;基因ID: 945198)。在大腸桿菌K-12的染色體上，thrC基因位于thrB和yaaX基因之間。所有三個基因作為一個蘇氨酸操縱子thrABC發(fā)揮功能。為了增強(qiáng)蘇氨酸操縱子的表達(dá)，從操縱子除去影響轉(zhuǎn)錄的衰減子區(qū)是理想的(W02005049808A1, W02003097839A1)。[0102]編碼對L-蘇氨酸所致的反饋抑制抵抗的天冬氨酸激酶I和高絲氨酸脫氫酶I突變thrA基因，以及thrB和thrC基因可以從眾所周知的質(zhì)粒pVIC40上作為一個操縱子獲得，該質(zhì)粒存在于產(chǎn)生蘇氨酸的大腸桿菌菌株VKPMB-3996中。質(zhì)粒pVIC40在美國專利N0.5，705, 371中有詳細(xì)描述。
[0103]編碼大腸桿菌蘇氨酸和高絲氨酸外流系統(tǒng)(一種內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)子)的rhtA基因已經(jīng)被闡明(KEGG條目號 b0813;GenBank登錄號 NC_000913.2;核苷酸位置:848，433-849，320，互補(bǔ)物；基因ID:947045)。在大腸桿菌K-12的染色體上，rhtA基因位于dps和ompX基因之間，接近編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)組分的glnHPQ操縱子。rhtA基因與ybiF基因(KEGG條目號B0813)相同。
[0104]編碼大腸桿菌天冬氨酸-β -半醛脫氫酶的asd基因已經(jīng)被闡明(KEGG條目號b3433;GenBank 登錄號 NC_000913.2;核苷酸位置:3，571，798-3，572，901，互補(bǔ)物;基因ID:947939) 0在大腸桿菌K-12的染色體上，asd基因位于相同鏈上的glgB和gntU基因(相反鏈上是yhgN基因)之間。
[0105]另外，編碼大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的aspC基因已經(jīng)被闡明(KEGG條目號b0928; GenBank 登錄號 NC_000913.2;核苷酸位置:983，742-984，932，互補(bǔ)物；基因ID:945553)。在大腸桿菌K-12的染色體上，aspC基因位于相反鏈上的ycbL基因和相同鏈上的ompF基因之間。
[0106]而且，L-蘇氨酸生產(chǎn)細(xì)菌中對L-蘇氨酸合成或積累有負(fù)調(diào)控作用的酶的活性可以被降低或沒有活性。這些酶的實(shí)例包括tdh基因編碼的蘇氨酸脫氫酶等(W02009022754A1)。
[0107]大腸桿菌Β-3996Λ (ordL-narff)菌株也可以用作用于衍生L-蘇氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株。菌株Β-3996Λ (ordL-narW)被命名為AG7843，并于2010年5月21日保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms) (Russian Federation, 117545Moscow, 1st Dorozhny proezd, I),登錄號為B-10647，并且后來根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2012年7月19日將國家保藏形式轉(zhuǎn)變?yōu)閲H保藏形式。
[0108]L-賴氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0109]下面示例描述L-賴氨酸生產(chǎn)細(xì)菌和用于構(gòu)建它們的方法。
[0110]具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的菌株實(shí)例包括，例如L-賴氨酸類似物抗性菌株和代謝調(diào)控突變菌株。L-賴氨酸類似物的實(shí)例包括，但不限于，氧代賴氨酸(oxalysine)、賴氨酸異輕廂酸(lysine hydromate)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、Y-甲基賴氨酸、α _氯代己內(nèi)酰胺(α-chlorocaprolactam)等。可通過對屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌施以常規(guī)人工誘變處理，獲得對這些賴氨酸類似物有抗性的突變體菌株。L-賴氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的具體實(shí)例包括大腸桿菌AJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185,見日本特開昭56-18596和美國專利N0.4，346，170)，大腸桿菌VL611菌株(日本特開2000-189180)，等。也可以使用WC196菌株作為產(chǎn)L-賴氨酸的大腸桿菌(見國際專利公開W096/17930)。
[0111]而且，L-賴氨酸生產(chǎn)細(xì)菌還可以通過增加L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)酶的活性來構(gòu)建。這類酶的活性可以通過增加細(xì)胞中編碼該酶的基因的拷貝數(shù)，或者通過修飾其表達(dá)控制序列來增加。增加編碼`L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)的酶的基因的拷貝數(shù)和修飾其表達(dá)控制序列可以通過與后文中對gltP和gits基因所述的相同的方法來實(shí)現(xiàn)。
[0112]編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的實(shí)例包括編碼二氨基庚二酸通路的酶的基因，例如二氫吡唳二羧酸(dihydrodipicolinate)合酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(IysC)、二氫吡唳二羧酸還原酶基因(dapB), 二氨基庚二酸(diaminopimelate)脫羧酶基因(IysA)、二氨基庚二酸脫氫酶基因(ddh)(前述所有基因見W096/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(日本特開昭60-87788)，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspC)(日本特公平6-102028)，和天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd) (W000/61723),和編碼氨基己二酸(aminoadipic)途徑的酶的基因，例如高烏頭酸(homoaconitrate)水合酶基因(日本特開N0.2000-157276)。此外，細(xì)菌菌株可以具有更高表達(dá)水平的參與能量效率的基因(cyo)(歐洲專利公開1170376)，編碼煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的基因(pntAB)(美國專利N0.5,830,716),編碼具有L-賴氨酸分泌活性的蛋白的ybjE基因(W02005/073390)，編碼谷氨酰胺脫氫酶的基因(gdhA) (Gene23:199-209，1983)，或這些的隨機(jī)組合?；虻目s寫在括號中顯示。在前述基因中，ybjE基因是一個實(shí)例。
[0113]已知，來自大腸桿菌的野生型二氫吡啶二羧酸合成酶被L-賴氨酸所致的反饋抑制，并且已知來自大腸桿菌的野生型天冬氨酸激酶受到L-賴氨酸所致的阻遏和反饋抑制。因此，當(dāng)使用dapA基因和IysC基因時(shí)，可以使用編碼對L-賴氨酸所致的反饋抑制脫敏的突變酶的基因。編碼對L-賴氨酸所致的反饋抑制脫敏的突變二氫吡啶二羧酸合成酶的DNA的實(shí)例包括編碼具有如下氨基酸序列的蛋白的DNA，其中118位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基代替。編碼對L-賴氨酸所致的反饋抑制脫敏的突變天冬氨酸激酶的DNA的實(shí)例包括編碼具有如下氨基酸序列的AKIII蛋白的DNA，其中352位的蘇氨酸殘基、323位甘氨酸殘基和318位的甲硫氨酸殘基分別被異亮氨酸、天冬氨酸和異亮氨酸殘基替換(關(guān)于這些突變體，見美國專利Nos.5，661，012和6，040，160)。這些突變DNA可以使用PCR通過定點(diǎn)誘變等方法獲得。
[0114]宿主范圍寬的質(zhì)粒RSFD80、pCABl和pCABD2已知含有編碼突變二氫吡啶二羧酸合成酶的突變dapA基因和編碼突變天冬氨酸激酶的突變IysC基因(美國專利N0.6，040，160)。用這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109菌株被命名為AJ12396(美國N0.6，040, 160)，并且該菌株于1993年10月28日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)技術(shù)石開究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency ofIndustrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心(National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology,International Patent OrganismD印ositary)，保藏號為FERM P-13936，并且后來根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于1994年11月I日轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號為FERM BP-4859。RSFD80可以通過常規(guī)方法從AJ12396菌株獲得。
[0115]而且，L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌中催化導(dǎo)致從L-氨基酸生物合成通路發(fā)生分支，并產(chǎn)生另一種化合物的反應(yīng)的酶的活性可以被降低或沒有活性。另外，該細(xì)菌中對L-氨基酸合成或積累有負(fù)面影響的酶的活性可以被降低或沒有活性。這些參與L-賴氨酸生產(chǎn)的酶的實(shí)例包括高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(cadA，ldcC)、蘋果酸酶等，這些酶的活性降低或缺失的菌株在 W095/23864, W096/17930, W02005/010175 等中公開。[0116]編碼賴氨酸脫羧酶的cadA和IdcC基因的表達(dá)可以均被降低，以便降低或缺失賴氨酸脫羧酶活性。兩種基因的表達(dá)可以通過例如W02006/078039中描述的方法加以降低。
[0117]為了減少或消除酶的活性，可以通過已知的突變方法或基因重組技術(shù)在基因組上編碼這些酶的基因中引入突變，從而減少或消除細(xì)胞內(nèi)所述酶的活性。這種突變的引入可以通過，例如，利用遺傳重組消除基因組上編碼酶的基因，或者修改表達(dá)控制序列，例如啟動子或Shine-Dalgarno (SD)序列，來實(shí)現(xiàn)。還可以引入突變以賦予氨基酸取代(錯義突變)、終止密碼子(無義突變)，或移框突變，其導(dǎo)致基因組上在編碼酶的區(qū)域內(nèi)添加或缺失一個或兩個核苷酸，或者所述基因部分或完全缺失(J.Biol.Chem.,272:8611-8617，1997)。
[0118]酶活性的降低或消除還可以通過構(gòu)建編碼突變酶的基因，所述突變酶中編碼區(qū)被完全或部分缺失，并通過同源重組等用該基因代替基因組上的正?；颍蛘咄ㄟ^在基因中引入轉(zhuǎn)座子或IS因子。例如，為了通過遺傳重組引入降低或消除上述酶的活性的突變，可以使用如下方法。通過修飾目標(biāo)基因序列的一部分制備突變基因，使其不編碼能正常行使功能的酶，然后可以用含有該突變基因的DNA轉(zhuǎn)化屬于腸桿菌科的細(xì)菌，導(dǎo)致基因組上相應(yīng)的基因與突變基因重組，從而使突變的基因取代基因組上的目標(biāo)基因。這些使用同源重組進(jìn)行基因取代的實(shí)例包括使用線性DNA的方法，例如稱作Red-驅(qū)動整合(Datsenko K.A.and Wanner B.L.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000, 97:6640-6645)的方法，和將Red-驅(qū)動整合與源自于λ噬菌體的切出系統(tǒng)聯(lián)用的方法(Cho Ε.H.et al.，J.Bacteriol., 2002, 184:5200-5203)(參考 W02005/010175)，使用含有溫度敏感復(fù)制原點(diǎn)的質(zhì)粒的方法(美國專利N0.6，303，383，日本專利特開平05-007491)等。而且，這些如上所述的基于使用同源重組進(jìn)行基因取代的定點(diǎn)突變方法還可以使用不能在宿主體內(nèi)復(fù)制的質(zhì)粒來實(shí)施。
[0119]L-賴氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的實(shí)例包括大腸桿菌WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2菌株(W02006/078039)。該菌株的構(gòu)建是通過將含有賴氨酸生物合成基因的質(zhì)粒pCABD2 (美國專利N0.6, 040, 160)引入到cadA和IdcC基因被打斷的WC196菌株中，這兩個基因編碼賴氨酸脫羧酶。WC196菌株是從衍生自大腸桿菌K-12的W3110菌株選育而得，其中用編碼突變體天冬氨酸激酶III的突變IysC基因取代了 W3110菌株染色體上的野生型IysC基因，該突變體天冬氨酸激酶III中352位蘇氨酸被異亮氨酸代替，導(dǎo)致對L-賴氨酸所致的反饋抑制脫`敏(美國專利N0.5，661，012)，并使賦予所得的菌株AEC抗性(美國專利N0.5，827，698)。WC196菌株被命名為大腸桿菌AJ13069，于1994年12月6日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)技術(shù)研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technologyj Agency of Industrial Science andTechnology)(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心)(independentadministrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology, International Patent Organism Depositary)地址日本茨城縣筑波市東一丁目1-1，筑波中央第6，305-8566)，保藏號為FERM P-14690。之后其于1995年9月29日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號為FERM BP-5252(美國專利N0.5，827，698)。WC196 Δ cadA Δ IdcC菌株自身也是一個示例性L-賴氨酸生產(chǎn)細(xì)菌。WC196 Δ cadA Δ IdcC被命名為AJl 10692，于2008年10月7日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)技術(shù)研究所(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心)(地址日本茨城縣筑波市東一丁目1-1，筑波中央第6,305-8566))，作為國際保藏，保藏號為FERM BP-11027。
[0120]質(zhì)粒PCABD2含有一個來自大腸桿菌的突變dapA基因，其編碼二氫吡啶二羧酸合酶(DDPS)并具有一個用于對L-賴氨酸所致的反饋抑制脫敏的突變，一個來自大腸桿菌的突變IysC基因，其編碼天冬氨酸激酶III并具有一個用于對L-賴氨酸所致的反饋抑制脫敏的突變，一個來自大腸桿菌的dapB基因，其編碼二氫吡啶二羧酸還原酶，和來自乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium Iactofermentum)的ddh基因，其編碼二氨基庚二酸脫氫酶。
[0121]L-半胱氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0122]用于衍生L-半胱氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，例如大腸桿菌JM15，其用編碼抗反饋抑制的絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰基酶的不同cysE等位基因轉(zhuǎn)化而得(美國專利N0.6，218，168，俄羅斯專利申請2003121601);大腸桿菌W3110，其過表達(dá)編碼適合于分泌對細(xì)胞有毒物質(zhì)的蛋白的基因(美國專利N0.5，972，663);具有低活性半胱氨酸脫巰基酶的大腸桿菌菌株(JP11155571A2);大腸桿菌W3110，其具有活性增加的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，用于調(diào)控由cysB基因編碼的半胱氨酸調(diào)控子(W00127307A1);等。
[0123]L-亮氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0124]用于衍生L-亮氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，例如對亮氨酸耐受的大腸桿菌菌株(例如菌株57(VKPMB-7386，美國專利N0.6，124，121))或?qū)α涟彼犷愃莆锇?6-2-噻吩丙氨酸、3-羥基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸耐受的大腸桿菌菌株(JP62-34397B和JP8-70879A);通過W096/06926中所述基因工程方法獲得的大腸桿菌菌株；大腸桿菌H-9068(JP8-70879A)等。
[0125]細(xì)菌可以通過增強(qiáng) 一種或多種參與L-亮氨酸生物合成的基因的表達(dá)加以改良。實(shí)例包括IeuABCD操縱子基因，其代表是突變的IeuA基因，該基因編碼不被L-賴氨酸反饋抑制的異丙基蘋果酸合酶(美國專利6，403，342)。此外，細(xì)菌可以通過增強(qiáng)一種或多種編碼將L-氨基酸分泌出細(xì)菌細(xì)胞的蛋白的基因的表達(dá)進(jìn)行改良。這些基因的實(shí)例包括b2682和 b2683 基因(ygaZH 基因)(EP1239041A2)。
[0126]L-組氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0127]用于衍生L-組氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，例如大腸桿菌菌株24 (VKPM B-5945, RU2003677);大腸桿菌菌株80 (VKPMB-7270, RU2119536);大腸桿菌 NRRL B-12116 - B12121 (美國專利 N0.4，388，405);大腸桿M H-9342 (FERM BP-6675)和 H-9343 (FERM BP-6676)(美國專利 N0.6，344，347);大腸桿菌H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087);大腸桿菌AI80/pFM201 (美國專利N0.6，258，554)等。
[0128]用于衍生L-組氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例還包括如下菌株，其中一種或多種編碼L-組氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)被增強(qiáng)。這些基因的實(shí)例包括編碼如下蛋白的基因:ATP磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hisG)，磷酸核糖AMP環(huán)化水解酶(hisl)，磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶(hisIE),磷酸核糖亞胺甲基-5-氨基咪唑甲酰胺核糖異構(gòu)酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase) (hisA),氨基轉(zhuǎn)移酶(hisH)、組氨醇磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(hisC)、組氨醇磷酸酶(hisB)，組氨醇脫氫酶(hisD)等。
[0129]已知由hisG和hisBHAFI編碼的L-組氨酸生物合成酶被L-組氨酸抑制，因此還可以通過在ATP磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶中引入對反饋抑制提供抵抗的突變來高效地增強(qiáng)L-組氨酸的生產(chǎn)能力(俄羅斯專利Nos.2003677和2119536)。[0130]具有產(chǎn)L-組氨酸的能力的菌株的具體實(shí)例包括大腸桿菌FERM-P5038和5048，它們中引入了攜帶編碼L-組氨酸生物合成酶的DNA的載體(JP56-005099A)，引入了用于氨基酸外排的rht基因的大腸桿菌菌株(EP1016710A)，被賦予了對磺胺脒、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸、和鏈霉素的抗性的大腸桿菌80菌株(VKPM B-7270,俄羅斯專利N0.2119536)，等。
[0131]L-谷氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0132]用于衍生L-谷氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株,例如大腸桿菌禮334訪1~(:+出？1172433)。大腸桿菌VL334 (VKPM B-1641)是一種L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷菌株，在thrC和ilvA基因(美國專利N0.4，278，765)中具有突變。thrC基因的野生型等位基因通過使用在野生型大腸桿菌菌株K12(VKPM B-7)細(xì)胞上生長的噬菌體Pl進(jìn)行的一般轉(zhuǎn)導(dǎo)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)移。結(jié)果，獲得了 L-亮氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)，其能夠產(chǎn)生 L-谷氨酸。
[0133]用于衍生L-谷氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株包括，但不限于，其中一種或多種編碼L-谷氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)被增強(qiáng)的菌株。這些基因的實(shí)例包括編碼下列酶的基因:谷氨酸脫氫酶(gdhA)，谷氨酰胺合成酶(glnA)，谷氨酸合成酶(gltAB)，異檸檬酸脫氫酶(icdA),烏頭酸水合酶(acnA, acnB),檸檬酸合酶(gltA),磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc),丙酮酸羧化酶(Pyc),丙酮酸脫氫酶(aceEF, IpdA),丙酮酸激酶(pykA, pykF),磷酸烯醇丙酮酸合酶(PPsA),烯醇化酶(eno),磷酸甘油酸變位酶(pgmA, pgml),磷酸甘油酸激酶(Pgk),甘油醒3-磷酸脫氫酶(gapA),磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpiA),果糖二磷酸醒縮酶(fbp),磷酸果糖激酶(pfkA, pfkB),和葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(pgi)。
[0134]被修飾從而增強(qiáng)了檸檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、和/或谷氨酸脫氫酶基因的表達(dá)的菌株實(shí)例包括在EP1078989B1，EP955368B1，和EP952221B1中公開的菌株。
[0135]用于衍生L-谷氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株還包括如下菌株，其中催化從L-谷氨酸生物合成通路分支合成L-谷氨酸之外的化合物的酶的活性被降低或消除。這些酶的實(shí)例包括異檸檬酸裂解酶(aCeA)，？a-酮戊二酸脫氫酶(sucA)，磷酸轉(zhuǎn)乙?；?pta)，乙酸激酶(ack)，乙酰羥酸合酶(ilvG)，乙酰乳酸合酶(ilvl)，甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(Pfl)，乳酸脫氫酶(Idh)，和谷氨酸脫羧酶(gadAB)。屬于埃希氏菌屬且a-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的細(xì)菌以及用于獲得它們的方法在美國專利Nos.5，378，616和5，573，945中有描述。具體地，這些菌株包括如下:
[0136]大腸桿菌W3110sucA::KmR
[0137]大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853)
[0138]大腸桿菌AJ12628(FERM BP-3854)
[0139]大腸桿菌AJ12949(FERM BP-4881)
[0140]大腸桿菌W3110suCA::KmK是通過打斷大腸桿菌W3110的a -酮戊二酸脫氫酶基因(下文稱作“sucA基因”)獲得的菌株。該菌株是a-酮戊二酸脫氫酶完全缺陷的。
[0141]L-谷氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的其它實(shí)例包括屬于埃希氏菌屬并對天冬氨酸抗代謝物耐受的細(xì)菌。這些菌株也可以是a-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷型，并且包括例如大腸桿菌AJ13199 (FERM BP-5807)(美國專利 N0.5，908，768)，F(xiàn)FRM P-12379,其額外具有低 L-谷氨酸分解能力(美國專利 N0.5，393,671) ; AJ13138 (FERM BP-5565)(美國專利 N0.6，110, 714)等
[0142]L-谷氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的實(shí)例包括屬于泛菌屬的突變菌株，其是α-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷型或者α-酮戊二酸脫氫酶活性降低，并可以如上所述地獲得。這些菌株包括 Pantoea ananatis (Pantoea ananatis) AJl3356 (美國專利 N0.6，33I, 4I9)。Pantoeaananatis AJ13356于1998年2月19日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)技術(shù)研究所(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心)(地址日本茨城縣筑波市東一丁目1-1，筑波中央第6，305-8566)，保藏號為FERM P-16645，并且后來根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于1999年I月11日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號為FERM BP-6615。Pantoea ananatis AJ13356 由于打斷了 a KGDH-E1 亞單位基因(sucA)導(dǎo)致α-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷。當(dāng)上述菌株被分離時(shí)曾被鑒定為成團(tuán)腸桿菌，并以成團(tuán)腸桿菌AJ13356的名義保藏。然而，最近根據(jù)16S rRNA的核苷酸序列等，它被重新歸類為Pantoea ananatis。盡管AJ13356在前述保藏時(shí)是作為成團(tuán)腸桿菌保藏的,但是為本專利說明書的目的，它們被作為Pantoea ananatis描述。
[0143]L-苯丙氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0144]用于衍生L-苯丙氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，例如大腸桿菌AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197);包含突變的pheA34基因的大腸桿菌HW1089 (ATCC55371)(美國專利N0.5，354，672);大腸桿菌 MWEC101-b(KR8903681);大腸桿菌 NRRL B_12141，NRRL B-12145, NRRL B-12146和NRRL 8-12147(美國專利如.4，407，952)。另外，作為親本菌株，可以使用大腸桿菌 K-12[W3110(tyrA)/pPHAB(FERM BP-3566)，大腸桿菌 K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659),大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)和大腸桿菌 K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB]，其被命名為 AJ12604(FERM BP-3579)(EP488424B1)。而且，也可以使用屬于埃希氏菌屬且由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白的活性增強(qiáng)的產(chǎn)L-苯丙氨酸細(xì)菌(美國專利申請2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
[0145]L-色氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0146]用于衍生L-色氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，例如大腸桿菌 JP4735/pMU3028 (DSM10122)和 JP6015/pMU91 (DSM10123)，其是由突變trpS基因編碼的色氨酰-tRNA合成酶缺陷型(美國專利N0.5，756，345)；大腸桿菌SV164(pGH5)，其具有編碼不被絲氨酸反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫酶的serA等位基因和編碼不被色氨酸反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合成酶的trpE等位基因(美國專利 N0.6，180, 373);大腸桿菌 AGX17(pGX44) (NRRL B-12263)和 AGX6 (pGX50) aroP (NRRLB-12264)，其色氨酸酶缺陷(美國專利N0.4，371，614);大腸桿菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps，其中磷酸烯醇丙酮酸生產(chǎn)能力增強(qiáng)(W09708333，美國專利N0.6，319，696)等。也可以使用屬于埃希氏菌屬并且yedA基因或yddG基因所編碼的特定蛋白的活性提高的產(chǎn)色氨酸細(xì)菌(美國專利申請2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
[0147]用于衍生L-色氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例還包括其中一種或多種選自下組的酶的活性被增強(qiáng)的菌株:鄰氨基苯甲酸合成酶、磷酸甘油酸脫氫酶、和色氨酸合酶。鄰氨基苯甲酸合成酶和磷酸甘油酸脫氫酶均被L-色氨酸和L-絲氨酸反饋抑制，因此可以在這些酶中引入導(dǎo)致對該反饋抑制脫敏的突變。具有這種突變的菌株的具體實(shí)例包括大腸桿菌SV164，其包含脫敏的鄰氨基苯甲酸合成酶，和通過向大腸桿菌SV164引入質(zhì)粒pGH5獲得的轉(zhuǎn)化菌株(W094/08031)，其含有編碼反饋脫敏的磷酸烯醇丙酮酸脫氫酶的突變serA基因。
[0148]用于衍生L-色氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例還包括如下菌株，其中已引入了含有編碼脫敏的鄰氨基苯甲酸合成酶基因的色氨酸操縱子(JP57-71397A，JP62-244382A,美國專利N0.4，371，614)。而且，可以增強(qiáng)色氨酸操縱子(trpBA)中編碼色氨酸合成酶的基因的表達(dá)，來賦予生產(chǎn)L-色氨酸的能力。色氨酸合成酶由a和P亞基構(gòu)成，其分別由trpA和trpB基因編碼。此外，可以通過增強(qiáng)異檸檬酸裂解酶_蘋果酸合酶操縱子的表達(dá)來改善生產(chǎn)L-色氨酸的能力(W02005/103275)。
[0149]L-脯氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0150]用于衍生L-脯氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌，例如大腸桿菌702i IvA (VKPM B-8012)，其是i IvA基因缺陷的并能夠產(chǎn)生L-脯氨酸(EP1172433)?？梢酝ㄟ^提高一種或多種參與L-脯氨酸生物合成的基因的表達(dá)對細(xì)菌進(jìn)行改良。這些用于產(chǎn)L-脯氨酸的細(xì)菌的基因的實(shí)例包括proB基因，其編碼對L-脯氨酸的反饋抑制脫敏的谷氨酸激酶(DE專利3127361)。此外，可以通過提高一種或多種編碼將L-氨基酸從細(xì)菌細(xì)胞外泌的蛋白的基因的表達(dá)對細(xì)胞進(jìn)行改良。這些基因的實(shí)例是b2682和 b2683 基因(ygaZH 基因)(EP1239041A2)。
[0151]屬于埃希氏菌屬并具有產(chǎn)生L-脯氨酸的能力的細(xì)菌實(shí)例包括如下大腸桿菌菌株:NRRL B-12403 和 NRRL B-12404 (GB 專利 2075056)，VKPM B-8012 (俄羅斯專利申請2000124295),在 DE 專利 312 7361 中描述的質(zhì)粒突變體，在 Bloom F.R.等(The15th Miamiwinter symposium, 1983,第34頁)中描述的質(zhì)粒突變體，等。
[0152]L-精氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0153]用于衍生L-精氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌，例如大腸桿菌菌株237 (VKPM B-7925)(美國專利申請2002/058315A1)及其帶有突變N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(俄羅斯專利申請N0.2001112869);大腸桿菌菌株382 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)，一種其中引入了編碼N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因的精氨酸生產(chǎn)菌株(EP1170361A1)，等等。
[0154]用于衍生L-精氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例還包括如下菌株，其中一種或多種編碼L-精氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)被提高。這些基因的實(shí)例包括編碼如下蛋白的基因:N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(argC)，鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(argj)，N-乙酰谷氨酸激酶(argB),乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(argD),鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(argF),精氨琥拍酸合成酶(argG),精氨酸酶(argH),和氨甲酰磷酸合成酶(carAB)。
[0155]L-纈氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0156]用于衍生L-纈氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括，但不限于，已被修飾而過表達(dá)ilvGMEDA操縱子的菌株(美國專利N0.5，998，178)。最好除去ilvGMEDA操縱子中為衰減作用所需要的區(qū)域，使得操縱子的表達(dá)不會被所產(chǎn)生的L-纈氨酸所衰減。而且，最好打斷操縱子中的ilvA基因，以降低蘇氨酸脫氨酶活性。
[0157]用于衍生L-纈氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例還包括具有氨基-乙酰t-RNA合成酶突變的突變體(美國專利N0.5，658，766)。例如，可以使用大腸桿菌VL1970，其在編碼異亮氨酸t(yī)RNA合成酶的ileS基因中具有突變。大腸桿菌VL1970于1988年6月24日被保藏于俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms) (Russion Federation, 117545Moscow, 1st Dorozhny proezd, I),保藏號為VKPM B-4411。而且，也可以使用需要類脂酸維持生長和/或缺少H+-ATP酶的突變體作為親本菌株(W096/06926)。
[0158]L-異亮氨酸生產(chǎn)細(xì)菌
[0159]用于衍生L-異亮氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括，但不限于，對6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突變體(JP5-304969A)，對異亮氨酸類似物如硫代異亮氨酸和異亮氨酸輕I虧酸(isoleucine hydroxamate)有抗性的突變體，和額外具有對DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸輕廂酸(arginine hydroxamate)抗性的突變體(JP5-130882A)。此外，也可以使用用編碼參與L-異亮氨酸生物合成的蛋白(例如蘇氨酸脫氨酶和乙酰羥酸合成酶)的基因轉(zhuǎn)化的重組菌株作為親本菌株(JP2-458A，F(xiàn)R0356739，和美國專利N0.5，998，178)。
[0160]2.根據(jù)本發(fā)明的方法
[0161]本發(fā)明的方法是通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌以產(chǎn)生L-氨基酸并將其分泌到培養(yǎng)基中，和從培養(yǎng)基收集L-氨基酸，來生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
[0162]從培養(yǎng)基等培養(yǎng)、收集和純化L-氨基酸等可以用與用細(xì)菌產(chǎn)生氨基酸的常規(guī)發(fā)酵方法相似的方式事實(shí)。
[0163]用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以是合成的或天然培養(yǎng)基，只要該培養(yǎng)基包含細(xì)菌生長所需的碳源和氮源和礦物質(zhì)，以及如果必需的話，合適量的營養(yǎng)物質(zhì)。碳源可以包括各種碳水化合物，例如葡萄糖和蔗糖，和各種有機(jī)酸。根據(jù)所選擇的微生物的同化模式，可以使用醇，包括乙醇和甘油。作為氮源，可以使用各種銨鹽，例如氨和硫酸銨，其它氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨、大豆水解物和經(jīng)過消化的發(fā)酵微生物。作為礦物質(zhì)，可以使用磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、氯化鈣等。作為維生素，可以使用硫胺素、酵母提取物等。
`[0164]培養(yǎng)可以在有氧條件下實(shí)施，例如通風(fēng)振蕩培養(yǎng)和攪拌培養(yǎng)，溫度為20_40°C，或30-38°C。培養(yǎng)物的pH通常為5-9，或者6.5-7.2。培養(yǎng)物的pH可以用氨、碳酸鈣、各種酸、各種堿、和緩沖液進(jìn)行調(diào)控。通常培養(yǎng)1-5天可以在液體培養(yǎng)基內(nèi)積累靶L-氨基酸。
[0165]培養(yǎng)之后，可通過離心或膜過濾從液體介質(zhì)中除去固體如細(xì)胞，然后可收集L-氨基酸，并通過濃縮、和/或結(jié)晶方法，和/或各種色譜方法進(jìn)行純化。
[0166]所收集的L-氨基酸組合物中除了 L-氨基酸之外，還可能含有細(xì)菌細(xì)胞、培養(yǎng)基組分、水分和微生物的代謝副產(chǎn)品。所收集的L-氨基酸的純度可以是例如50%或更高，85%或更高，或者甚至95%或更高(美國專利N0.5，431，933，日本專利公開N0.1-214636，美國專利 Nos.4，956，471，4，777，051，4，946，654，5，840，358，6，238，714，美國專利申請公開N0.2005/0025878)。
[0167]而且，當(dāng)L-氨基酸沉淀在培養(yǎng)基中時(shí)，可以通過離心、過濾或類似方法進(jìn)行收集。沉淀在培養(yǎng)基中的L-氨基酸和溶解在培養(yǎng)基中的L-氨基酸可以在將溶解在培養(yǎng)基中的L-氨基酸結(jié)晶之后一起分離。
實(shí)施例[0168]通過參考下面的非限制性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更確切的說明。
[0169]實(shí)施例1:大腸桿菌 MG1655:: A tdh, rhtA*, Ptac7flhDC 菌株的構(gòu)建
[0170]大腸桿菌MG1655:: Atdh，rhtA*，Ptae7flhDC菌株通過用來自Pta。啟動子的啟動子Ptae7替換菌株MG1655:: A tdh，rhtA*中flhDC操縱子的天然啟動子區(qū)而獲得(圖1)。Ptae7啟動子在LacI結(jié)合位點(diǎn)區(qū)帶有C-核苷酸刪除(ATG密碼子上游第23位)，從而消除了Lac1-依賴性的阻遏。
[0171]為了替換flhDC操縱子的天然啟動子區(qū)，將攜帶Ptae7啟動子和由kan基因編碼的卡那霉素抗性標(biāo)記(KmE)的DNA片段通過Datsenko K.A.和Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000，97:6640-6645)所述的方法(也稱“Red介導(dǎo)的整合”和/或“Red驅(qū)動的整合)整合到大腸桿菌MG1655:: Atdh，rhtA*菌株染色體上并代替天然的啟動子區(qū)。菌株MG1655:: Atdh, rhtA*是如俄羅斯專利N0.2364628C2和W02009022754A1中詳細(xì)描述的那樣構(gòu)建的。使用具有溫度敏感性復(fù)制子的重組質(zhì)粒pKD46 (Datsenko K.A.and WannerB.L.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000，97:6640-6645)作為負(fù)責(zé) Red-介導(dǎo)重組系統(tǒng)的噬菌體入-衍生基因的供體。含有重組質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌菌株BW25113可以從耶魯大學(xué)大腸桿菌遺傳資源中心(E.Coli Genetic Stock Center, Yale University)(地址 NewHaven, USA)獲得，保藏號為CGSC7630。在質(zhì)粒pKD46整合到大腸桿菌MG1655:: Atdh, rhtA*菌株之后，獲得了 菌株 MG1655:: A tdh, rhtA*/pKD46。
[0172]Ptac7啟動子片段通過PCR獲得，使用可商購的質(zhì)粒pKK223-3 ( “Pharmacia”)作為模板，和引物Pl (SEQ ID NO:9)和P2(SEQ ID N0:10)。引物Pl含有與進(jìn)一步與Ptae7啟動子連接所需的kan基因的5’-區(qū)同源的21個核苷酸。引物P2含有與進(jìn)一步整合到細(xì)菌染色體內(nèi)所需的flhD基因的 5’ -區(qū)同源的40個核苷酸。此外，P2在LacI結(jié)合位點(diǎn)區(qū)帶有C-核苷酸(ATG密碼子上游第23位)刪除。
[0173]含有由kan基因編碼的Khik標(biāo)記的DNA片段通過PCR獲得，使用可商購的質(zhì)粒PACYC177 (GenBank 保藏號 X06402, “Fermentas”, Lithuania)作為模板，和引物 P3 (SEQ IDNO: 11)和P4(SEQ ID N0:12)。引物P3含有與進(jìn)一步整合進(jìn)入細(xì)菌染色體所需的flhD基因的起始密碼子上游188bp的區(qū)域同源的41個核苷酸。引物P4含有與進(jìn)一步與kan基因連接所需的Ptac;7啟動子的5’ -區(qū)同源的21個核苷酸。
[0174]PCR 使用 “GeneAmp PCR System2700” 熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)來進(jìn)行。反應(yīng)混合物總體積為50 iil，由5 ill含有25mM MgCl2的IOx PCR緩沖液(“Fermentas”，Lithuania)，200 u M 每種 dNTP, 25pmol 每種引物和 IUTaq-聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)構(gòu)成。向反應(yīng)混合物添加大約5ng質(zhì)粒DNA作為PCR擴(kuò)增的模板DNA。溫度曲線如下:最初在95°C變性5min，隨后25個如下的循環(huán):95°C變性30秒，54 °C退火30秒，和72°C延伸20秒(對啟動子Ptae7)或50秒(對kan基因)；最終在72° C延伸5min。然后，通過瓊脂糖凝膠電泳純化擴(kuò)增的DNA片段，用“GenElute SpinColumns” ( “Sigma”，USA)提取,并用乙醇沉淀。
[0175]DNA片段通過重疊PCR獲得，使用兩種上述DNA片段和引物P1(SEQID NO:9)和P4(SEQ ID NO: 12)實(shí)現(xiàn)DNA片段重疊和擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳純化擴(kuò)增出的kan-Ptae7DNA 片段，用“GenElute Spin Columns”( “Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。用所得的DNA片段進(jìn)行電穿孔和Red-介導(dǎo)的整合導(dǎo)入到大腸桿菌MG1655:: A tdh, rhtA*/PKD46的細(xì)菌染色體中。
[0176]將MG1655:: A tdh, rhtA*/pKD46細(xì)胞在添加有氨芐青霉素(100 y g/ml)的液體LB培養(yǎng)基中30° C培養(yǎng)過夜，然后用添加有氨芐青霉素(IOOii g/ml)和L-阿拉伯糖(IOmM)的 SOB 培養(yǎng)基(酵母提取物，5g/l;NaCl，0.5g/l;胰蛋白胨，20g/l ;KC1，2.5mM;MgCl2, IOmM)(Datsenko K.A.and Wanner B.L., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000, 97:6640-6645)以1:100稀釋，并在30° C培養(yǎng)達(dá)到細(xì)菌培養(yǎng)物光密度00_為0.4-0.7。將來自IOml細(xì)菌培養(yǎng)物的經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞用冰冷的去離子水清洗3次，隨后懸浮在100 ill水中。向細(xì)胞懸浮物中添加10 u I溶解在去離子水中的DNA片段(IOOng)。用“Bio-Rad”電穿孔儀(USA)(N0.165-2098，version2_89)根據(jù)制造商的說明進(jìn)行電穿孔。
[0177]向 Iml SOC 培養(yǎng)基(Sambrook et al, “Molecular Cloning A LaboratoryManual, 2nd ed.，，，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))中加入經(jīng)熱激的細(xì)胞，在37°C溫育2小時(shí),然后涂布到含有20 u g/ml卡那霉素的L-瓊脂上。 [0178]對于24h內(nèi)長出的克隆，用引物P5(SEQ ID NO: 13)和P6 (SEQ ID N0:14)進(jìn)行PCR，來測試其中替換flhDC操縱子的天然啟動子區(qū)的KmK標(biāo)記的存在。為此目的，將新鮮分離的克隆懸浮在20 Ul水中，然后使用I U I所得懸液用于PCR。溫度曲線如下:最初在95°C進(jìn)行DNA變性5min，隨后30個如下的循環(huán):95°C變性30秒，55°C退火30秒，和72 °C延伸1.5min ;和最終在72° C延伸5min。測試的少數(shù)KmK克隆含有期望的1460bp DNA片段，驗(yàn)證了替換flhDC操縱子的天然840bp啟動子區(qū)的Khik標(biāo)記DNA的存在(圖1)。對所得菌株中的一個通過在37°C下培養(yǎng)脫除熱敏感質(zhì)粒PKD46，得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655:: A tdh, rhtA*, Ptac7flhDC。
[0179]實(shí)施例2:通過大腸桿菌MG1655:: A tdh, rhtA*, Ptac7flhDC菌株生產(chǎn)L-蘇氨酸
[0180]用質(zhì)粒pVIC40 (W09004636A1,美國專利N0.5，705，371)分別轉(zhuǎn)化親本菌株MG1655:: Atdh, rhtA* 和 MG1655:: Atdh, rhtA*, Ptac7f lhDC。將所得菌株在營養(yǎng)肉湯中 37°C培養(yǎng)18個小時(shí)，然后將0.1ml的每種所得培養(yǎng)物接種在置于20x200mm試管內(nèi)的2ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上37°C培養(yǎng)24和48小時(shí)。
[0181]發(fā)酵培養(yǎng)基中含有(g/1):
[0182]
葡萄糖40
NaCI0,8
(NH4)2SO422
K2HPO42.0
MgSO4-TH2O0.8
MnS04-5H200.02
[0183]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，其中所述細(xì)菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)并且能夠產(chǎn)生L-氨基酸,并從所述培養(yǎng)基收集L-氨基酸,其中該細(xì)菌已經(jīng)過修飾而增強(qiáng)了鞭毛形成和運(yùn)動性級聯(lián)的至少一種基因的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種基因選自下組:fIhDC操縱子基因、yhjH基因和fliZ基因，以及其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述基因的表達(dá)是通過修飾所述基因的表達(dá)控制區(qū)而增強(qiáng)的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述基因的表達(dá)是通過增加所述基因的拷貝數(shù)而增強(qiáng)的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌屬于埃希氏菌屬(Escherichia)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中所述細(xì)菌是大腸桿菌(Escherichiacoli)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌屬于腸桿菌屬(Enterobacter)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌屬于泛菌屬(Pantoea)。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述flhD基因編碼選自下組的蛋白: (A)包含SEQID N0:2所示的氨基酸序列的蛋白； (B)包含SEQID N0:2所示的氨基酸序列，但其中有一個或數(shù)個氨基酸殘基進(jìn)行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根據(jù)氨基酸序列SEQ ID N0:2的DNA結(jié)合性轉(zhuǎn)錄雙調(diào)控子活性；和 (C)上述的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述flhC基因編碼選自下組的蛋白: (D)包含SEQID N0:4所示的氨基酸序列的蛋白； (E)包含SEQID N0:4所示的氨基酸序列，但其中有一個或數(shù)個氨基酸殘基進(jìn)行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根據(jù)氨基酸序列SEQ ID N0:4的DNA結(jié)合性轉(zhuǎn)錄雙調(diào)控子活性；和 (F)上述的組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述yhjH基因編碼選自下組的蛋白: (G)包含SEQID N0:6所示的氨基酸序列的蛋白；和 (H)包含SEQID N0:6所示的氨基酸序列，但其中有一個或數(shù)個氨基酸殘基進(jìn)行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根據(jù)氨基酸序列SEQ ID N0:6的環(huán)-二 -GMP磷酸二酯酶活性；和 (I)上述的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述fliZ基因編碼選自下組的蛋白: (J)包含SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列的蛋白；和 (K)包含SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列，但其中有一個或數(shù)個氨基酸殘基進(jìn)行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根據(jù)氨基酸序列SEQ ID N0:8的調(diào)控子活性；和 (L) 上述的組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述L-氨基酸是芳香族L-氨基酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述L-氨基酸是非芳香族L-氨基酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述非芳香族L-氨基酸是L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或13的方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或15`的方法，其中所述L-氨基酸是L-蘇氨酸。
【文檔編號】C12P13/04GK103732736SQ201280040251
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月18日
【發(fā)明者】I.B.阿爾特曼, T.A.亞姆珀?duì)査箍▼I, L.R.普迪特辛 申請人:味之素株式會社