專利名稱：：含有松馳素基因的基因送遞系統(tǒng)和使用松馳素的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的基因送遞系統(tǒng)和重組腺病毒，具體而言，本發(fā)明涉及一種新的基因送遞系統(tǒng)和包括松弛素編碼序列的重組腺病毒、一種包括該重組腺病毒的藥學(xué)抗腫瘤組合物、一種特征為改善組織穿透能力的藥物組合物和一種用于治療與過量細(xì)胞外基質(zhì)累積相關(guān)的疾病或病癥的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：基因治療旨在通過將外源基因引入細(xì)胞或組織治療病理狀況。對于如鐮形細(xì)胞貧血、α1抗胰蛋白酶缺乏、苯丙酮尿癥、血友病和囊性纖維化的遺傳性疾病，基因治療的目的是為了使細(xì)胞或組織發(fā)揮正常功能，置換缺失或缺陷基因。此外，基因治療用于除去異常細(xì)胞。通過送遞能夠引起靶異常細(xì)胞死亡的基因，基因治療允許治療如癌癥、發(fā)炎和自身免疫疾病的多種疾病。雖然基因治療有前途，但是向細(xì)胞或組織無效的基因送遞是發(fā)展成功的基因治療的主要障礙。例如，許多使用反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或腺伴隨病毒(adeno-associatedviruses，AAV)的基因送遞的研究已表明當(dāng)用于個體或組織(例如，腫瘤組織)時，基因送遞效率不足阻礙了基因治療的應(yīng)用。因此，表現(xiàn)改善的基因送遞效率的新的基因送遞策略對于實(shí)現(xiàn)成功的基因治療仍是必需的。早期基于腺病毒的基因治療通常使用缺失對于腺病毒復(fù)制必需的E1基因的攜帶治療基因的復(fù)制缺陷型腺病毒。然而，這些重組腺病毒僅在受感染細(xì)胞和很少量的周圍細(xì)胞中誘導(dǎo)抗腫瘤活性，在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出嚴(yán)重的問題。為了克服此類問題，已開發(fā)在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制的溶瘤腺病毒，ONYX-015(dl1520)。缺失E1B55kDa基因的腺病毒在缺乏功能性p53的腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制。當(dāng)重組腺病毒感染正常細(xì)胞時，因?yàn)闆]有誘導(dǎo)p53失活，所以其增殖受到抑制，導(dǎo)致溶瘤作用失敗，而其在具有失活的p53的腫瘤細(xì)胞中活躍地增殖并最終引起腫瘤細(xì)胞的選擇性死亡(Chang，F(xiàn).，等，JClinOncol131009-22(1995))。根據(jù)腦癌的II/III期臨床試驗(yàn)的最近報道，腫瘤特異的溶瘤腺病毒表現(xiàn)出可觀的治療效能(Kirn，D.，等，NatMed41341-2(1998)；Nemunaitis，J.等，CancerRes606359-66(2000)；和Ganly，I.等，ClinCancerRes6798-806(2000))。雖然施用重組腺病毒誘導(dǎo)腫瘤生長的部分抑制作用，沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤完全根除，且經(jīng)過一段時間后快速發(fā)生腫瘤的再生長。這些結(jié)果可能是因?yàn)榫植孔⑸涞侥[瘤的重組腺病毒在有限的周圍部分?jǐn)U散以引起限制性的抗腫瘤活性，以使沒有感染病毒的腫瘤細(xì)胞快速生長。根據(jù)最近的研究報道，施用到裸鼠中的人腫瘤中的重組腺病毒在晚至最初的病毒注射后100天持續(xù)復(fù)制并不保證完全根除腫瘤，但是從腫瘤組織可獲得有活力病毒(Sauthoff，H.等，HumanGeneTherapy14425-433(2003))。因此，可以理解理想的腫瘤特異溶瘤腺病毒具有誘導(dǎo)更大的溶瘤活性和在遍布腫瘤組織擴(kuò)散以及感染周圍腫瘤細(xì)胞的能力。貫穿本申請，參考了若干專利和出版物并在括號中提供引證。為了更全面地描述本發(fā)明和本發(fā)明涉及的本領(lǐng)域的狀況，將這些專利和出版物的公開引入本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明已進(jìn)行深入研究以改善基因送遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，具體而言，以增強(qiáng)組織中基因送遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(或擴(kuò)散)效率，結(jié)果，發(fā)現(xiàn)松弛素可以顯著地改善基因送遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種具有改善的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的基因送遞系統(tǒng)。本發(fā)明的另一目的是提供一種向細(xì)胞中遞送具有改善的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的基因的方法。本發(fā)明的又一目的是提供一種具有改善的腫瘤組織穿透性和腫瘤特異性凋亡能力的重組腺病毒。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于治療癌癥的抗腫瘤藥物組合物。本發(fā)明的又一目的是提供一種通過使用所述抗腫瘤藥物組合物治療癌癥的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于改善藥物進(jìn)入組織的穿透能力的藥物組合物。本發(fā)明又另一目的是提供一種用于治療與過量細(xì)胞外基質(zhì)累積相關(guān)的疾病或病癥的藥物組合物。結(jié)合所附的權(quán)利要求書和附圖，從以下詳細(xì)描述中，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將變得清楚明了。在本發(fā)明的一個技術(shù)方案中，提供一種包括待遞送到細(xì)胞中的目的核苷酸序列的基因送遞系統(tǒng)，其改善包含編碼松弛素的核苷酸序列以增強(qiáng)目的所述核苷酸序列進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。本發(fā)明人已進(jìn)行深入研究以改善基因送遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，具體而言，以增強(qiáng)組織中的基因送遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(或擴(kuò)散)效率。此類研究基于我們的通過促進(jìn)降解合成的或抑制細(xì)胞外基質(zhì)組分的合成降低細(xì)胞外基質(zhì)組分的水平可增強(qiáng)組織內(nèi)基因送遞系統(tǒng)的擴(kuò)散的假設(shè)。令人驚奇地，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)松弛素可以顯著地提高基因送遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在此所用的術(shù)語“松弛素”包含實(shí)施例中示出和舉例說明的松弛素以其任意同源物以提高為本發(fā)明目的的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在本發(fā)明中作為提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的增強(qiáng)子起關(guān)鍵作用的松弛素是6kDa的肽激素，與胰島素和胰島素樣生長因子(insulin-likegrowthfactors，IGFs)結(jié)構(gòu)相關(guān)。其主要在黃體和子宮內(nèi)膜中產(chǎn)生并且其血清水平在懷孕期間大大提高(Sherwood，O.D.等，Dynamicchangesofmultipleformsofserumimmunoactiverelaxinduringpregnancyintherat.Endocrinology114806-13(1984))。雖然基于報道松弛素僅在懷孕期間的性器官有活性的早期研究，最初將松弛素分類為“懷孕激素”，但是因?yàn)樵诔云鞴偻獾钠渌鞴俸徒M織中發(fā)現(xiàn)其活性，所以最近認(rèn)為其為“萬能激素”(Hisaw，F(xiàn).L.，等，Effectsofrelaxinontheendotheliumofendometrialbloodvesselsinmonkeys(Macacamulatta).Endocrinology81375-85(1967))。已知松弛素有助于胎盤和子宮的生長和再生并在分娩期間松弛子宮頸以加寬產(chǎn)道。其促進(jìn)產(chǎn)道組織中如MMP2、MMP3和MMP9的多種MMP的表達(dá)以降解膠原，以使結(jié)締組織和基底膜降解以導(dǎo)致產(chǎn)道的細(xì)胞外基質(zhì)破壞。除此之外，在松弛素作為抑制劑起作用以防止膠原過表達(dá)的肺、心臟、皮膚、腸道、乳腺、血管和精管中也觀察到由松弛素促進(jìn)的MMP1和MMP3的表達(dá)(Qin，X.，等，BiolReprod56800-11(1997)；Qin，X.，等，BiolReprod56812-20(1997)；和Palejwala，S.等，Endocrinology1423405-13(2001))。根據(jù)本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)，表達(dá)的松弛素蛋白質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)周圍細(xì)胞的主要組分膠原的降解，以破壞結(jié)締組織和基底膜，因此導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解。這種連續(xù)作用是在下述實(shí)施例中清楚地證實(shí)的通過松弛素提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的一種機(jī)制。因此，參考松弛素的上述作用，本基因送遞系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)集中在包括通過細(xì)胞外基質(zhì)互相連接的細(xì)胞的組織內(nèi)的細(xì)胞。具體而言，當(dāng)用于由結(jié)締組織緊密包圍的腫瘤組織，與任何常規(guī)送遞系統(tǒng)相比，本基因送遞系統(tǒng)表現(xiàn)出提高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在此所用的術(shù)語“基因送遞”是指將基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中并與基因轉(zhuǎn)導(dǎo)具有相同的含義。在組織水平，基因送遞與基因擴(kuò)散成為同義。因此，本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)也表示為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)或基因擴(kuò)散系統(tǒng)。為了構(gòu)建本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)，優(yōu)選在合適的表達(dá)構(gòu)建體中包含編碼松弛素的核苷酸序列。根據(jù)所述的構(gòu)建體，優(yōu)選編碼松弛素的核苷酸序列與啟動子可操作地連接。術(shù)語“可操作地連接”是指核酸表達(dá)控制序列(如啟動子、信號序列或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的陣列)與第二個核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達(dá)控制序列影響對應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。根據(jù)本發(fā)明，與松弛素基因連接的啟動子優(yōu)選在動物細(xì)胞中、更優(yōu)選在哺乳動物細(xì)胞中是可操作的，以控制松弛素基因的轉(zhuǎn)錄，所述啟動子包括來源于哺乳動物細(xì)胞基因組或哺乳動物病毒的啟動子，例如，CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動子、腺病毒晚期啟動子、痘苗病毒7.5K啟動子、SV40啟動子、HSVtk啟動子、RSV啟動子、EF1α啟動子、金屬硫蛋白啟動子、β-肌動蛋白啟動子、人IL-2基因啟動子、人IFN基因啟動子、人IL-4基因啟動子、人淋巴毒素基因啟動子和人GM-CSF基因啟動子。最優(yōu)選地，所述啟動子為CMV啟動子。優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的表達(dá)構(gòu)建體包含多腺苷酸化序列(例如，牛生長激素終止子和SV40-衍生的多腺苷酸化序列)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，用于編碼松弛素的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體具有“啟動子-編碼松弛素的核苷酸序列-多腺苷酸化序列”的結(jié)構(gòu)。在本基因送遞系統(tǒng)中，待送遞到細(xì)胞中的目的核苷酸序列可包含在與用于編碼松弛素的核苷酸序列具有相同結(jié)構(gòu)的表達(dá)構(gòu)建體內(nèi)。例如，待送遞到細(xì)胞中的目的核苷酸序列可為包括編碼具有抗腫瘤活性并最終變性腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)的癌治療基因的任一序列，，所述癌治療基因如腫瘤抑制基因、免疫調(diào)節(jié)基因[例如，細(xì)胞因子基因、趨化因子基因和共刺激因子基因(對于T細(xì)胞活性如B7.1和B7.2)]、抗原基因、自殺基因、細(xì)胞毒性基因、細(xì)胞抑制基因、前凋亡基因和抗血管生成基因，但不局限于此。所述自殺基因編碼能夠賦予腫瘤細(xì)胞對化學(xué)治療劑的敏感性的蛋白質(zhì)，或能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中毒性狀況的蛋白質(zhì)。最公知的自殺基因是單純皰疹病毒-胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase，HSV-TK)基因(美國專利號5,631,236和5,601,818)。表達(dá)HSV-TK的細(xì)胞易于通過更昔洛韋(gancyclovir)選擇性細(xì)胞死亡。所述腫瘤抑制基因編碼多肽以抑制腫瘤發(fā)生。所述腫瘤抑制基因是哺乳動物細(xì)胞中固有的并且認(rèn)為它們的缺失或失活是腫瘤發(fā)生的前提。腫瘤抑制基因的實(shí)例包括以APC、DPC4、NF-1、NF-2、MTS1、WT1、BRCA1、BRCA2、VHL、p53、Rb、MMAC-1、MMSC-2、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因?yàn)槔哪[瘤抑制基因INK4家族的成員(Lee等，Nature，329642(1987))、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白基因(Albertsen等，美國專利號5783,666)、在染色體3p21.3上作圖的鼻咽癌腫瘤抑制基因(Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.，953042-3047(1998))、缺失結(jié)腸癌(coloncarcinoma，OCC)基因、MTS1、CDK4、VHL、p100Rb、p16和p21、和其治療有效片段(例如，p56Rb、p94Rb)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解可使用其它已知的抗腫瘤基因。在此所用的術(shù)語“抗原基因”是指編碼通過免疫系統(tǒng)識別的抗原細(xì)胞表面蛋白的核苷酸序列。所述抗原基因的實(shí)例包括癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)、前列腺特異抗原(prostatespecificantigen，PSA)、甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)和p53(WO94/02167)。為了促進(jìn)免疫識別，所述抗原基因可與MHCI型抗原融合。在此所用的術(shù)語“細(xì)胞毒性基因”是指其在細(xì)胞中的表達(dá)引起毒性作用的核苷酸序列。細(xì)胞毒性基因的實(shí)例包括編碼假單胞菌外毒素、蓖麻毒素、白喉毒素等的核苷酸序列。這里所用的術(shù)語“細(xì)胞抑制基因”是指其在細(xì)胞中的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期的停滯的核苷酸序列。所述細(xì)胞抑制基因的實(shí)例包括但不限于p21、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白基因、如p16、p15、p18和p19的編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的基因、生長停滯特異性同源異型框(growtharrestspecifichomeobox，GAX)基因(WO97/16459和WO96/30385)。此外，在本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)中可以攜帶用于治療多種疾病的各種治療基因。所述治療基因的非限制實(shí)例包括編碼細(xì)胞因子(例如，干擾素-α、干擾素-β、干擾素-δ、干擾素-γ)、白細(xì)胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-19和IL-20)、集落刺激因子(例如，GM-CSF和G-CSF)、趨化因子基因[單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白2(MCP-2)、單核細(xì)胞趨化蛋白3(MCP-3)、單核細(xì)胞趨化蛋白4(MCP-4)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β(MIP-1β)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1γ(MIP-1γ)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α(MIP-3α)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3β(MIP-3β)、趨化因子(ELC)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白4(MIP-4)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白5(MIP-5)、LD78β、RANTES、SIS-ε(p500)、胸腺和激活可調(diào)節(jié)趨化因子(thymusandactivation-regulatedchemokine，TARC)、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(eotaxin)、I-309、人蛋白HCC-1/NCC-2、人蛋白HCC-3和鼠蛋白C10]的基因。此外，所述治療基因包括編碼組織型纖溶酶原激活物(tissue-typeplasminogenactivator，tPA)或尿激酶型纖溶酶原激活物的基因和LAL-產(chǎn)生基因以提供用于防止高膽固醇血癥的持續(xù)的血栓溶解。此外，已知用于治療包括囊性纖維化、腺苷脫胺酶缺陷、AIDS和其它感染性疾病以及惡性和炎性疾病的多種疾病的核苷酸序列可用作治療基因。這里所用的術(shù)語“前凋亡基因”是指其表達(dá)導(dǎo)致凋亡的核苷酸序列。所述前凋亡基因的實(shí)例包括p53、腺病毒E3-11.6K(來源于Ad2和Ad5)或腺病毒E3-10.5K(來源于Ad)、腺病毒E4基因、Fas配體、TNF-α、TRAIL、p53途徑基因和編碼一系列胱天蛋白酶(caspase)的基因。這里所用的術(shù)語“抗血管生成基因”是指其表達(dá)導(dǎo)致抗血管生成因子的細(xì)胞外分泌的核苷酸序列。抗血管生成因子包括血管他丁(angiostatin)、如Tie2的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的抑制劑(PNAS，1998，95，8795-8800)、和內(nèi)皮他丁(endostatin)。從如GenBank和EMBL的DNA序列數(shù)據(jù)庫可獲得上述目的核苷酸序列。本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)以多種形式構(gòu)建，優(yōu)選地，(i)裸露的重組DNA分子，(ii)質(zhì)粒，(iii)病毒載體，或(iv)含有裸露的重組DNA分子和質(zhì)粒的脂質(zhì)體或新核蛋白體。編碼松弛素的核苷酸序列可應(yīng)用于許多用于基因治療的基因送遞系統(tǒng)，優(yōu)選質(zhì)粒、腺病毒(LockettLJ，等，Clin.CancerRes.32075-2080(1997))、腺伴隨病毒(AAV，LashfordLS.，等，GeneTHerapyTechnologies，ApplicationsandRegulationsEd.A.Meager，1999)、反轉(zhuǎn)錄病毒(GunzburgWH，等，Retroviralvectors.GeneTherapyTechnologies，ApplicationsandRegulationsEd.A.Meager，1999)、慢病毒(WangG.等，J.Clin.Invest.104(11)R55-62(1999))、單純皰疹病毒(ChamberR.，等，Proc.Natl.Acad.SciUSA921411-1415(1995))、痘苗病毒(PuhlmannM.等人，HumanGeneTherapy10649-657(1999))、脂質(zhì)體(MethodsinMolecularBiology，Vol199，S.C.Basu和M.Basu(編者)，HumanPress2002)或新核蛋白體。最優(yōu)選地，通過將編碼松弛素的核苷酸序列整合到腺病毒構(gòu)建本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)。(i)腺病毒因?yàn)橄俨《净蚪M中等大小、易于操作、高效價、寬靶細(xì)胞范圍和高感染性，所以腺病毒已通常用作基因送遞載體?；蚪M的兩端均含有100-200bp對于病毒DNA復(fù)制和包裝必需的順式元件ITR(反向末端重復(fù)序列)。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒基因組和幾種細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì))。E2區(qū)(E2A和E2B)的表達(dá)引起用于病毒DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)的合成。在至今開發(fā)的腺病毒載體中，通常使用具有缺失E1區(qū)的復(fù)制缺陷型腺病毒。腺病毒載體中缺失E3區(qū)可提供用于轉(zhuǎn)基因的插入位點(diǎn)(Thimmappaya，B.等，Cell，31543-551(1982)；和Riordan，J.R.等，Science，2451066-1073(1989))。因此，優(yōu)選將編碼松弛素的核苷酸序列插入到缺失的E1區(qū)(E1A區(qū)和/或E1B區(qū)，優(yōu)選E1B區(qū))或缺失的E3區(qū)，更優(yōu)選地，缺失的E3區(qū)。優(yōu)選將待送遞的目的核苷酸序列插入到缺失的E1區(qū)(E1A區(qū)和/或E1B區(qū)，優(yōu)選E1B區(qū))或缺失的E3區(qū)，更優(yōu)選缺失的E1區(qū)。此外，插入序列可整合到缺失的E4區(qū)。參考病毒基因組的術(shù)語“缺失”包含全部缺失以及部分缺失。根據(jù)最優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的腺病毒基因送遞載體包括“啟動子-目的核苷酸序列-polyA序列”和“啟動子-松弛素基因-polyA序列”。所述啟動子-目的核苷酸序列-polyA序列優(yōu)選存在于缺失的E1區(qū)(E1A區(qū)和/或E1B區(qū)，優(yōu)選E1B區(qū))或缺失的E3區(qū)，更優(yōu)選缺失的E1區(qū)。所述啟動子-松弛素基因-polyA序列優(yōu)選存在于缺失的E1區(qū)(E1A區(qū)和/或E1B區(qū)，優(yōu)選E1B區(qū))或缺失的E3區(qū)，更優(yōu)選缺失的E3區(qū)。此外，所述腺病毒基因送遞系統(tǒng)可包括雙順反子表達(dá)系統(tǒng)，其中，目的核苷酸序列和編碼松弛素的核苷酸序列通過IRES(internalribosomeentrysite，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))互相連接以形成“啟動子-目的核苷酸序列-polyA序列-松弛素基因-polyA序列”。在自然界，腺病毒可包裝約105％的野生型基因組，提供約額外2kbDNA的能力(Ghosh-Choudhury等，EMBOJ.，61733-1739(1987))。在這方面，插入到腺病毒中的上述外源序列還可插入到腺病毒野生型基因組。所述腺病毒可為42種不同的已知血清型或A-F亞類中的任一種。C亞類的5型腺病毒是用于構(gòu)建本發(fā)明的腺病毒基因送遞系統(tǒng)的最優(yōu)選的原料。關(guān)于5型腺病毒的很多生物化學(xué)和遺傳學(xué)的信息是已知的。通過本腺病毒基因送遞系統(tǒng)送遞的外源基因是游離基因，所以，對宿主細(xì)胞具有低的遺傳毒性。因此使用本發(fā)明的腺病毒基因送遞系統(tǒng)的基因治療可相當(dāng)安全。(ii)反轉(zhuǎn)錄病毒由于反轉(zhuǎn)錄病毒將其基因組整合到宿主基因組并具有寬宿主范圍，能夠攜帶相對大的外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒已用作病毒送遞載體。為了構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體，在一定病毒序列的位置將編碼松弛素的核苷酸序列和待轉(zhuǎn)移的目的核苷酸序列插入到病毒基因組中以產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒。為了產(chǎn)生毒粒，構(gòu)建了含有g(shù)ag、pol和env基因但沒有LTR(longterminalrepeat，長末端重復(fù))和ψ組分的包裝細(xì)胞系(Mann等，Cell，33153-159(1983))。當(dāng)將含有編碼松弛素的序列、目的核苷酸序列、LTR和ψ的重組質(zhì)粒引入到該細(xì)胞系中時，ψ序列使重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄本包裝進(jìn)毒粒中，然后將毒粒分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubinstein“Retroviralvectors，”InVectorsAsurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses，Rodriguez和Denhardt(編者)，StonehamButterworth，494-513(1988))。然后收集含有重組反轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，選擇性地進(jìn)行濃縮并用于基因送遞。已報道使用第二代反轉(zhuǎn)錄病毒載體的成功的基因轉(zhuǎn)移。Kasahara等(Science，2661373-1376(1994))制備了莫洛尼小鼠白血病毒變體，其中，將EPO(紅細(xì)胞生成素)序列插入包膜區(qū)的位置，因此產(chǎn)生具有新結(jié)合性質(zhì)的嵌合蛋白質(zhì)。同樣，根據(jù)用于第二代反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建策略，可以構(gòu)建本基因送遞系統(tǒng)。(iii)AAV載體腺伴隨病毒能夠感染不分裂細(xì)胞和多種類型的細(xì)胞，使其可用于構(gòu)建本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)。美國專利號5,139,941和4,797,368中可以找到AAV載體的用途和制備的詳細(xì)說明。在LaFace等，Viology，162483486(1988)，Zhou等，Exp.Hematol.(NY)，21928-933(1993)，Walsh等，J.Clin.Invest.，941440-1448(1994)和Flotte等，GeneTherapy，229-37(1995)中公開了AAV作為基因送遞系統(tǒng)的研究結(jié)果。最近，已批準(zhǔn)AAV載體用于治療囊性纖維化的I期人體試驗(yàn)。一般地，通過共轉(zhuǎn)染含有側(cè)接兩個AAV末端重復(fù)的目的基因(即，松弛素基因和待送遞的目的核苷酸序列)的質(zhì)粒(McLaughlin等，1988；Samulski等，1989)和含有野生型AAV編碼序列而沒有末端重度的表達(dá)質(zhì)粒(McCarty等，J.Virol.，652936-2945(1991))制備重組AAV病毒。(iv)其它病毒載體其它病毒載體可以用作本發(fā)明的基因送遞載體。在本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)中可以使用來源于如痘苗病毒(PuhlmannM.等，HumanGeneTherapy10649-657(1999)；Ridgeway，″Mammalianexpressionvectors，″InVectorsAsurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses.Rodriguez和Denhardt，編者，StonehamButterworth，467-492(1988)；Baichwal和Sugden，″VectorsforgenetransferderivedfromanimalDNAvirusesTransientandstableexpressionoftransferredgenes，″InKucherlapatiR，編者Genetransfer.紐約PlenumPress，117-148(1986)和Coupar等，Gene，681-10(1988))、慢病毒(WangG.等，J.Clin.Invest.104(11)R55-62(1999))和單純皰疹病毒(ChamberR.，等，Proc.Natl.Acad.SciUSA921411-1415(1995))的病毒的載體可用于將松弛素基因和目的核苷酸序列轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的本送遞系統(tǒng)。(v)脂質(zhì)體當(dāng)磷脂在過量的含水培養(yǎng)基中懸浮時自然形成脂質(zhì)體。如在Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721185-190(1982)和Nicolau等，MethoDsEnzymol.，149157-176(1987)中所述，脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸送遞已非常成功。用于用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞的可商業(yè)獲得的試劑的實(shí)例包括脂轉(zhuǎn)染胺(Lipofectamine)(GibcoBRL)。捕捉松弛素基因和目的核苷酸序列的脂質(zhì)體與細(xì)胞通過如內(nèi)吞、吸收和融合的機(jī)制相互作用并然后將所述序列轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。在本發(fā)明的另一技術(shù)方案中，提供一種用于送遞基因的方法，所述方法包括將上述本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)與含有細(xì)胞的生物樣品接觸。由于在病毒載體構(gòu)建的基礎(chǔ)上構(gòu)建本基因送遞系統(tǒng)，所以如本領(lǐng)域已知的常規(guī)感染方法進(jìn)行接觸。在上面引用的出版物中很好地描述了使用病毒載體感染宿主。由于基因送遞系統(tǒng)是裸露的重組DNA分子或質(zhì)粒，通過微注射(Capecchi，M.R.，Cell，22479(1980)以及Harland和Weintraub，J.CellBiol.1011094-1099(1985))、磷酸鈣共沉淀(Graham，F(xiàn).L.等，Virology，52456(1973)以及Chen和Okayama，Mol.Cell.Biol.72745-2752(1987))、電穿孔(Neumann，E.等，EMBOJ.，1841(1982)以及Tur-Kaspa等，MoI.CellBiol.，6716-718(1986))、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wong，T.K.等，Gene，1087(1980)以及Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721185-190(1982)；和Nicolau等，MethodsEnzymol.，149157-176(1987))、DEAE-葡聚糖處理(Gopal，Mol.CellBiol.，51188-1190(1985))和粒子高速撞擊(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.，879568-9572(1990))將編碼松弛素的序列和待送遞的核苷酸序列引入到細(xì)胞中在本發(fā)明的又另一技術(shù)方案中，提供包括腺病毒ITR(反向末端重復(fù)序列)核苷酸序列和編碼松弛素的核苷酸序列的重組腺病毒；其中表達(dá)的松弛素蛋白增強(qiáng)了重組腺病毒進(jìn)入腫瘤組織的穿透能力和用重組腺病毒感染的腫瘤細(xì)胞凋亡。在本發(fā)明的重組腺病毒中，表達(dá)的松弛素蛋白顯著增強(qiáng)了重組腺病毒進(jìn)入腫瘤組織的穿透能力和用重組腺病毒感染的腫瘤細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡，使腺病毒的治療效能大大提高。已知小部分腺病毒基因組作為順式元件是必需的(Tooza，J.MolecularbiologyofDNATumorviruses，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1981))，尤其是與如293的合適的細(xì)胞系一起使用，允許用外源序列替代大片段的腺病毒DNA。在本文中，所述重組腺病毒包括作為必需序列的腺病毒ITR序列以及編碼松弛素的核苷酸序列。優(yōu)選將編碼松弛素的核苷酸序列插入到缺失的E1區(qū)(E1A區(qū)和/或E1B區(qū)，優(yōu)選E1B區(qū))或缺失的E3區(qū)，更優(yōu)選缺失的E3區(qū)。將待送遞的目的核苷酸序列(例如，細(xì)胞因子基因、免疫共刺激因子基因、凋亡基因和腫瘤抑制基因)插入到缺失的E1區(qū)(E1A區(qū)和/或E1B區(qū)，優(yōu)選E1B區(qū))或缺失的E3區(qū)，更優(yōu)選缺失的E1區(qū)(E1A區(qū)和/或E1B區(qū))，最優(yōu)選E1B區(qū)。此外，插入序列可整合到缺失的E4區(qū)。在自然界，腺病毒可包裝約105％的野生型基因組，提供了約額外2kbDNA的能力(Ghosh-Choudhury等，EMBOJ.，61733-1739(1987))。在這方面，插入到腺病毒的上述外源序列還可插入到腺病毒野生型基因組。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的重組腺病毒包含失活的E1B19基因、失活的E1B55基因或失活的E1B19/E1B55基因。這里所用的與基因連接的術(shù)語“失活”是指使基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯無功能發(fā)生，因此不能產(chǎn)生基因編碼的蛋白質(zhì)的正確功能的條件。例如，失活的E1B19基因是通過突變(替代、添加、以及部分或全部缺失)不能產(chǎn)生功能性E1B19kDa蛋白的基因。E1B19缺失引起凋亡發(fā)生率增加并且缺失E1B55使重組腺病毒具有腫瘤特異性(參見韓國專利號10-2002-0023760)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的重組腺病毒包括有活性的E1A基因。攜帶有活性的E1A基因的腺病毒是增殖型的。更優(yōu)選，本發(fā)明的重組腺病毒包括失活的E1B19/E1B55基因和有活性的E1A基因。最優(yōu)選，所述重組腺病毒包括滅活的E1B19/E1B55基因、有活性的E1A基因和缺失E3區(qū)的位置的編碼松弛素的序列。根據(jù)最優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的重組腺病毒包括“ITR-E1A-ΔE1B-啟動子-松弛素基因-polyA序列”結(jié)構(gòu)，其中，啟動子-松弛素基因-polyA序列存在于缺失的E3區(qū)。本發(fā)明的示例性腺病毒具有由圖1的Ad-ΔE1B-RLX表示的遺傳圖。與常規(guī)抗腫瘤腺病毒相比，本發(fā)明的重組腺病毒顯示進(jìn)入腫瘤的高度改善的轉(zhuǎn)導(dǎo)(穿透)效率以及凋亡能力。這些改善的功效主要?dú)w于松弛素有效地降解細(xì)胞外基質(zhì)和提高凋亡能力。因此，本發(fā)明的重組腺病毒表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的溶瘤作用。腫瘤組織不是單獨(dú)由腫瘤細(xì)胞組成的聚團(tuán)而是還包含血管和正常細(xì)胞的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。尤其是，腫瘤組織中的結(jié)締組織通常是堅硬的并形成圍繞腫瘤細(xì)胞的緊密的細(xì)胞外基質(zhì)。因此，抗腫瘤藥物以及病毒不能有效穿透到腫瘤中，從而它們通常顯示有限的抗腫瘤作用。用含有所述松弛素基因的本發(fā)明的重組腺病毒可以克服此類障礙。如在下述實(shí)施例所示，具有插入的松弛素基因的本發(fā)明的腺病毒活躍地擴(kuò)散甚至進(jìn)入到腫瘤球狀體的中央及其表面。對于體內(nèi)腫瘤組織，本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒從注射位點(diǎn)(針跡)廣泛并遠(yuǎn)距離地擴(kuò)散到遠(yuǎn)端位點(diǎn)。通過表達(dá)松弛素的腺病毒實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的提高是明顯的，甚至用肉眼可以容易地區(qū)分。應(yīng)當(dāng)理解與如膠原酶/分散酶或胰蛋白酶、彈性蛋白酶的蛋白酶預(yù)處理以降解彈性蛋白或透明質(zhì)酸酶預(yù)處理以降解細(xì)胞外基質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高約2～3倍相比，提高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是非常顯著的。通過松弛素在組織中增強(qiáng)的擴(kuò)散作用可以大大地提高腫瘤特異溶瘤腺病毒的抗腫瘤效力。這種提高的抗腫瘤效力可以在復(fù)制缺陷型腺病毒以及增殖型腺病毒中顯示。通過松弛素增強(qiáng)腺病毒誘導(dǎo)凋亡的能力是令人驚奇的和沒有預(yù)料到的。在本發(fā)明的另一技術(shù)方案中，提供一種用于治療癌癥的抗腫瘤藥物組合物，所述抗腫瘤藥物組合物包含(a)治療有效量的上述重組腺病毒；和(b)可藥用載體。本發(fā)明的又一技術(shù)方案中，提供一種用于治療癌癥的方法，所述治療癌癥的方法包括向動物施用上述抗腫瘤藥物組合物。在藥物組合物中作為活性成分的重組腺病毒為上文描述的本發(fā)明的腺病毒并且因此以上描述可以適用于藥物組合物的重組腺病毒。因此，為了避免導(dǎo)致本說明書復(fù)雜性的過度冗余，省略了它們之間的共有描述。為了通過重組腺病毒有效地引發(fā)抗腫瘤作用，需要病毒增殖并擴(kuò)散到鄰近細(xì)胞快于癌細(xì)胞的生長率以誘導(dǎo)溶瘤作用。此外，使用腺病毒的成功的癌基因治療需要增強(qiáng)安全性以及高治療益處。本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒提高了病毒擴(kuò)散和凋亡以顯示顯著提高的抗腫瘤作用。尤其是，具有缺失E1B55基因的本發(fā)明的重組腺病毒顯示細(xì)胞毒性中的優(yōu)異的腫瘤特異性。因此，本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒使用于癌癥治療的劑量降低，顯著降低對正常細(xì)胞的毒性和不希望的體內(nèi)免疫反應(yīng)。由于本發(fā)明的重組腺病毒對許多腫瘤細(xì)胞具有溶瘤作用，所以本發(fā)明的藥物組合物可用于治療腫瘤相關(guān)疾病，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支氣管原癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌和子宮頸癌。這里所用的術(shù)語“治療”是指(i)預(yù)防腫瘤發(fā)生；(ii)通過根除腫瘤細(xì)胞抑制和治療腫瘤相關(guān)疾病或病癥；和(iii)通過根除腫瘤細(xì)胞減輕腫瘤相關(guān)疾病或病癥。因此，這里所用的術(shù)語“治療有效量”表示足夠達(dá)到上述藥學(xué)作用的量。在藥物配方中通常采用，但不受限制的本發(fā)明的藥物組合物中含有的可藥用載體包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡膠(rubberarable)、磷酸鉀、精氨酸鹽(arginate)、明膠、硅酸鉀、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還可以包括潤滑劑、濕潤劑、增甜劑、調(diào)味劑、乳化劑、懸浮劑和防腐劑。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以通過在基因治療中常用的途徑施用，并且優(yōu)選腸胃外施用，即通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下施用或局部施用。例如，藥物組合物可腹膜內(nèi)施用以治療卵巢癌和靜脈內(nèi)施用以治療肝癌、直接注射到可見腫瘤塊以治療乳腺癌、直接灌腸注射以治療結(jié)腸癌、和直接注射到導(dǎo)尿管以治療膀胱癌。本發(fā)明的藥物組合物的合適劑量可以取決于藥物制備方法、施用方法、患者的年齡、體重、性別、致病狀態(tài)、飲食、施用時間、施用途徑、排泄率和對所用藥物組合物的敏感性而變化，并且本領(lǐng)域普通醫(yī)師可以確定對于理想治療的藥物組合物的有效量。一般而言，本發(fā)明的藥物組合物包括1×105～1×1015pfu/ml的重組腺病毒，并且一般兩周隔日注射1×1010pfu的重組腺病毒。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，包含根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒的藥物組合物可以與可藥用載體和/或上述載體進(jìn)行配制，最終提供幾種形式，一種單元藥劑形式和一種多元藥劑形式。劑型的非限制性實(shí)例包括但不限于溶液、在油或水介質(zhì)中的懸濁液或乳濁液、提取物、酏劑、粉劑、顆粒劑、片劑和膠囊，并且還可包含分散劑或穩(wěn)定劑。包括根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒的藥物組合物可以單獨(dú)應(yīng)用或與一般的化學(xué)治療或放射治療組合應(yīng)用。此種組合治療在治療癌癥中可更加有效?？捎糜诮M合治療的化學(xué)治療劑包括順鉑、卡波鉑、甲基芐肼、二氯甲基二乙胺、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、二硫烷(bisulfane)、nikosourea、更生霉素、柔紅霉素、阿霉素、博來霉素、普卡霉素、絲裂霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、反鉑(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、長春新堿、長春堿和氨甲蝶呤。用于組合治療的放射治療的實(shí)例包括X-射線照射和γ射線照射。在本發(fā)明的另一技術(shù)方案中，提供一種用于提高藥物對組織穿透能力的藥物組合物，所述藥物組合物包括(a)提高藥物組合物進(jìn)入組織的穿透能力的松弛素蛋白質(zhì)；和(b)可藥用載體。本發(fā)明的藥物組合物含有的松弛素蛋白可以從天然來源和常規(guī)DNA重組技術(shù)獲得。此外，其片段包含在本發(fā)明中，除非它們在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中無活性。所述藥物組合物可以在施用特定藥物之前或同時施用。此外，所述藥物組合物還可包括藥物。本發(fā)明的藥物組合物通過降解圍繞藥物的靶組織的細(xì)胞外基質(zhì)，顯著提高藥物的藥理學(xué)效力。參考如前討論的用于本發(fā)明的抗腫瘤藥物組合物的說明描述了用于本藥物組合物的可藥用載體、施用途徑和方法，和劑型。尤其是，優(yōu)選腸胃外施用本藥物組合物，例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、或經(jīng)皮和局部(例如，直接注射到腦或乳腺腫瘤塊)施用。一般而言，本發(fā)明的藥物組合物可以以0.0001-100mg/kg的劑量施用。通過本發(fā)明的藥物組合物顯示改善的組織穿透性的藥物包括化學(xué)藥物和生物藥物，優(yōu)選地，組織穿透性通過細(xì)胞外基質(zhì)減弱的藥物，例如抗癌藥物。本發(fā)明的又一技術(shù)方案，提供一種用于治療與過量細(xì)胞外基質(zhì)累積相關(guān)的疾病或病癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含(a)治療有效量的松弛素蛋白或包括編碼松弛素的核苷酸序列的基因送遞系統(tǒng)；和(b)可藥用載體。本發(fā)明的藥物組合物有效降解圍繞組織的細(xì)胞外基質(zhì)以對與過量細(xì)胞外基質(zhì)的累積或沉積相關(guān)的疾病或病癥具有治療效力。短語“過量細(xì)胞外基質(zhì)的累積”表示如膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白和蛋白聚糖的細(xì)胞外基質(zhì)的組分過量沉積以損傷組織或器官，最終引起纖維樣變性。待通過本藥物組合物治療的與細(xì)胞外基質(zhì)的過量累積相關(guān)的疾病或病癥為纖維樣變性相關(guān)疾病，包括但不限于瘢痕、肝硬化、肺纖維樣變性、腎小球腎炎、成人或急性呼吸困難、肝纖維樣變性、腎纖維樣變性、心肌梗塞后的心肌纖維樣變性、纖維囊腫病、纖維樣變性癌、靜脈閉塞綜合征和腎基質(zhì)纖維樣變性。由創(chuàng)傷、燒傷或手術(shù)引起的瘢痕和如瘢痕疙瘩的瘢痕增生可用本發(fā)明的藥物組合物治療。參考如上文討論的本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)的說明可描述包含編碼松弛素的核苷酸序列的基因送遞系統(tǒng)。含有本發(fā)明的藥物組合物所含的松弛素蛋白可以從天然來源和常規(guī)DNA重組技術(shù)獲得。此外，其片段包含在本發(fā)明中，除非它們在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中無活性。參考如前討論的對于本發(fā)明的抗腫瘤藥物組合物的說明描述了本藥物組合物的可藥用載體、施用途徑和方法、和劑型。尤其是，本藥物組合物最優(yōu)選經(jīng)皮施用。適用于本發(fā)明的藥物組合物劑型包括軟膏、凝膠劑、乳劑、溶液、噴劑、膜片和洗劑。一般而言，本發(fā)明的藥物組合物可以0.0001～100mg/kg的劑量施用。本發(fā)明提供一種新的基因送遞系統(tǒng)和包括松弛素編碼序列的重組腺病毒、一種采用基因送遞系統(tǒng)的基因送遞方法、一種包括所述重組腺病毒的抗腫瘤藥物組合物、一種特征為提高組織穿透能力的藥物組合物和一種用于治療與過量細(xì)胞外基質(zhì)累積相關(guān)的疾病或病癥的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明，松弛素負(fù)責(zé)提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效力和凋亡能力，以顯著提高腫瘤細(xì)胞殺傷力。圖1示意地表示實(shí)施例中所用的重組腺病毒的遺傳圖。圖2為顯示本發(fā)明的重組腺病毒的松弛素表達(dá)圖式的圖。圖3為表示本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒進(jìn)入如U343、U87MG、C33A和A549的腫瘤的體外組織穿透的照片。圖4為表示本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒進(jìn)入如U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549的腫瘤的體內(nèi)組織穿透的照片。圖5表示表明本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒的細(xì)胞殺傷效力的CPE(cytopathiceffect，致細(xì)胞病變效應(yīng))分析結(jié)果。圖6表示本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒的空斑發(fā)展試驗(yàn)的結(jié)果。圖7顯示證實(shí)本發(fā)明的重組腺病毒誘導(dǎo)凋亡能力的subG1細(xì)胞群的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。圖8顯示證實(shí)本發(fā)明的重組腺病毒誘導(dǎo)凋亡能力的膜連蛋白-V(annexin-V)和PI雙重染色流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。圖9表示證實(shí)本發(fā)明的重組腺病毒誘導(dǎo)凋亡能力的DNA斷裂的TUNNEL試驗(yàn)結(jié)果。圖10表示本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒的體內(nèi)抗腫瘤作用。圖11表示用本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒注射的荷瘤小鼠的存活率提高。圖12表示用本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒注射的荷瘤小鼠中腫瘤的組織學(xué)變化。圖13表示用本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒注射的荷瘤小鼠中腫瘤內(nèi)的膠原分布。圖14表示本發(fā)明的重組腺病毒對自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的抑制作用。隔日用PBS、Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX處理B16BL6荷瘤小鼠3次，然后將原發(fā)性腫瘤手術(shù)去除。除去原發(fā)性腫瘤后第25天，對肺中轉(zhuǎn)移病灶的重量進(jìn)行評估。每個點(diǎn)表示每只個體小鼠(每組5只小鼠)的腫瘤負(fù)荷并用線顯示每組轉(zhuǎn)移病灶的平均重量。對PBS-處理對照*P＜0.01和對Ad-ΔE1B-處理組*P＜0.05。圖15為表明本發(fā)明的表達(dá)松弛素的腺病毒對瘢痕疙瘩細(xì)胞、細(xì)胞球形體和組織球形體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和穿透力的照片。具體實(shí)施例方式以下具體實(shí)施例意對本發(fā)明進(jìn)行舉例說明并不視為限制如所附的權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例材料和方法細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系為從美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)可獲得的人腦癌細(xì)胞系(U343、U87MG)、子宮頸癌細(xì)胞系(C33A)、肝癌細(xì)胞系(Hep3B)、肺癌細(xì)胞系(A549)和攜帶腺病毒早期基因E1區(qū)的293細(xì)胞系。所有細(xì)胞系在添加10％胎牛血清(GibcoBRL)、青霉素和鏈霉素的杜爾貝科變法伊格爾培養(yǎng)(Dulbecco’smodifiedEagle’medium，DMEM；GibcoBRL)中培養(yǎng)并保持在37℃5％CO2氣氛中。重組腺病毒的產(chǎn)生和滴定為了產(chǎn)生表達(dá)松弛素和作為報道基因的lacZ的缺失E1/E3-基因的復(fù)制缺陷型的腺病毒，我們首先用vmdl324Bst(由瑞士Fribourgh大學(xué)Verca博士贈予；Heider，H.等，Biotechniques，28(2)260-265，268-270(2000)構(gòu)建了在缺失E1區(qū)具有l(wèi)acZ基因的pd1-LacZ病毒載體。為了制備該載體，用HindIII和NaeI消化pcDNA-hygro-LacZ質(zhì)粒(Invitrogen，Carlsbad，加利福尼亞州，美國)以分離CMV啟動子、lacZ基因和polA并將分離的三個序列插入到E1腺病毒穿梭載體pΔElsplA以制備pΔElsplA/CMV-LacZ穿梭載體。用XmnI消化制備的pΔE1splA/CMV-LacZ穿梭載體并與用BstBI線性化的vmd1324Bst腺病毒共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)BJ5183(瑞士Fribourgh大學(xué)Verca博士)中以誘導(dǎo)同源重組，獲得pd1-LacZ腺病毒。為了構(gòu)建表達(dá)松弛素的腺病毒，用SalI-HindIII消化pDNR-LIB-RLX(ATCC，#MGC-14599)以獲得1kbDNA片段，將所該片段亞克隆到pCA14載體(Microbix，安大略省，加拿大)，產(chǎn)生pCA14-RLX。在實(shí)施例中所用的松弛素的核苷酸序列在GenBank登錄號BC005956下公布。然后，用BglII將CMV-RLX-polA表達(dá)盒從pCA14-RLX切下并隨后插入到腺病毒E3穿梭載體pSP72ΔE3(Promega，Madison，威斯康星州，美國)以構(gòu)建pSP72ΔE3-cRLXE3穿梭載體。用XmnI線性化構(gòu)建的pSP72ΔE3-cRLXE3穿梭載體并然后與pd1-LacZ共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BJ5183(瑞士Fribourgh大學(xué)Verca博士)以誘導(dǎo)同源重組，產(chǎn)生d1-LacZ-RLX(或d1-Z-RLX)腺病毒載體(圖1)。2004年3月19日將d1-Z-RLX腺病毒保藏在韓國微生物培養(yǎng)中心(KCCM)登錄號為KCCM-10567。為構(gòu)建表達(dá)松弛素基因的能復(fù)制的腺病毒，將以上制備的pSP7ΔE3-cRLXE3穿梭載體用XmnI線性化并與用SpeI線性化的缺失E1B19kDa/E1B55kDa的pAdΔE1B19/55腺病毒載體(KFCC11288)一起共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BJ5183中用于同源重組，產(chǎn)生Ad-ΔE1B-RLX腺病毒載體(圖1)。2004年3月19日將Ad-ΔE1B-RLX腺病毒保藏在在韓國微生物培養(yǎng)中心(KCCM)登錄號為KCCM-10566。在圖1中，ψ表示包括ITR(反向末端重復(fù)序列)和包裝信號的序列，Ad表示腺病毒，CMV表示CMV啟動子，PolA為polyA序列，IX表示編碼IX蛋白的基因。為了證實(shí)各自的同源重組，用HindIII消化質(zhì)粒DNA并分析消化圖樣。將適當(dāng)?shù)耐粗亟M的腺病毒質(zhì)粒DNA用PacI消化并轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中以產(chǎn)生d1-lacZ-RLX和Ad-ΔE1B-RLX腺病毒。所有病毒在293細(xì)胞中增殖并根據(jù)有限稀釋或空斑試驗(yàn)(Hitt，M.等，Constructionandpropagationofhumanadenovirusvectors.Cellbiologyalaboratoryhandbook.紐約AcademicPressInc，479-490(1994))進(jìn)行其滴定，接著用CsCl梯度濃縮和純化。根據(jù)前述步驟，用pCA14作為E1穿梭載體構(gòu)建并制備Ad-ΔE1B(缺失E1B區(qū))作為對照病毒。d1-LacZRLX和Ad-ΔE1B19/55-RLX中松弛素表達(dá)模式的檢驗(yàn)用d1-LacZ-RLX或Ad-ΔEIB-RLX或d1-LacZ或Ad-ΔE1B19腺病毒(KFCC-11288)以MOI(multiplicityofinfection，感染復(fù)數(shù))1～50感染人子宮頸癌細(xì)胞系C33A并在24小時后回收所用的培養(yǎng)基。根據(jù)制造商的方法用ELISA試劑盒(Immunediognostik，Benshem，德國)分析松弛素的表達(dá)。腫瘤球形體中d1-LacZ-RLX的擴(kuò)散和穿透性的評估通過將細(xì)胞注射到6～8周齡裸鼠的腹部皮下建立U343、U87MG、C33A和A549異體移植物并且一旦腫瘤體積達(dá)到150～200mm3時，將新鮮的腫瘤組織用手術(shù)除去。將腫瘤組織切成1～2mm碎片。將這些移植物各個置于涂布0.75％瓊脂糖的板上并在添加5％FBS(GibcoBRL)和青霉素/鏈霉素(GibcoBRL)的DMEM(GibcoBRL)中5％CO2氣氛下37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)基每周更新一次。用腺病毒感染前，將直徑2mm的球形體轉(zhuǎn)移到涂布0.75％瓊脂糖的48-孔板上并加入150μlDMEM(含有5％FBS)，然后加入1×106、1×107或1×108PFU的病毒。48小時后，將培養(yǎng)基吸出并將球形體在固定液中固定用于X-gal染色。在體視鏡下觀察X-gal染色的球形體的表面。為了觀察腺病毒穿透腫瘤球形體，將X-gal染色的腫瘤球形體包埋在O.C.T.化合物(SakuraFinetec，托倫斯市，加利福尼亞州)中并快速冷凍。然后將8μm冷凍切片置于涂布明膠的載玻片上。體內(nèi)d1-LacZ-RLX的擴(kuò)散和穿透性的評估通過將細(xì)胞注射到6-～8周齡裸鼠的腹部皮下建立了U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549異體移植物并且一旦腫瘤體積達(dá)到150～200mm3時，將小鼠隨機(jī)分為兩組并3次以50μl中5×107～1×108PFU的d1-LacZ-RLX腺病毒腫瘤內(nèi)注射到腫瘤中。最后注射后3天，將動物處死并取腫瘤用于病毒分布，然后將它們在4℃的4％低聚甲醛中固定4～8小時并在30％的蔗糖溶液中脫水12小時。將脫水的腫瘤組織在O.C.T.化合物中冷凍并切成厚度為8μm的切片，然后將其置于涂布明膠的載玻片上用于X-gal染色。Ad-ΔE1B-RLX病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)為了評估表達(dá)松弛素的腺病毒的溶瘤活性，將人腫瘤細(xì)胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)置于24-孔板上并然后用MOI為0.1～10的Ad-ΔE1、Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX腺病毒感染。當(dāng)MOI為0.1～0.5用任一所述病毒感染的細(xì)胞顯示完全的細(xì)胞溶解時，將死細(xì)胞洗去并將板上的細(xì)胞用50％甲醇中的0.5％結(jié)晶紫染色?？瞻甙l(fā)生試驗(yàn)為了觀察松弛素表達(dá)的空斑大小的變化，將3×105個Hep3B細(xì)胞置于6-孔板并在細(xì)胞生長1天后以3MOI的Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX腺病毒感染。培養(yǎng)4小時后，將感染細(xì)胞用37℃的2×DMEM(含有10％FBS和青霉素/鏈霉素)和42℃的1.4％瓊脂糖的瓊脂糖-DMEM混合物覆蓋然后在37℃的5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)約10天后，以10％TCA(三氯乙酸)浸泡30分鐘后，將瓊脂糖覆蓋層除去，并將剩余細(xì)胞用50％甲醇中的0.5％結(jié)晶紫染色。凋亡能力的流式細(xì)胞術(shù)分析為了檢驗(yàn)由松弛素誘導(dǎo)的凋亡，將人腫瘤細(xì)胞系U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549引入到25T培養(yǎng)瓶，24小時后，用MOI為0.5～5的Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX腺病毒感染。用0.1～1μMCPT-11(camptothecin，喜樹堿)處理的細(xì)胞作為正對照并且用PBS處理的細(xì)胞作為負(fù)對照。感染48小時、72小時和96小時后，收集感染細(xì)胞并用70％乙醇在4℃固定24小時。固定后，將細(xì)胞與PI(碘化丙錠，50μg/μl)和RNA酶的混合物培養(yǎng)15分鐘并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。此外，為了檢驗(yàn)由松弛素誘導(dǎo)的早期凋亡，如上述用Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX腺病毒感染幾種人腫瘤細(xì)胞系。收集感染細(xì)胞然后根據(jù)ApoAlertV-FITC凋亡試劑盒(Clontech，PaloAlto，加利福尼亞州)中制造商說明，進(jìn)行膜連蛋白V/PI雙重染色，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。TUNNEL試驗(yàn)將U343(5×104)、U87MG(5×104)，C33A(5×105)、Hep3B(4×105)和A549(5×104)細(xì)胞置于腔室玻片上然后用MOI為0.2～20的腺病毒感染。感染24小時和48小時后，除去培養(yǎng)基并根據(jù)ApopTag試劑盒(Intergen，Purchase，紐約)的制造商說明書進(jìn)行TUNNEL測定。為了顯色，將細(xì)胞與過氧化物酶結(jié)合的抗生物素蛋白鏈菌素培養(yǎng)然后與二氨基聯(lián)苯胺(DAKO，Carpinteria，加利福尼亞州)培養(yǎng)。細(xì)胞的顏色變成棕色時，將細(xì)胞用0.5％的甲基綠復(fù)染10分鐘并在顯微鏡下觀察4個以上選定的視野。計算染色細(xì)胞與總細(xì)胞的比率。表達(dá)松弛素的腺病毒的體內(nèi)抗腫瘤作用為了評估AdΔE1B-RLX腺病毒對裸鼠中形成的人腫瘤球形體生長的作用，通過皮下注射1×107個癌細(xì)胞(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)將腫瘤植入到6～8-周齡裸鼠腹部。當(dāng)腫瘤達(dá)到50～80mm3范圍時，隔日3次腫瘤內(nèi)施用將PBS中的5×107～1×108PFU的Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX，并觀察腫瘤的生長模式。用游標(biāo)卡尺測量長軸和短軸計算腫瘤的體積體積＝(短軸mm)2×(長軸mm)×0.523。由施用表達(dá)松弛素的增殖型腺病毒誘導(dǎo)的腫瘤特征變化的觀察當(dāng)在裸鼠腹部形成的C33A腫瘤達(dá)到50～80mm3時，將PBS中的5×107～1×108PFU的Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX腫瘤內(nèi)施用3次。注射3天后，取出腫瘤組織并制備其石蠟塊。將石蠟塊切成4μm切片并在二甲苯中然后在分級乙醇(100％、95％、80％和70％)中脫蠟，然后用蘇木精和伊紅染色。為了觀察膠原的分布，將結(jié)締組織組分，4μm石蠟包埋的切片用boulin、蘇木精和biebrich′s深紅酸性品紅染色。此外，進(jìn)行腺病毒六聯(lián)體區(qū)的免疫組織化學(xué)染色。將切片如上所述脫蠟并與原發(fā)抗腺病毒六聯(lián)體抗體AB1056F(Chemicon，Temecula，CA)培養(yǎng)，然后與次級山羊抗-大鼠IgG-HRP(SantaCruzBiotechnology，Inc.，SantaCruz，CA)培養(yǎng)。用DAB(DAKO，Carpinteria，加利福尼亞州)進(jìn)行顯色。為了觀察腫瘤中凋亡的發(fā)生，根據(jù)ApopTag試劑盒(Intergen，Purchase，NY)制造商說明書進(jìn)行TUNNEL試驗(yàn)。為了顯色，將細(xì)胞與過氧化物酶結(jié)合的抗生物素蛋白鏈菌素培養(yǎng)然后與二氨基聯(lián)苯胺(DAKO，Carpinteria，CA)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞的顏色變?yōu)樽厣珪r，將細(xì)胞用0.5％的甲基綠復(fù)染10分鐘并在顯微鏡下觀察。鼠B16BL6自發(fā)肺轉(zhuǎn)移模型自發(fā)轉(zhuǎn)移模型用于檢驗(yàn)施用松弛素基因?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移的作用。更具體而言，將B16BL6細(xì)胞(2×105/鼠)皮下施用到6-周齡雄性C57BL/6鼠(CharlesRiverKorea，首爾，韓國)的右后足墊。一旦腫瘤體積達(dá)到100～200mm3，將動物隨機(jī)分為3組(PBS、Ad-ΔE1B、Ad-ΔE1B-RLX)每組5只，開始處理。處理的第1天指定為1日，在1、3和5日，將腺病毒或PBS直接注射到腫瘤(50μlPBS中每個腫瘤5×108PFU)。在7日，在溫和麻醉下，將原發(fā)性腫瘤通過膝蓋以下切斷手術(shù)去除。在去除原發(fā)性腫瘤后25日，評估鼠肺中的轉(zhuǎn)移腫瘤病灶的重量。對瘢痕疙瘩細(xì)胞、細(xì)胞球形體和組織球形體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的評估為了評價表達(dá)松弛素的腺病毒對瘢痕疙瘩的治療功效，我們檢驗(yàn)了對瘢痕疙瘩細(xì)胞、細(xì)胞球形體和組織球形體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和病毒對組織的穿透效率。對瘢痕疙瘩細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率評估如下將從瘢痕疙瘩患者獲得的第二代的原代瘢痕疙瘩細(xì)胞系轉(zhuǎn)移到24-孔板然后以MOI為10或50的Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX病毒感染，然后在病毒感染2天后用X-gal染色。對瘢痕疙瘩細(xì)胞球形體的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率評估如下將瘢痕疙瘩組織從瘢痕疙瘩患者取出。將從取出的瘢痕組織獲得的1×105/ml的第二代原代細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)管并500×g離心5分鐘，然后將其在37℃培養(yǎng)。當(dāng)1～5天培養(yǎng)圓顆粒從管底脫落顯示為細(xì)胞球形體時，將球形體轉(zhuǎn)移到涂布0.75％瓊脂糖的48-孔板并加入150μlDMEM(含有5％FBS)，然后用1×107PFU的腺病毒感染球形體。病毒感染3天后，將瘢痕疙瘩球形體用固定液固定并用X-gal染色。在體視顯微鏡下觀察X-gal染色的球形體表面。對于腺病毒進(jìn)入球形體的穿透的觀察，將X-gal染色的瘢痕疙瘩球形體包埋在O.C.T.化合物中并快速冷凍。然后將10μm冷凍切片置于涂布明膠的載玻片上。病毒進(jìn)入瘢痕疙瘩組織球形體的穿透性分析如下將瘢痕疙瘩組織從瘢痕患者取出并切成1～2mm的切片。將切片在涂布0.75％瓊脂糖的培養(yǎng)箱中在含有5％FBS和青霉素/鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。每周一次或兩次更換所用的培養(yǎng)基并將瘢痕疙瘩組織培養(yǎng)一周以上。將直徑為2mm的瘢痕疙瘩組織球形體轉(zhuǎn)移到涂布0.75％瓊脂糖的48-孔板上并加入150μlDMEM(含有5％FBS)，然后用1×108PFU的腺病毒感染。病毒感染3天后，將瘢痕疙瘩撒組織用固定液固定并用X-gal染色。在體視顯微鏡下觀察X-gal染色的球形體的表面。為了觀察腺病毒進(jìn)入球形體的穿透性，將X-gal染色的瘢痕疙瘩球形體包埋在O.C.T.化合物中并快速冷凍。然后將10μm冷凍切片置于涂布明膠的載玻片上。統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)表示為平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。用StatView軟件(AbacusConcepts，Inc.，伯克利，加利福尼亞州)和Mann-Whitney試驗(yàn)(nonparametricranksumtest，非參量型秩總檢驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較。統(tǒng)計學(xué)顯著性的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。結(jié)果表達(dá)松弛素的腺病毒的構(gòu)建和松弛素的表達(dá)模式為了真實(shí)評估依賴于松弛素表達(dá)的進(jìn)入組織的穿透效率的變化，構(gòu)建表達(dá)作為報道基因的LacZ的復(fù)制缺陷型的d1-LacZ-RLX腺病毒。此外，構(gòu)建了腫瘤特異性溶瘤Ad-ΔE1B-RLX腺病毒以增強(qiáng)增殖型腺病毒進(jìn)入組織的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(圖1)。為了評估構(gòu)建的腺病毒的松弛素表達(dá)模式，以多種MOI的dl-LacZ、d1-LacZ-RLX、Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX腺病毒感染子宮頸癌細(xì)胞系C33A并將培養(yǎng)基回收用于ELISA(圖2)。作為復(fù)制缺陷型的腺病毒的負(fù)對照的d1-LacZ和作為腫瘤特異性溶瘤腺病毒的負(fù)對照的Ad-ΔE1B感染的細(xì)胞顯示不表達(dá)松弛素，而用d1-LacZ-RLX和Ad-ΔE1B-RLX感染的細(xì)胞顯示取決于施用腺病毒的滴度的松弛素的劑量依賴性表達(dá)。使用腫瘤球形體的d1-LacZ-RLX腺病毒進(jìn)入體外腫瘤組織的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的評估為了評估d1-LacZ-RLX進(jìn)入腫瘤球形體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和組織穿透性，將多種人腫瘤細(xì)胞系皮下注射到裸鼠中并且一旦腫瘤體積達(dá)到150～200mm3，將新鮮的腫瘤組織取出。將取出的腫瘤組織切成1～2mm碎片并用1×106、1×107或1×108PFU的腺病毒感染。感染48小時后用X-gal染色。與用1×106PFU的d1-LacZ處理相比，相同劑量的d1-LacZ-RLX在腫瘤球形體表面顯示更強(qiáng)的X-gal染色。1×107或1×108PFU的d1-LacZ-RLX在腫瘤球形體的所有表面顯示更深的X-gal染色。為了準(zhǔn)確研究腺病毒進(jìn)入腫瘤球形體的穿透性，將X-gal染色的腫瘤球形體切開用于觀察。1×106、1×107或1×108PFU的d1-LacZ在腫瘤組織中顯示弱LacZ表達(dá)，且其擴(kuò)散局限于腫瘤球形體的表面。相反，相同劑量的d1-LacZ-RLX顯示高很多的LacZ表達(dá)水平且其擴(kuò)散延伸到腫瘤球形體的內(nèi)部(圖3)。該結(jié)果清楚地表明在腫瘤球形體的三維結(jié)構(gòu)中，表達(dá)松弛素的d1-LacZ-RLX腺病毒以比對照載體d1-LacZ高的效率轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)散到球形體的核心。體內(nèi)腫瘤塊中d1-LacZ-RLX腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的評估為了研究在體外腫瘤球形體中觀察到的dl-LacZ-RLX的增強(qiáng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和病毒擴(kuò)散是否引起體內(nèi)lacZ基因送遞到腫瘤塊提高，使用了腫瘤異種移植物模型。將5×107或1×108PFU的d1-LacZ或d1-LacZ-RLX腺病毒腫瘤內(nèi)注射到在裸鼠腹部形成的腫瘤塊中。3天后，取出腫瘤并進(jìn)行切片用于X-gal染色。dl-LacZ顯示低水平的LacZ表達(dá)并且染色區(qū)集中在病毒注射部位，而d1-LacZ-RLX顯示高很多的LacZ表達(dá)并且發(fā)現(xiàn)染色區(qū)廣泛分布在病毒注射部位之外的其它區(qū)域(圖4)。尤其是，由于在所有腫瘤組織強(qiáng)烈的LacZ表達(dá)，所以用d1-LacZ-RLX轉(zhuǎn)導(dǎo)的U87MG和C33A腫瘤塊顯示深藍(lán)色。這些表達(dá)圖式說明與沒有表達(dá)松弛素的d1-LacZ對照病毒相比，在體內(nèi)腫瘤塊中d1-LacZ-RLX的穿透性和擴(kuò)散增強(qiáng)。表達(dá)松弛素的溶瘤腺病毒的腫瘤細(xì)胞殺傷作用的評估為了揭示表達(dá)松弛素的腺病毒的穿透性和擴(kuò)散提高有助于提高腫瘤特異性溶瘤腺病毒的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，進(jìn)行了CPE試驗(yàn)。用MOI為0.1～10的d1-LacZ(負(fù)對照)、Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX腺病毒感染各人腫瘤細(xì)胞系(U343、U87MG、C33A、Hep3B和A549)并對產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞殺傷作用進(jìn)行分析。如圖5所示，負(fù)對照d1-LacZ在各種腫瘤細(xì)胞系中引起很小的或不引起細(xì)胞殺傷作用，而Ad-ΔE1B-RLX顯示比不表達(dá)松弛素的Ad-ΔE1B的腫瘤殺傷作用高約2～10倍。尤其是，在Hep3B細(xì)胞系中，Ad-ΔE1B-RLX腺病毒顯示比Ad-ΔE1B高約10倍的殺腫瘤作用，并且在U87MG、C33A和A549細(xì)胞系中，Ad-ΔE1B-RLX顯示比Ad-ΔE1B高約5倍的殺腫瘤作用。根據(jù)結(jié)果，可理解松弛素的表達(dá)沒有減弱腺病毒的復(fù)制能力并且有助于顯著提高腺病毒的殺腫瘤作用。表達(dá)松弛素的溶瘤腺病毒的空斑形成為了顯現(xiàn)松弛素表達(dá)對致細(xì)胞病變能力和病毒擴(kuò)散到周圍細(xì)胞的作用，比較了含有瓊脂糖的固體培養(yǎng)基中的空斑形成。用MOI為3的Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX腺病毒感染Hep3B細(xì)胞然后分析空斑形成。如圖6所示，對用Ad-ΔE1B-RLX感染的Hep3B細(xì)胞形成空斑的時間短于用Ad-ΔE1B感染的細(xì)胞。此外，在用Ad-ΔE1B-RLX感染的Hep3B細(xì)胞中形成的空斑的大小大于用Ad-ΔE1B感染的Hep3B細(xì)胞。更具體而言，用Ad-ΔE1B，感染后16天觀察到空斑，而對于Ad-ΔE1B-RLX感染后早到4天就形成空斑。這些結(jié)果表明，由于增強(qiáng)溶瘤活性和病毒向周圍細(xì)胞擴(kuò)散，表達(dá)松弛素的腺病毒引起較短時間內(nèi)形成大很多的空斑由表達(dá)松弛素的腺病毒誘導(dǎo)的凋亡顯示復(fù)制缺陷型的腺病毒d1-LacZ-RLX誘導(dǎo)從培養(yǎng)板底部脫落的細(xì)胞的死亡。因此，我們檢驗(yàn)松弛素的表達(dá)是否是致細(xì)胞病變作用的原因。首先，為了確定松弛素是否誘導(dǎo)凋亡，在PI染色后進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)測定以分析由于凋亡含有隨機(jī)片段DNA的subG1細(xì)胞群的增加率。將人腫瘤細(xì)胞系代表用Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX腺病毒感染并在感染后48～96小時收獲用于測定subG1細(xì)胞群的增加(圖7)。CPT-11用作誘導(dǎo)凋亡的正對照。對于A549細(xì)胞，Ad-ΔE1B誘導(dǎo)約3.11％的subG1細(xì)胞群而Ad-ΔE1B-RLX引起subG1細(xì)胞群顯著增加22.90％。在其它細(xì)胞系(U343、U87MG、C33A和Hep3B)中也觀察到此種增加的subG1細(xì)胞群。此外，為了準(zhǔn)確檢驗(yàn)松弛素表達(dá)對細(xì)胞殺傷效力的作用，通過膜連蛋白-V和PI雙重染色評估通過Ad-ΔE1B-RLX誘導(dǎo)的凋亡的進(jìn)程。膜連蛋白-V作為凋亡的早期標(biāo)記用于檢測磷脂酰絲氨酸(PS)到外膜小葉的易位，和PI作為凋亡的晚期標(biāo)記用于通過與核染色質(zhì)結(jié)合鑒定壞死。因此，膜連蛋白-V-/PI-膜連蛋白-V+/PI-和PI+分別表示健康、凋亡和壞死細(xì)胞。在CPT-處理的C33A細(xì)胞中，57.10％(膜連蛋白-V+/PI-)的細(xì)胞是凋亡的，而用Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX感染的細(xì)胞分別顯示21.99％和33.03％的凋亡率，表明與Ad-ΔE1B相比，Ad-ΔE1B-RLX腺病毒誘導(dǎo)更強(qiáng)的凋亡率(圖8)。對于包括U343、U87MG、Hep3B和A549的其它細(xì)胞系，表達(dá)松弛素的腺病毒較Ad-ΔE1B腺病毒顯示更高的凋亡率。此外，說明Ad-ΔE1B-RLX反映全部細(xì)胞死亡的凋亡和壞死(膜連蛋白-V+/PI-和PI+)的總量比Ad-ΔE1B高得多?？偠灾?，這些結(jié)果促使我們推論Ad-ΔE1B-RLX腺病毒引起比Ad-ΔE1B更高的凋亡率，從而Ad-ΔE1B-RLX比Ad-ΔE1B更經(jīng)常發(fā)生細(xì)胞死亡。進(jìn)行了TUNNEL試驗(yàn)以鑒定作為早期凋亡特征的DNA片段。圖9中顯示幾乎所有用CPT處理作為正對照的細(xì)胞染色為深棕色，表明發(fā)生了活躍的凋亡。32.5±12.5％的感染Ad-ΔE1B的U343細(xì)胞顯示淺棕色和69.7±5.40％的感染Ad-ΔE1B-RLX的細(xì)胞顯示深棕色，表明Ad-ΔE1B-RLX比Ad-ΔE1B誘導(dǎo)凋亡的效力高(表1)。在其它腫瘤細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)此種增加的凋亡。表1表達(dá)松弛素的溶瘤腺病毒體內(nèi)抗腫瘤作用的評估為了研究表達(dá)松弛素的Ad-ΔE1B-RLX的體內(nèi)抗腫瘤作用，隔日3次用5×107～1×108PFU的Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX感染裸鼠形成腫瘤異種移植物并且觀察腫瘤的生長模式。對于人腦腫瘤U87MG，負(fù)對照PBS引起腫瘤的顯著生長至1089±167.22mm3，而Ad-ΔE1B和Ad-ΔE1B-RLX分別引起腫瘤生長的顯著抑制至115.70±119.60mm3和55.63±28.42mm3(圖10)。換言之，用Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX腺病毒處理的腫瘤顯示比用PBS處理的腫瘤高10～30倍的抗腫瘤作用。處理后25天后，用PBS處理的9只小鼠全部死亡。感染后33天后，Ad-ΔE1B和Ad-ΔE1B-RLX腺病毒引起腫瘤的體積分別為399.68±96.95mm3和64.51±36.73mm3，推論表達(dá)松弛素的腺病毒比Ad-ΔE1B具有更強(qiáng)的抗腫瘤效力。令人驚奇地，在病毒感染后19天，Ad-ΔE1B-RLX腺病毒完全根除7只小鼠中的2只的腫瘤并且在感染后41天去除5只小鼠的腫瘤。并且，甚至在感染后60天沒有觀察到腫瘤的再生長。為了檢驗(yàn)Ad-ΔE1B-RLX的這種優(yōu)異的抗腫瘤作用是否在其它人腫瘤細(xì)胞中也是真實(shí)的，對C33A、A549、Hep3B和U343異體移植物進(jìn)行了抗腫瘤作用分析。如圖10所示，施用腫瘤特異性溶瘤Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX腺病毒的組比用PBS處理的組顯示更顯著的抗腫瘤作用。用表達(dá)松弛素的腺病毒處理的腫瘤的腫瘤塊的體積比用Ad-ΔE1B處理小得多。這些結(jié)果表明松弛素的表達(dá)顯著提高抗腫瘤作用。尤其是，處理后32天，與用Ad-ΔE1B和Ad-ΔE1B-RLX處理同期分別達(dá)到平均腫瘤體積917±354mm3和77±27mm3相比，用PBS對照處理的具有C33A的小鼠顯示平均腫瘤體積為2252±1392mm3。在消退方面，處理后45天，與用Ad-ΔE1B-RLX處理的小鼠中看到的50％完全消退相比，25％的小鼠顯示用Ad-ΔE1B處理的腫瘤完全消退。檢驗(yàn)了表達(dá)松弛素的腺病毒處理的荷瘤小鼠的存活率(圖11)。對于C33A荷瘤小鼠，處理開始后80天，用Ad-ΔE1B-RLX處理的動物100％仍有活力，而同期用Ad-ΔE1B處理的動物只有50％有活力。此外，甚至在處理后6周，50％的用Ad-ΔE1B-RLX處理的動物仍完全無腫瘤。類似地，在檢驗(yàn)的所有其它異種移植物模型(U343、U87MG、Hep3B和A549)中獲得了Ad-ΔE1B-RLX誘導(dǎo)的存活益處。相對于彼此，在所有檢測的異種移植物模型中，用Ad-ΔE1B-RLX處理的荷瘤小鼠比那些用Ad-ΔE1B處理的荷瘤小鼠存活長得多。在研究過程中，沒有觀察到如腹瀉、體重減輕或惡病質(zhì)的系統(tǒng)毒性。這些結(jié)果表明Ad-ΔE1B-RLX可賦予顯著的存活益處和體內(nèi)腫瘤減少。由表達(dá)松弛素的增殖型腺病毒誘導(dǎo)的腫瘤特征的變化3次用Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX感染在裸鼠腹部形成的人子宮頸腫瘤細(xì)胞系C33A。注射3天后，取出腫瘤組織并用蘇木精和伊紅染色用于組織學(xué)鑒定(圖12)。Ad-ΔE1B-RLX處理的腫瘤中的壞死灶主要在腫瘤塊的外周發(fā)現(xiàn)，而Ad-ΔE1B處理的腫瘤的壞死灶幾乎不能檢測到，如果存在，在腫瘤塊的中央發(fā)現(xiàn)。然后通過使用腺病毒六聯(lián)體蛋白特異的抗體的免疫組織化學(xué)證實(shí)腫瘤塊內(nèi)病毒的持續(xù)性和分布。如圖12所示，主要在遭遇壞死的腫瘤的外周檢測到Ad-ΔE1B-RLX腺病毒。TUNNEL試驗(yàn)顯示在與壞死相同的區(qū)域活躍地發(fā)生凋亡。相反，如果可檢測到，Ad-ΔE1B在腫瘤中央誘導(dǎo)壞死?？偠灾?，可認(rèn)識到Ad-ΔE1B-RLX腺在病毒注射位點(diǎn)活躍地復(fù)制，有助于誘導(dǎo)凋亡和壞死。采用Masson三色染色的腫瘤塊中膠原分布研究3次用Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX感染裸鼠腹部形成的人腦腫瘤細(xì)胞系U343，注射3天后，取出腫瘤組織并用Masson三色染色以分析細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分膠原的分布(染成藍(lán)色)。用PBS或Ad-ΔE1B處理的腫瘤由高含量的膠原(藍(lán)色染色)組成。顯著地對比，用Ad-ΔE1B-RLX處理的腫瘤顯示無膠原，表明松弛素的表達(dá)顯著降低腫瘤塊內(nèi)膠原含量。有趣的是，用Ad-ΔE1B-RLX處理的腫瘤被結(jié)締組織包裹，并且只在腫瘤和正常組織之間的邊界發(fā)現(xiàn)藍(lán)色染色(圖13)。通過表達(dá)松弛素的溶瘤腺病毒抑制腫瘤轉(zhuǎn)移已知抑制松弛素誘導(dǎo)可能增強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力的MMP的表達(dá)。為了證實(shí)這個假說，我們用自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型評估了表達(dá)松弛素的溶瘤腺病毒對腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，其中，在C57BL/6小鼠的足墊將B16BL16黑色素瘤細(xì)胞皮下植入以形成局部原發(fā)性腫瘤。一旦腫瘤體積達(dá)到100～200mm3，將動物隔日3次用PBS、Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX處理。第5天，在溫和麻醉下通過切除膝蓋以下手術(shù)去除原發(fā)性腫瘤。原發(fā)性腫瘤除去后第20天，測量小鼠肺中轉(zhuǎn)移腫瘤灶的重量以評估向遠(yuǎn)緣器官的轉(zhuǎn)移。如圖14所示，與PBS-處理對照組(268±0.27mg)相比，來自用Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX處理的小鼠的平均相關(guān)腫瘤負(fù)荷分別為48±0.05mg和10±0.01mg。此外，在6只處理小鼠的4只中，Ad-ΔE1B或Ad-ΔE1B-RLX均完全抑制轉(zhuǎn)移性病灶的形成。這些數(shù)據(jù)表明，在原發(fā)性腫瘤部位腫瘤內(nèi)注射表達(dá)松弛素的溶瘤腺病毒可以極大地防止并且不增強(qiáng)遠(yuǎn)緣部位轉(zhuǎn)移性病灶的形成。表達(dá)松弛素的腺病毒進(jìn)入瘢痕疙瘩的穿透性和轉(zhuǎn)導(dǎo)以上描述的數(shù)據(jù)(尤其是，來自Masson’s三色染色的腫瘤塊的膠原分布的數(shù)據(jù))清楚地表明松弛素的表達(dá)顯著降低腫瘤塊中的膠原含量。瘢痕疙瘩是由細(xì)胞外基質(zhì)廣泛形成引起的一種病癥。為了評價表達(dá)松弛素的腺病毒對瘢痕疙瘩的治療效力，將從瘢痕疙瘩患者獲得的原代瘢痕疙瘩細(xì)胞系用MOI為10或50的d1-LacZ或d1-LacZ-RLX腺病毒感染并在2天后進(jìn)行X-gal染色。結(jié)果，用d1-LacZ-RLX感染比用d1-LacZ感染顯示更強(qiáng)的LacZ表達(dá)，表明松弛素的表達(dá)負(fù)責(zé)進(jìn)入瘢痕疙瘩細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高(圖15)。此外，我們用瘢痕疙瘩細(xì)胞球形體檢驗(yàn)表達(dá)松弛素的腺病毒的組織穿透性。為了證實(shí)表達(dá)松弛素的腺病毒進(jìn)入瘢痕疙瘩組織的提高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，將用來自瘢痕疙瘩患者的原代瘢痕疙瘩細(xì)胞制備的瘢痕疙瘩細(xì)胞球形體用1×107PFU的d1-LacZ或d1-LacZ-RLX腺病毒感染并進(jìn)行X-gal染色用于顯微鏡觀察。在瘢痕細(xì)胞球形體的表面用d1-LacZ-RLX比用d1-LacZ顯示更強(qiáng)的染色(圖15)。為了檢驗(yàn)用瘢痕疙瘩細(xì)胞球形體顯示的d1-LacZ-RLX的增強(qiáng)的傳導(dǎo)效率是否在來自患者的瘢痕疙瘩組織中也能重復(fù)，將來自患者的瘢痕組織用1×108PFU的d1-LacZ或d1-LacZ-RLX感染并進(jìn)行X-gal染色用于顯微鏡觀察(圖15)。d1-LacZ處理的瘢痕組織顯示弱LacZ表達(dá)，而d1-LacZ-RLX處理的瘢痕疙瘩組織為強(qiáng)烈的X-gal染色。此外，為了評價腺病毒進(jìn)入瘢痕疙瘩組織的穿透性，將感染的組織包埋在O.C.T.化合物中并快速冷凍。用d1-LacZ感染的瘢痕疙瘩組織的內(nèi)部與它們的表面為非常弱的染色。極大的相反，對于用d1-LacZ-RLX感染的組織，LacZ表達(dá)的分布廣泛得多并在不局限于在注射部位的整個球形體觀察到(圖15)。這些數(shù)據(jù)清楚地顯示誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)破壞的表達(dá)松弛素的腺病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在瘢痕疙瘩組織中顯著增強(qiáng)，表明表達(dá)松弛素的腺病毒是治療瘢痕疙瘩病癥的有前途的治療劑。工業(yè)適用性本發(fā)明提供一種新的基因送遞系統(tǒng)和包括松弛素編碼序列的重組腺病毒、一種使用所述基因送遞系統(tǒng)的基因送遞方法、一種包括所述重組腺病毒的抗腫瘤藥物組合物、一種特征為改善的組織穿透效力的藥物組合物和一種用于治療與過量細(xì)胞外基質(zhì)累積相關(guān)的疾病或病癥的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明，松弛素負(fù)責(zé)改善傳導(dǎo)效力和凋亡能力以顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞殺傷能力。已描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)理解落入本發(fā)明的精神中的其變化和修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員可為顯而易見的，并且通過所附權(quán)利要求書及其等同物確定本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.一種包括待投送到細(xì)胞中的目的核苷酸序列的基因送遞系統(tǒng)，其特征在于，包括增強(qiáng)目的核苷酸序列進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的編碼松弛素的核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1的基因送遞系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞為通過細(xì)胞外基質(zhì)互相連接的細(xì)胞構(gòu)成的組織中的細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2的基因送遞系統(tǒng)，其中所述組織為腫瘤組織。4.根據(jù)權(quán)利要求1的基因送遞系統(tǒng)，其中所述基因送遞系統(tǒng)為質(zhì)粒、重組腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒、脂質(zhì)體或新核蛋白體。5.根據(jù)權(quán)利要求4的基因送遞系統(tǒng)，其中所述基因送遞系統(tǒng)為重組腺病毒。6.根據(jù)權(quán)利要求1的基因送遞系統(tǒng)，其中所述重組腺病毒包括缺失的E3區(qū)并將編碼松弛素的核苷酸序列插入到缺失的E3區(qū)。7.一種將基因投送到細(xì)胞中的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項的基因送遞系統(tǒng)與含有細(xì)胞的生物樣品接觸。8.一種重組腺病毒，其包括腺病毒ITR(反向末端重復(fù)序列)核苷酸序列和編碼松弛素的核苷酸序列，其中表達(dá)的松弛素蛋白增強(qiáng)重組腺病毒進(jìn)入腫瘤組織的穿透效力和重組腺病毒感染的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡。9.根據(jù)權(quán)利要求8的重組腺病毒，其中，所述重組腺病毒包括缺失的E3區(qū)并且將編碼松弛素的核苷酸序列插入到缺失的E3區(qū)。10.根據(jù)權(quán)利要求8的重組腺病毒，其中所述重組腺病毒包含失活的E1B19基因、失活的E1B55基因或失活的E1B19/E1B55基因。11.根據(jù)權(quán)利要求8的重組腺病毒，其中所述重組腺病毒包括有活性的E1A基因。12.一種用于治療癌癥的抗腫瘤藥物組合物，其包括(a)治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求8～11中任一項的重組腺病毒；和(b)可藥用載體。13.一種用于治療癌癥的方法，其包括向動物施用權(quán)利要求12的抗腫瘤藥物組合物。14.一種用于改善藥物進(jìn)入組織的穿透效力的藥物組合物，其包含(a)改善藥物組合物進(jìn)入組織的穿透效力的松弛素蛋白；和(b)可藥用載體。15.用于治療與過量細(xì)胞外基質(zhì)累積相關(guān)的疾病或病癥的藥物組合物，其包含(a)治療有效量的松弛素蛋白或包含編碼松弛素的核苷酸序列的基因送遞系統(tǒng)；和(b)可藥用載體。16.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，其中，與過量細(xì)胞外基質(zhì)累積相關(guān)的疾病或病癥為瘢痕、肝硬化、肺纖維樣變性、腎小球腎炎、成人或急性呼吸困難、肝纖維樣變性、腎纖維樣變性、心肌梗塞后的心肌纖維發(fā)生、纖維囊腫病、纖維樣變性癌、靜脈閉塞綜合征或腎基質(zhì)纖維樣變性。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的基因送遞系統(tǒng)和包括松弛素編碼序列以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的重組腺病毒，一種包括所述重組腺病毒的抗腫瘤藥物組合物，一種具有改善的組織穿透效力的藥物組合物和一種用于治療與過量的細(xì)胞外基質(zhì)累積相關(guān)的疾病或病癥的藥物組合物。文檔編號A61K38/00GK1968717SQ200580010710公開日2007年5月23日申請日期2005年3月30日優(yōu)先權(quán)日2004年3月30日發(fā)明者尹彩鈺,金周恒申請人:延世大學(xué)工業(yè)教產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)