改良型腈水合酶的制作方法
【專利摘要】通過野生型腈水合酶的改良，提供耐熱性、酰胺化合物耐性以及高溫累積性進一步提高了的具有腈水合酶活性的蛋白質(zhì)。使用一種蛋白質(zhì)，其為以下的(A)或(B)的蛋白質(zhì)；(A)蛋白質(zhì)，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中特定的氨基酸殘基被置換為其他的氨基酸殘基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；(B)蛋白質(zhì)，其特征在于，包含在上述(A)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中除了上述特定的氨基酸殘基之外缺失、置換和/或附加有1個或數(shù)個氨基酸殘基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。
【專利說明】改良型腈水合酶
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及改良型(變異型)的腈水合酶及其制造方法。進而涉及編碼該酶的基因DNA、包含該基因DNA的重組載體、和具有該重組載體的轉(zhuǎn)化體以及酰胺化合物的制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年發(fā)現(xiàn)了酶腈水合酶、即具有將腈基水合并轉(zhuǎn)換為酰胺基的腈水合活性的酶，公開了使用該酶或含有該酶的微生物菌體等通過腈化合物而制造對應(yīng)的酰胺化合物的方法。已知該制造方法與現(xiàn)有的化學(xué)合成法相比較，由腈化合物向?qū)?yīng)的酰胺化合物的轉(zhuǎn)化率和選擇率高。
[0003]作為生產(chǎn)腈水合酶的微生物，可列舉出例如:屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)等的微生物。其中，玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) Jl株用于丙烯酰胺的工業(yè)生產(chǎn)中，其有用性已被證實。另外，編碼該菌株所產(chǎn)生的腈水合酶的基因也已明確(參照專利文獻I)。
[0004]另一方面，不僅利用由自然界中存在的微生物分離的腈水合酶、其基因，還出于改變腈水合酶的活性、底物特異性、Vmax, Km、熱穩(wěn)定性、對底物的穩(wěn)定性、對生成物的穩(wěn)定性等目的，嘗試了向腈水合酶中導(dǎo)入變異(參照專利文獻2)，本發(fā)明人等取得了使耐熱性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水合酶基因(參照專利文獻3和4)。
[0005]但是，從催化劑成本等生產(chǎn)成本的觀點出發(fā)，開發(fā)耐熱性和酰胺化合物耐性更進一步提高、或在高溫下能夠反應(yīng)的腈水合酶并用于酰胺化合物的制造是非常有用的；從反應(yīng)時的酶量的削減和成本削減等觀點出發(fā)，期望開發(fā)而獲得具有這樣的性能的酶。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1:日本專利第3162091號公報
[0009]專利文獻2:國際公開第2004/056990號小冊子
[0010]專利文獻3:國際公開第2005/116206號小冊子
[0011]專利文獻4:日本特開2007-143409號公報

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明要解決的問題
[0013]因此，本發(fā)明的目的在于通過腈水合酶的改良，提供耐熱性、酰胺化合物耐性以及高溫累積性進一步提高了的具有腈水合酶活性的蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明的目的在于提供編碼該蛋白質(zhì)的基因DNA、包含該基因DNA的重組載體、包含該重組載體的轉(zhuǎn)化體、從該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中提取的腈水合酶及其制造方法。進而，本發(fā)明的目的在于提供使用了該培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物的酰胺化合物的制造方法。[0014]用于解決問題的方案
[0015]本發(fā)明人等為了解決上述問題進行了深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在野生型腈水合酶的氨基酸序列中將特定的氨基酸殘基置換為其他的氨基酸殘基而成的蛋白質(zhì)不僅具有腈水合酶活性，耐熱性、酰胺化合物耐性和高溫累積性也提高了，至此完成本發(fā)明。
[0016]即，本發(fā)明如下。
[0017](I)以下(A)或⑶的蛋白質(zhì)；
[0018](A)蛋白質(zhì)，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、
(C)、(d)和(e)的氨基酸殘基被置換為其他的氨基酸殘基、進而選自由下述(f)~(q)所組成的組的至少一個氨基酸殘基被置換為其他的氨基酸殘基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；
[0019](a) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)167殘基下游的氨基酸殘基、
[0020](b) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)219殘基下游的氨基酸殘基、
[0021](c) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)57殘基下游的氨基酸殘基、
[0022](d) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)114殘基下游的氨基酸殘基、
[0023](e) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)107殘基下游的氨基酸殘基、
[0024](f) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)218殘基下游的氨基酸殘基、
[0025](g) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)190殘基下游的氨基酸殘基、
[0026](h) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)168殘基下游的氨基酸殘基、
[0027](?) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)144殘基下游的氨基酸殘基、
[0028](j) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)133殘基下游的氨基酸殘基、
[0029](k) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)112殘基下游的氨基酸殘基、
[0030](I) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)105殘基下游的氨基酸殘基、
[0031](m) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)95殘基下游的氨基酸殘基、
[0032](η) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)17殘基下游的氨基酸殘基、
[0033](ο) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)15殘基下游的氨基酸殘基、
[0034](p) α亞基的氨基酸序列中，由構(gòu)成輔基結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游側(cè)的C殘基起67殘基下游的氨基酸殘基、
[0035](q) α亞基的氨基酸序列中，由構(gòu)成輔基結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游側(cè)的C殘基起17殘基下游的氨基酸殘基、
[0036](B)蛋白質(zhì)，其特征在于，包含在(A)蛋白質(zhì)的氨基酸序列中除了前述置換后的氨基酸殘基之外缺失、置換和/或附加有I個或數(shù)個氨基酸殘基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。
[0037](2) 一種DNA，其編碼(I)所述的蛋白質(zhì)。
[0038](3) 一種重組載體，其包含(2)所述的基因DNA。[0039](4) 一種轉(zhuǎn)化體，其包含(3)所述的重組載體。
[0040](5) 一種腈水合酶，是從培養(yǎng)⑷所述的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物中提取的。
[0041](6) 一種腈水合酶的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)⑷所述的轉(zhuǎn)化體，從得到的培養(yǎng)物中提取腈水合酶。
[0042](7) 一種酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使⑴所述的蛋白質(zhì)或培養(yǎng)⑷所述的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物與腈化合物接觸。
[0043]發(fā)明的效果
[0044]本發(fā)明能夠提供耐熱性、酰胺化合物耐性和高溫累積性提高了的新型的改良型(變異型)腈水合酶。耐熱性、酰胺化合物耐性和高溫累積性均進一步提高了的該改良型腈水合酶由于酰胺化合物的制造效率變高而非常有用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1為質(zhì)粒pER855A的結(jié)構(gòu)圖。
[0046]圖2-1為表示來源于各種微生物的野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列的圖。
[0047]圖2-2為表示來源于各種微生物的野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列的圖(接著圖2-1)。
[0048]圖3-1為表示來源于各種微生物的野生型腈水合酶的α亞基的氨基酸序列的圖。
[0049]圖3-2為表示來源于各種微生物的野生型腈水合酶的α亞基的氨基酸序列的圖(接著圖3-1)。
【具體實施方式】
[0050]以下，詳細地說明本發(fā)明。
[0051]需要說明的是，本說明書中，除了特別表明的情況，“上游”和“上游側(cè)”在涉及氨基酸序列時意味著“N末端側(cè)”，在涉及堿基序列時意味著“5’末端側(cè)”。
[0052]另外，“下游”和“下游側(cè)”涉及氨基酸序列時意味著“C末端側(cè)”，涉及堿基序列時意味著“3”。
[0053]1.改良型腈水合酶
[0054](a)野生型腈水合酶
[0055]本發(fā)明的改良型腈水合酶為野生型腈水合酶的改良型，對于其來源沒有特別地限定。此處，“野生型腈水合酶”是指由自然界的生物(例如:土壤細菌等微生物)分離而得到的腈水合酶；意味著構(gòu)成該酶的氨基酸序列、以及編碼該酶的基因的堿基序列沒有人為地缺失或插入，或者沒有被其他的氨基酸或堿基置換而保持天然來源特性的狀態(tài)的腈水合酶。
[0056]另外，不僅是已知的微生物來源的腈水合酶，只由未限定生物來源的DNA序列限定的腈水合酶也包含于上述“野生型腈水合酶”中。
[0057]“野生型腈水合酶”采取由α亞基和β亞基的結(jié)構(gòu)域締合而成的高級結(jié)構(gòu)，具有非血紅素鐵原子或非咕啉核鈷原子作為輔基。這些腈水合酶分別以鐵型腈水合酶和鈷型腈水合酶的稱呼加以區(qū)分。
[0058]作為鐵型腈水合酶，可列舉出來源于紅球菌屬Ν-771株的腈水合酶作為其代表例。通過進行X射線結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析，該鐵型腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)變得明確。結(jié)果，該酶介由形成活性中心的α亞基的半胱氨酸簇(:序列號61)中的4個氨基酸殘基而與非血紅素鐵
結(jié)合 ?
[0059]作為鈷型腈水合酶，可列舉出來源于玫瑰色紅球菌Jl株(以下有時稱為“ Jl菌”)的鈷型腈水合酶，或來源于嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的鈷型腈水合酶作為代表例。來源于Jl菌的鈷型腈水合酶介由形成活性中心的α亞基的半胱氨酸簇(:序列號62)所示的區(qū)域而與鈷原子結(jié)合。需要說明的是，來源于嗜熱假諾卡氏菌的鈷型腈水合酶的半胱氨酸簇中，上述來源于Jl菌的半胱氨酸簇中的上游側(cè)(N末端側(cè))起第4位的半胱氨酸(Cys)為半胱亞磺酸(Csi),最下游側(cè)(C末端側(cè))的第6位的半胱氨酸(Cys)為半胱次磺酸(Cse)。
[0060]如上所述，輔基與α亞基中的半胱氨酸簇“C(S/T)LCSC”(序列號61和62)所示的區(qū)域結(jié)合。作為包含這樣的輔基結(jié)合區(qū)域的腈水合酶，可列舉出例如:具有來源于玫瑰色紅球菌 Jl (FERM BP-1478)、玫瑰色紅球菌M8 (SU1731814)、玫瑰色紅球菌M33 (VKM Ac_1515D)、玫瑰色紅球菌ATCC39484 (日本特開2001-292772)、史密斯芽孢桿菌(Bacillus smithii)(日本特開平9-248188)、嗜熱假諾卡氏菌(日本特開平9-275978)或熱葡糖苷地芽孢桿菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的氨基酸序列的腈水合酶以及來源于上述菌的基因序列所編碼的腈水合酶。
[0061]將來源于各種微生物的野生型腈水合酶的α亞基的氨基酸(單字符號)序列的比對不于圖3_1和圖3_2中。需要說明的是，在圖3_1、3_2中，從上方的氨基酸序列起依次表不序列號4、和49~60。
[0062]另一方面，認為β亞基的功能涉及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。將來源于各種微生物的野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸(單字符號)序列的比對示于圖2-1和圖2-2中。需要說明的是，在圖2-1、2-2中，從上方的氨基酸序列起依次表示序列號2、和35~48。
[0063](b)改良型腈水合酶
[0064]本發(fā)明為對野生型腈水合酶實施了氨基酸置換的改良型(變異型)腈水合酶。成為實施置換的對象的野生型腈水合酶的氨基酸序列由GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)等NCBI的數(shù)據(jù)庫公布。
[0065]例如:來源于玫瑰色紅球菌J1(FERMBP_1478)的α亞基的氨基酸序列如序列號4所示，堿基序列如序列號3所示。另外，β亞基的氨基酸序列如序列號2所示，堿基序列如序列號I所示，登錄號為“P21220”。另外，來源于玫瑰色紅球菌M8(SU1731814)的α亞基的登錄號為“ΑΤΤ79340”，β亞基的登錄號為“ΑΑΤ79339”。進而，來源于嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila) JCM3095 的 α 亞基的登錄號為 “1IRE Α”, β 亞基的登錄號為 “1IREB”。
[0066]另外，由在特定的氨基酸殘基被置換的氨基酸序列中缺失、置換和/或附加有I個或數(shù)個(例如I個~10個左右、優(yōu)選為I個~5個左右)氨基酸殘基(其中，除了上述置換后的基酸殘基之外)的氨基酸序列構(gòu)成且具有腈水合酶活性的改良型腈水合酶也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0067]作為本發(fā)明中的“改良型腈水合酶”可列舉出一種蛋白質(zhì)，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的氨基酸殘基被置換為其他的氨基酸殘基，進而選自由下述(f)~(q)所組成的組的至少一個氨基酸殘基被置換為其他的氨基酸殘基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。需要說明的是，下述(d)、(e)、 (f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(I)、(m)、(η)、(ο)、(ρ)和(q)的氨基酸殘基在各種野生型腈水合酶中也分別優(yōu)選為來源于屬于玫瑰色紅球菌種的細菌的野生型腈水合酶的氨基酸序列中的氨基酸殘基。
[0068](a) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)167殘基下游的氨基酸殘基。
[0069](b) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)219殘基下游的氨基酸殘基。
[0070](c) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)57殘基下游的氨基酸殘基。
[0071](d) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)114殘基下游的氨基酸殘基。
[0072](e) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)107殘基下游的氨基酸殘基。
[0073](f) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)218殘基下游的氨基酸殘基。
[0074](g) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)190殘基下游的氨基酸殘基。
[0075](h) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)168殘基下游的氨基酸殘基。
[0076](?) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)144殘基下游的氨基酸殘基。
[0077](j) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)133殘基下游的氨基酸殘基。
[0078](k) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)112殘基下游的氨基酸殘基。
[0079](I) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)105殘基下游的氨基酸殘基。[0080](m) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)95殘基下游的氨基酸殘基。
[0081](η) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)17殘基下游的氨基酸殘基。
[0082](ο) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)15殘基下游的氨基酸殘基。
[0083](ρ) α亞基的氨基酸序列中，由構(gòu)成輔基結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游側(cè)的C殘基起67殘基下游的氨基酸殘基。
[0084](q) α亞基的氨基酸序列中，由構(gòu)成輔基結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游側(cè)的C殘基起17殘基下游的氨基酸殘基。
[0085]另外，作為本發(fā)明的改良型腈水合酶，優(yōu)選列舉上述蛋白質(zhì)中被置換的氨基酸殘基為以下所列舉的氨基酸殘基的腈水合酶。
[0086](I)上述(a)~(e)、和(η)的氨基酸殘基。
[0087](2)選自上述(a)~(e)、和(η)的氨基酸殘基、以及選自上述(g)~(j)、(I)、(m)、(ο)和(q)所組成的組的至少一個氨基酸殘基。
[0088](3)上述(a)~(e)、(η)、⑴、和(ρ)的氨基酸殘基。
[0089](4)上述(a)~(e)、(η)、(ρ)、和(f)的氨基酸殘基。
[0090](5)上述(a)~(e)、(η)、⑴、(ρ)的氨基酸殘基、以及選自由上述(f)、(k)和(m)所組成的組的至少一個氨基酸殘基。
[0091]作為本發(fā)明的改良型腈水合酶的一例，優(yōu)選可列舉出一種酶蛋白，其包含:來源于Jl菌的野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列中由N末端側(cè)起第167位的氨基酸殘基(天冬酰胺)、β亞基的氨基酸序列中由N末端側(cè)起第219位的氨基酸(纈氨酸)、β亞基的氨基酸序列中由N末端側(cè)起第57位的氨基酸(絲氨酸)、β亞基的氨基酸序列中由N末端側(cè)起第114位的氨基酸(賴氨酸)、β亞基的氨基酸序列中由N末端側(cè)起第107位的氨基酸(蘇氨酸)、和β亞基的氨基酸序列中由N末端側(cè)起第17位的氨基酸(脯氨酸)，并且具有腈水合酶活性。作為這樣的氨基酸置換形式的標記例，可列舉出“Νβ 167S，Vi3 219Α，S3 57R、K3 114Υ、Τβ 107Κ、Ρβ 17D” 等。
[0092]需要說明的是，氨基酸的字母標記可以用通常的單字表示，在表示置換位置為止的氨基酸殘基數(shù)的數(shù)字(例如“26”)的左側(cè)所表示的字母表示置換前的氨基酸的單字符號；右側(cè)所表示的字母表示置換后的氨基酸的單字符號。
[0093]具體而言，關(guān)于序列號2所表示的β亞基的氨基酸序列，標記為“NM67S”的情況下，意味著β亞基的氨基酸序列(序列號2)中由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)(包含該N末端的氨基酸殘基數(shù)起)第167位的天冬酰胺(N)置換為絲氨酸(S)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置換形式。
[0094]此處，“ α I ”的標記意味著置換位置位于比CTLCSC區(qū)域的最下游側(cè)的C殘基還要下游(不包含該C殘基數(shù)起，位于C末端側(cè))。
[0095]進而，作為本發(fā)明的改良型腈水合酶，更優(yōu)選列舉上述蛋白質(zhì)中被置換的氨基酸殘基為表1中所列舉的氨基酸殘基的腈水合酶。
[0096][表 I]
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)， 其為以下㈧或⑶的蛋白質(zhì)； (A)蛋白質(zhì)，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、(C)、(d)和(e)的氨基酸殘基被置換為其他的氨基酸殘基、進而選自由下述(f)~(q)所組成的組的至少一個氨基酸殘基被置換為其他的氨基酸殘基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性； (a)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)167殘基下游的氨基酸殘基、 (b)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)219殘基下游的氨基酸殘基、 (c)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)57殘基下游的氨基酸殘基、 (d)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)114殘基下游的氨基酸殘基、 (e)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)107殘基下游的氨基酸殘基、 (f)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)218殘基下游的氨基酸殘基、 (g)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)190殘基下游的氨基酸殘基、 (h)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)168殘基下游的氨基酸殘基、 (?) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)144殘基下游的氨基酸殘基、 U) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)133殘基下游的氨基酸殘基、 (k) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)112殘基下游的氨基酸殘基、 (I)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)105殘基下游的氨基酸殘基、 (m) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)95殘基下游的氨基酸殘基、(η) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)17殘基下游的氨基酸殘基、(ο) β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)15殘基下游的氨基酸殘基、(P) α亞基的氨基酸序列中，由構(gòu)成輔基結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游側(cè)的C殘基起67殘基下游的氨基酸殘基、 (q) α亞基的氨基酸序列中，由構(gòu)成輔基結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游側(cè)的C殘基起17殘基下游的氨基酸殘基、 (B)蛋白質(zhì)，其特征在于，包含在㈧蛋白質(zhì)的氨基酸序列中除了所述置換后的氨基酸殘基之外缺失、置換和/或附加有I個或數(shù)個氨基酸殘基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。
2.—種DNA，其編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)。
3.—種DNA，其與權(quán)利要求2所述的DNA在嚴格條件下雜交并且編碼具有腈水合酶活性的蛋白質(zhì)。
4.一種重組載體，其包含權(quán)利要求2或3所述的基因DNA。
5.一種轉(zhuǎn)化體,其包含權(quán)利要求4所述的重組載體。
6.一種腈水合酶，是從培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物中提取的。
7.一種腈水合 酶的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，從得到的培養(yǎng)物中提取腈水合酶。
8.一種酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物與腈化合物接觸。
【文檔編號】C12N1/19GK103649312SQ201280028405
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月31日
【發(fā)明者】渡邊文昭, 安保貴永, 原愛 申請人:三菱麗陽株式會社