用于檢測(cè)hpv核酸的材料和方法
【專利摘要】提供了能夠與HPV16和/或HPV18核酸，特別是編碼E2和E6-7基因產(chǎn)物的mRNA雜交的核酸。此類核酸可用于從生物學(xué)樣品分離RNA的方法、用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中特定RNA剪接形式變體的存在的方法和手段、用于測(cè)定生物學(xué)樣品中RNA比率的相對(duì)比率的方法和手段、用于預(yù)測(cè)癌前宮頸損傷進(jìn)展的方法和手段、和用于檢測(cè)基因或基因表達(dá)破壞的方法和手段。
【專利說明】用于檢測(cè)HPV核酸的材料和方法
[0001]對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年2月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/446，306及還有2011年5月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/486，118的優(yōu)先權(quán)，其在此都通過提及完整并入。
[0003]發(fā)明背景
[0004]1.領(lǐng)域
[0005]本公開內(nèi)容涉及用于測(cè)定樣品中核酸存在的方法、組合物和試劑盒，所述核酸包括源自人乳頭瘤病毒(HPV)的核酸。
[0006]2.相關(guān)技術(shù)的描述
[0007]人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌的最重要原因，其中13類引起HPV相關(guān)宮頸疾病和癌癥。使用分子測(cè)試針對(duì)致癌性HPV DNA的篩選已經(jīng)可用于診斷HPV相關(guān)疾病。然而，目前的測(cè)試方法不能精確預(yù)測(cè)哪些感染可以形成癌癥，因?yàn)榇蠖鄶?shù)HPV感染是短暫的，并且自發(fā)消退和清除。因此，探索其它生物標(biāo)志物以在反射測(cè)定法(reflex assay)中使用以確認(rèn)哪些感染會(huì)進(jìn)展并且需要進(jìn)一步治療。
[0008]疾病進(jìn)展可以與某些HPV基因的表達(dá)相關(guān)。因此，HPV mRNA的檢測(cè)可以是重度感染的別的生物標(biāo)志物。開發(fā)用于診斷學(xué)的一些HPV mRNA測(cè)定法檢測(cè)單一類型的轉(zhuǎn)錄物種類，諸如E6或E7致癌性序列。這些測(cè)定法不能預(yù)測(cè)重度感染，因?yàn)閱我环N類的豐度可以變動(dòng)，這是由于在疾病過程期間發(fā)生的復(fù)雜表達(dá)樣式，或由于免疫應(yīng)答對(duì)HPV的降解所致。另外，mRNA靶物在收集后可能降解·，或者收集標(biāo)本中的感染細(xì)胞數(shù)據(jù)可能較低，這兩者可以影響測(cè)定結(jié)果。作為一種解決辦法，設(shè)計(jì)用于同時(shí)檢測(cè)一定比率的兩種mRNA種類的HPV測(cè)定法可以比檢測(cè)單一 mRNA種類的測(cè)定法更能預(yù)測(cè)疾病。
[0009]另外，HPV DNA通常以每個(gè)細(xì)胞50-100個(gè)拷貝以環(huán)狀附加體狀態(tài)以生產(chǎn)性感染維持。在此狀態(tài)中，HPV癌基因E6和E7的轉(zhuǎn)錄受到E2蛋白緊密控制。E6和E7分別靶向p53和pRb，并且如此干擾正常的細(xì)胞周期。消除此轉(zhuǎn)錄控制的細(xì)胞由于其加速再進(jìn)入細(xì)胞周期中而比其它細(xì)胞具有增殖優(yōu)勢(shì)。
[0010]破壞或刪除E2基因(如經(jīng)常在病毒整合入宿主基因組中期間發(fā)生的)消除對(duì)E6和E7的負(fù)反饋，活化端粒末端轉(zhuǎn)移酶，并脫阻抑hTERT表達(dá)，并且如此明顯促成細(xì)胞永生化的進(jìn)展及最終癌癥進(jìn)展。
[0011]已經(jīng)利用特定核酸序列和序列變化的檢測(cè)和表征來檢測(cè)指示感染的病毒或細(xì)菌核酸序列的存在、與疾病和癌癥有關(guān)的哺乳動(dòng)物基因的變體或等位基因的存在、和法庭樣品中及親子關(guān)系測(cè)定中找到的核酸來源的鑒定。牽涉正常生物學(xué)過程的RNA種類的表征對(duì)于了解各種了解很少的生物學(xué)過程可以是重要的。
[0012]RNA(例如信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、小核RNA、和其它RNA)的檢測(cè)和表征在許多領(lǐng)域中是一種重要的工具，所述領(lǐng)域包括分子生物學(xué)、毒理學(xué)和生物化學(xué)。信使RNA(mRNA)是一種必需的功能性細(xì)胞組分；在基因表達(dá)過程期間，mRNA的功能性單鏈結(jié)構(gòu)被合成，并且充當(dāng)在蛋白質(zhì)合成中用于翻譯過程的中間模板。mRNA分子的短暫存在以DNA轉(zhuǎn)錄成RNA分子開始，并且最終以降解結(jié)束。在其壽命期間，mRNA分子在翻譯前也可以加工，編輯，并轉(zhuǎn)運(yùn)。剪接是修飾前mRNA以除去稱作內(nèi)含子的非編碼序列的某些區(qū)段的過程；保留的區(qū)段可以包含蛋白質(zhì)編碼序列，并且稱作外顯子。有時(shí)，可以以幾種不同方式剪接前mRNA信息，容許單一轉(zhuǎn)錄物編碼多種蛋白質(zhì)。
[0013]信使RNA(mRNA)的檢測(cè)在診斷學(xué)中是重要的，因?yàn)樗梢蕴峁〥NA檢測(cè)不能提供的病毒載量和基因表達(dá)信息。這些因素經(jīng)常給出關(guān)于疾病進(jìn)展和預(yù)后的線索。目前用于mRNA檢測(cè)的技術(shù)呈現(xiàn)許多問題，包括復(fù)雜性和污染潛力。
[0014]最常見的mRNA檢測(cè)方法包括Northern印跡、核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定法(RPA)和逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。然而，這些中每種技術(shù)雖然在靈敏性上提供一些優(yōu)點(diǎn)，但是需要時(shí)間和材料要求。另外，一些技術(shù)需要擴(kuò)增靶mRNA，因?yàn)榭俶RNA僅占總RNA的約1%，并且任何特定的mRNA是小得相當(dāng)多的百分比。
[0015]目前，逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)廣泛用于表征RNA轉(zhuǎn)錄物。然而，所述方法具有下列限制:1)僅可以共擴(kuò)增有限數(shù)目的特定區(qū)；2)突變或可變剪接可以限制特異性引物檢測(cè)RNA的能力；及3)難以以連續(xù)模式方法表征mRNA結(jié)構(gòu)。
[0016]因此，具有能夠測(cè)定給定核酸在樣品中存在或缺乏的材料和方法會(huì)是有用的。另外，具有能夠測(cè)定基因(包括HPV E2基因)是否受到破壞、刪除、或以其它方式不在宿主細(xì)胞中表達(dá)的材料和方法會(huì)是有用的。
[0017]發(fā)明概述
[0018]本公開內(nèi)容提供了可用于檢測(cè)樣品中的特定核酸及測(cè)定那些核酸是否完整或受到破壞的核酸和方法。
[0019]在一個(gè)方面，提供了分離的核酸，其具有不超過200個(gè)核苷酸的總體長(zhǎng)度且包含至少一種與選自下組的核苷酸序列具有至少75%同源性的核苷酸序列、基本上由所述至少一種核苷酸序列組成或由所述至少一種核苷酸序列組成:SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 105和SEQ ID NO: 111至SEQ ID NO:308、其RNA等同物及其互補(bǔ)物。
[0020]在一個(gè)方面，提供了一種檢測(cè)靶RNA存在的方法，該方法包括:a)提供至少一種DNA捕捉探針，其中所述至少一種DNA捕捉探針與支持物結(jié)合；b)使所述祀RNA與所述至少一種DNA捕捉探針雜交，生成靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物；c)分離所述靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物；d)提供至少一種DNA放大探針，并使所述至少一種DNA放大探針與所述靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物雜交，生成靶RNA:DNA捕捉/放大探針復(fù)合物；e)提供抗RNA:DNA雜合物抗體，并將所述靶RNA:DNA捕捉/放大探針復(fù)合物與所述抗體一起溫育，生成靶RNA:DNA:抗體復(fù)合物；f)檢出所述抗體，其中所述檢出指示所述靶RNA的存在。在一個(gè)方面，抗體與可檢測(cè)標(biāo)志物綴合，并且檢測(cè)步驟包括檢測(cè)標(biāo)志物。在一個(gè)方面，可檢測(cè)標(biāo)志物選自下組:堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶。在一個(gè)方面，檢測(cè)步驟包括提供結(jié)合所述抗RNA:DNA雜合物抗體的第二抗體，其中所述第二抗體與可檢測(cè)標(biāo)志物綴合，且其中所述檢測(cè)進(jìn)一步包括檢測(cè)標(biāo)志物。在一個(gè)方面，支持物包含磁珠。在一個(gè)方面，磁珠與至少一種鏈霉抗生物素蛋白分子綴合，并且至少一種DNA捕捉探針與生物素分子綴合。在一個(gè)方面，至少一種捕捉探針和/或放大探針是核酸探針，如上文所列的。
[0021]在一個(gè)方面，至少一種DNA捕捉探針和至少一種DNA放大探針的長(zhǎng)度是約15至約200個(gè)堿基。
[0022]在一個(gè)方面，靶RNA是剪接變體，并且選擇至少一種DNA捕捉探針和至少一種DNA放大探針以檢測(cè)所述剪接變體的存在。
[0023]在一個(gè)方面，至少一種DNA捕捉探針和至少一種DNA放大探針與來自HPV高風(fēng)險(xiǎn)型 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，26，66，73 和 82 的 RNA 互補(bǔ)。
[0024]在另一個(gè)方面，提供了用于檢測(cè)靶RNA的試劑盒，該試劑盒包含:a)至少一種DNA捕捉探針，其與磁性支持物結(jié)合山)至少一種DNA放大探針；c)抗RNA:DNA雜合物抗體；和
d)檢測(cè)試劑。在一個(gè)方面，所述抗RNA:DNA雜合物抗體與可檢測(cè)標(biāo)志物綴合，并且所述檢測(cè)試劑包含所述可檢測(cè)標(biāo)志物的底物。在一個(gè)方面，試劑盒進(jìn)一步包含結(jié)合所述抗RNA:DNA雜合物抗體的二抗，其中所述二抗與可檢測(cè)標(biāo)志物綴合，且其中所述檢測(cè)試劑包含所述可檢測(cè)標(biāo)志物的底物。
[0025]本公開內(nèi)容提供了提供靶RNA進(jìn)行檢測(cè)的方法，該方法包括:將含有靶RNA的生物學(xué)樣品與羧基珠一起溫育；將珠分離；裂解附著于分離珠的生物學(xué)樣品；并從裂解的生物學(xué)樣品分離珠，其中所得的上清液含有用于檢測(cè)的靶RNA。
[0026]在另一個(gè)方面，公開了用于核酸檢測(cè)的方法，其不依賴于靶物擴(kuò)增。通過特異性核酸寡核苷酸捕捉感興趣的核酸。如下提供信號(hào)放大，即添加覆蓋捕捉的RNA靶物的DNA探針(或者靶物是DNA，反之亦然)，然后使用能夠特異性結(jié)合DNA:RNA雜合物的實(shí)體檢測(cè)。此雜合物捕捉測(cè)定法隨轉(zhuǎn)錄物的量和長(zhǎng)度增加而給出信號(hào)的線性升高。因此，它可以用于測(cè)量現(xiàn)有技術(shù)不能測(cè)量的刪除。通過測(cè)定靶核酸破壞的程度，與來自完整的參照核酸組的總體信號(hào)相比，能夠測(cè)定靶物是否受到破壞及靶物受到破壞的程度。
[0027]在一個(gè)方面，通過將樣品至少分成第一和第二部分測(cè)定對(duì)靶物的破壞。在足以生成兩組DNA:RNA雜合物的條件下處理樣品的第一部分:一組包含靶核酸，而一組包含至少一種參照核酸。然后，在足以生成包含參照核酸的DNA:RNA雜合物組，而非包含靶核酸的組的條件下處理樣品的第二部分。然后，比較樣品的第一部分中DNA:RNA雜合物的總量與樣品的第二部分中DNA:RNA雜 合物的總量。若靶核酸是缺少的，則在樣品的第一和第二部分中應(yīng)當(dāng)有相同量的DNA:RNA雜合物。還呈現(xiàn)了用于測(cè)定破壞(若有的話)程度的方法變化，其通過應(yīng)用多個(gè)對(duì)靶核酸的實(shí)質(zhì)性部分特異性的探針，并逐漸除去探針進(jìn)行。在檢出DNA: RNA雜合物變化前可以除去的探針越多，靶核酸受到破壞的程度越大。
[0028]在另一個(gè)方面，提供了測(cè)定E2基因、cDNA或mRNA是否缺乏或破壞的方法?？梢詰?yīng)用此類方法以測(cè)定E2基因是否在表達(dá)，HPV基因組是否整合入宿主細(xì)胞基因組中等等，從而評(píng)估HPV感染的進(jìn)展和/或測(cè)定HPV感染進(jìn)展成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0029]附圖簡(jiǎn)述
[0030]為了進(jìn)一步理解本公開內(nèi)容的性質(zhì)、目的和優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)參照以下詳細(xì)描述，其與以下圖結(jié)合閱讀，其中類似的參照數(shù)字表示類似的要素。
[0031]圖1是通過生物素化的DNA探針(白色柱形)捕獲的靶RNA (用交叉排線畫出陰影的柱形)的示意圖?！癇”代表生物素模塊；“SA”代表鏈霉抗生物素蛋白模塊；“AP”代表與抗體綴合的堿性磷酸酶，但是AP可以是任何其它合適的可檢測(cè)模塊(例如辣根過氧化物酶等)，并且B和SA可以通過其它連接模塊替換。
[0032]圖2的圖描繪了使用DNA捕捉探針(白色柱形)、多種DNA放大探針(黑色柱形)和多種DNA: RNA雜合物抗體來“放大”信號(hào)，而不需要擴(kuò)增靶RNA (用交叉排線畫出陰影的柱形)。“B”代表生物素模塊；“SA”代表鏈霉抗生物素蛋白模塊，B和SA可以用其它綴合技術(shù)替換，其中DNA探針與珠綴合；“AP”代表與抗體綴合的堿性磷酸酶，但是AP可以是任何其它合適的可檢測(cè)模塊(例如辣根過氧化物酶等)。
[0033]圖3是通過與基片⑶結(jié)合的不同DNA捕捉探針捕獲的靶RNA(虛線箭)的圖。還顯示了非綴合的DNA放大探針(黑色柱形)和多種檢測(cè)并結(jié)合DNA:RNA雜合物區(qū)的抗體(與堿性磷酸酶或任何其它合適的可檢測(cè)模塊，諸如辣根過氧化物酶等等綴合)?；?例如珠)可以攜帶多種DNA捕捉探針，并且DNA捕捉探針可以是相同的(即相同序列和/或長(zhǎng)度)或不同的(即不同序列和/或不同長(zhǎng)度)。
[0034]圖4提供了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其顯示了在RNA捕獲后添加未生物素化的DNA探針的效果。在此實(shí)驗(yàn)中，將可變數(shù)目的生物素化探針與鏈霉抗生物素蛋白珠綴合。靶物是HPV16的E6/7基因轉(zhuǎn)錄物。在添加(黑色柱形)和未添加(白色柱形)未標(biāo)記的信號(hào)放大探針(一步對(duì)兩步測(cè)定法)的情況中用每組珠實(shí)施測(cè)定法。在不添加信號(hào)放大步驟(白色柱形)時(shí)，信號(hào)隨由捕捉探針提供的覆蓋量而升高。然而，在添加信號(hào)放大探針(黑色柱形)時(shí)，信號(hào)比不添加它們時(shí)大，并且它們用較少(3-5)捕捉探針實(shí)現(xiàn)較高的信號(hào)。
[0035]圖5顯示了內(nèi)源雜合物經(jīng)常是臨床背景噪音的來源?！癛LU” =相對(duì)發(fā)光單元。
[0036]圖6顯示了在測(cè)定PreservCyt?溶液中的細(xì)胞樣品時(shí)裂解緩沖液(其中ιοο%緩沖液含有約3Μ硫氰酸胍和約2%去污劑)濃度對(duì)測(cè)定法背景的影響，并且證明臨床背景隨裂解緩沖液濃度降低而降低。
[0037]圖7顯示了細(xì)胞團(tuán)粒的低滲裂解確保背景噪音保持較低且穩(wěn)定，并且無(wú)論使用的標(biāo)本量如何，背景不顯著改變。“PC” = PreservCyt?溶液;“pc(-) ” =沒有hpv革巴物的
PreservCyt?溶液中固定的標(biāo)本(宮頸刮落)集合。
[0038]圖8顯示了自HPV陽(yáng)性細(xì)胞(SiHa)的HPV E6/E7檢測(cè)限。這顯示了使用本公開內(nèi)容的方法，需要少到1x103個(gè)細(xì)胞檢測(cè)HPV E6/7RNA。
[0039]圖9顯示了來自對(duì)各種裂解緩沖液測(cè)試裂解由C00H珠捕獲的細(xì)胞的能力的結(jié)果。圖9的數(shù)據(jù)及下文表1的數(shù)據(jù)顯示優(yōu)選的裂解緩沖液是約1M硫氰酸胍和約0.7%去污劑。
[0040]圖10顯示了隨時(shí)間的經(jīng)羧酸鹽修飾的(C00H)磁珠(Sera Dyn產(chǎn)品目錄編號(hào)6515-2105-050350)的細(xì)胞捕獲，其證明在溫育30分鐘后已經(jīng)捕獲約95%的細(xì)胞。
[0041]圖11顯示了 C00H珠捕獲與低滲裂解的比較，并且指示C00H珠捕獲比低滲裂解在從細(xì)胞獲得mRNA方面更有效。“PC-”指示缺乏HPV存在的宮頸刮落標(biāo)本的集合。
[0042]圖12的圖描繪了捕捉和信號(hào)放大探針設(shè)計(jì)區(qū)。可以通過捕獲到具有捕捉特定靶物的特異性捕捉寡聚物的磁珠上“表征”HPV轉(zhuǎn)錄物的長(zhǎng)度，并用延長(zhǎng)雜合物區(qū)長(zhǎng)度使用的多組未標(biāo)記的寡核苷酸檢測(cè)。若捕捉RNA攜帶與使用的捕捉探針互補(bǔ)的序列，則信號(hào)會(huì)產(chǎn)生。信號(hào)輸出會(huì)在連續(xù)添加擴(kuò)增信號(hào)探針的情況下增加，直到達(dá)到最大長(zhǎng)度，在那里信號(hào)會(huì)達(dá)到穩(wěn)定水平。顯示了 HPV16的各種HPV轉(zhuǎn)錄物。指明以虛線框表示的區(qū)，用于探針設(shè)計(jì)。
[0043]圖13顯示了隨信號(hào)放大探針數(shù)目增加的信號(hào)升高。以此方式，可以通過由增加數(shù)目的連續(xù)放大探針產(chǎn)生的升高信號(hào)測(cè)量RNA轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度。在圖13中，每組的5種寡聚物彼此相鄰，并且隨著添加連續(xù)組，導(dǎo)致RNA:DNA雜合物變得更長(zhǎng)，及信號(hào)更強(qiáng)。
[0044]圖14顯示了可以針對(duì)具有低比率的細(xì)胞背景檢測(cè)具有高度早期:晚期HPV mRNA比率的細(xì)胞級(jí)分。對(duì)于此圖14，將SiHa細(xì)胞(宮頸癌細(xì)胞系)添加至宮頸標(biāo)本(各診斷為高級(jí)HPV相關(guān)損傷)集合。SiHa細(xì)胞摻入高比率的HPV早期轉(zhuǎn)錄物:HPV晚期轉(zhuǎn)錄物，其是宮頸癌的一種常見特征。樣品模擬在癌癥前期損傷細(xì)胞間具有癌細(xì)胞的標(biāo)本。結(jié)果顯示了發(fā)明的測(cè)定法會(huì)檢出更多良性損傷細(xì)胞集合中的癌細(xì)胞。
[0045]圖15顯示了 LBC臨床標(biāo)本集合中保存的SiHa細(xì)胞的HPV RNA穩(wěn)定性。RT-PCR圖顯示了對(duì)在67天的過程里溫育的SiHa細(xì)胞樣品相對(duì)于PCR循環(huán)數(shù)目(χ軸)繪圖的測(cè)定信號(hào)(y軸)。符號(hào)是星號(hào)，3天；正方形，13天；三角形，26天；實(shí)心菱形，42天；空心菱形，67天。數(shù)值是每天的兩次反應(yīng)的平均值。
[0046]圖16a顯示了用于HPV mRNA的雜合物捕捉檢測(cè)的通用方案。將HPVmRNA靶物(點(diǎn)線)退火以捕捉與磁珠(環(huán)形)偶聯(lián)的寡聚物(短的灰色柱形)。將RNA靶物與信號(hào)放大寡聚物(短黑色柱形)退火以參見較長(zhǎng)的雜合物。RNA:DNA雜合物與同堿性磷酸酶(Y形狀的AP符號(hào))綴合的雜合物捕捉抗體結(jié)合。添加化學(xué)發(fā)光底物(未顯示)以在發(fā)光計(jì)中檢測(cè)復(fù)合物。
[0047]圖16b顯不了具有標(biāo)不基因(大的灰色箭)的HPV基因組結(jié)構(gòu)的不意圖。E6-7探針(1)或E2探針(2)的基因座以下面的黑色柱形顯示。基因排列和DNA探針的基因座對(duì)于HPV16和HPV18是相似的，但是一級(jí)序列是獨(dú)特的。
[0048]圖17a對(duì)每個(gè)用于相同靶物輸出(1x105個(gè)拷貝，HPV16E6-7體外轉(zhuǎn)錄的RNA)的測(cè)定法顯示了發(fā)光信號(hào)輸出(平均值RLU，n=4)對(duì)互補(bǔ)信號(hào)放大探針數(shù)目的依賴性。在此實(shí)驗(yàn)中，雜合物長(zhǎng)度在添加5、10和15種探針的情況中在孔中增加。信號(hào)對(duì)于具有對(duì)15種互補(bǔ)探針添加的5種非互補(bǔ)探針的孔(標(biāo)記為5+15)沒有升高。
[0049]圖17b顯示了對(duì)于雜合物捕捉測(cè)定法，發(fā)光信號(hào)輸出(平均RLU，n=3份樣品，誤差棒顯示標(biāo)準(zhǔn)差)對(duì)靶物輸入(每次反應(yīng)的RNA拷貝)的依賴性。在柱形上給出信號(hào):噪音比。
[0050]圖18a顯示了對(duì)HPV16E6_7(灰色柱形)和E2(黑色柱形)繪制信號(hào):噪音(平均值，n=3)對(duì)每個(gè)測(cè)定法的SiHa細(xì)胞數(shù)目的依賴性；對(duì)于不同孔中的兩個(gè)測(cè)定法。對(duì)于這些測(cè)定法，從來自沒有添加靶物的對(duì)照測(cè)定法的信號(hào)獲得背景噪音，約50RLU。
[0051]圖18b顯示了對(duì)癌細(xì)胞系SiHa、Caski和HeLa將HPV E6-7和E2mRNA測(cè)定法的信號(hào):噪音數(shù)值以比率繪制；柱形代表三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均比率。
[0052]圖19顯示了 SiHa細(xì)胞與來自HPV陽(yáng)性標(biāo)本集合的細(xì)胞的混合物中HPV16E6-7:E2轉(zhuǎn)錄物比率的檢測(cè)。將培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞與HPV陽(yáng)性、基于液體的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的集合(2ml)(2ml中約100，000個(gè)總細(xì)胞)混合。
[0053]圖20顯示了宮頸標(biāo)本中HPV16E6-7:E2比率。從雜合物捕捉測(cè)定法結(jié)果繪制E6-7:E2 比率。
[0054]圖21顯示了用于測(cè)定E2基因表達(dá)是否缺乏或破壞的方法。
[0055]圖22顯示了 SiHa和W12細(xì)胞中E2基因表達(dá)完整性的比較。
[0056]圖23顯示了 LSIL和HSIL樣品中E2基因表達(dá)完整性的比較。
[0057]發(fā)明詳述
[0058]在進(jìn)一步描述本公開內(nèi)容前，應(yīng)當(dāng)理解公開內(nèi)容不限于下文描述的公開內(nèi)容的具體方面，因?yàn)榫唧w方面的變化可以做出，并且仍落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。還應(yīng)當(dāng)理解，采用的術(shù)語(yǔ)是為了描述具體的方面，而并不意圖為限制性的。[0059]在本說明書及所附權(quán)利要求書中，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述/該”包括復(fù)數(shù)提及物，除非上下文另有明確規(guī)定。除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。
[0060]能夠與HPV16和/或HPV18雜交的分離的核酸和探針
[0061]本文中提供了由不超過200個(gè)核苷酸組成且能夠與HPV16或HPV18DNA或RNA雜交的核酸。
[0062]在一個(gè)方面，核酸包含至少一種與選自下組的核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%同源性的核苷酸序列、基本上由所述至少一種核苷酸序列組成或由所述至少一種核苷酸序列組成:SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 105和SEQ IDNO: 111至SEQ ID NO:308、其RNA等同物及其互補(bǔ)物。在又一個(gè)方面，核酸包含核苷酸序列，由該核苷酸序列組成，或基本上由該核苷酸序列組成，該核苷酸序列選自下組:SEQ IDNO: 1 至 SEQ ID NO: 105 和 SEQ ID NO: 111 至 SEQ ID NO: 308、RNA 等同物及其互補(bǔ)物。
[0063]在一個(gè)方面，核酸能夠在嚴(yán)格條件下與如下的核酸雜交，所述核酸與HPV16或HPV18基因組或自其衍生的核酸至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%、或100%相同的。例示性HPV16基因組的序列披露于GenBankNC_01526 (SEQ ID NO: 106)。例示性HPV18基因組的序列披露于GenBankX05015(SEQ ID NO:107)。
[0064]在另一個(gè)方面，核酸能夠與如下的核酸雜交或結(jié)合，所述核酸與HPV16或HPV18mRNA或其互補(bǔ)物是至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。在另一個(gè)方面，HPV16或HPV18mRNA選自下組:E2和 E6/E7mRNA。
[0065]出于本目的，“嚴(yán)格條件”涵蓋僅會(huì)在雜交分子與靶序列之間有25%錯(cuò)配或更小時(shí)發(fā)生雜交的條件。為了更精確定義，“嚴(yán)格條件”可以分成特定水平的嚴(yán)格性。如此，如本文中使用的，“中等嚴(yán)格性條件”是具有超過25%序列錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件；“中間嚴(yán)格性”條件是具有超過15%序列錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件，而“高嚴(yán)格性”條件是具有超過10%序列錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件?！胺浅８叩膰?yán)格性”條件是具有超過6%序列錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件。關(guān)于用于獲得特定程度的嚴(yán)格性的雜交條件的計(jì)算也由Samtoooket al.(編)，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol.1-3, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν.Y., 1989,第 9 章和第 11 章討論，其通過提及完整并入本文。
[0066]在一個(gè)方面，提供了探針組，所述探針組包含本文中公開的至少一種分離的核酸。作為例子而非作為限制，探針組可以包含分離的核酸，其包含至少一種與選自下組的核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%`、至少90%、或至少95%同源性的核苷酸序列、基本上由所述至少一種核苷酸序列組成或由所述至少一種核苷酸序列組成:SEQ ID NO: 1至SEQID NO: 105和SEQ ID NO: 111至SEQ ID NO: 308、其RNA等同物及其互補(bǔ)物。在又一個(gè)方面，探針組可以包含分離的核酸，其包含核苷酸序列，由該核苷酸序列組成，或基本上由該核苷酸序列組成，該核苷酸序列選自下組:SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 105和SEQ ID NO: 111至SEQ ID N0:308、RNA等同物及其互補(bǔ)物。分離的核酸可以以未修飾的探針提供或者可以是經(jīng)修飾的。作為例子而非作為限制，修飾可以促進(jìn)探針和已經(jīng)與其雜交的核酸的分離和/或檢測(cè)，例如通過添加配體和/或可檢測(cè)標(biāo)記物進(jìn)行。在一個(gè)方面，可以提供與固體支持物諸如板、管、珠、微芯片、或其它固體表面結(jié)合的探針。
[0067]鑒定HPV mRNA的方法
[0068]可以使用本公開內(nèi)容的方法來檢測(cè)來自樣品的靶核酸的存在。此類核酸可以是RNA,并且此類樣品可以包括但不限于標(biāo)本或培養(yǎng)物(例如細(xì)胞、微生物學(xué)和病毒培養(yǎng)物)，包括生物學(xué)和環(huán)境樣品。生物學(xué)樣品可以來自真核生物、原核生物、古菌(archaeon)、病毒、動(dòng)物(包括人)、植物、真菌、挖掘物，并且可以來自流體、固體(例如糞)或組織、細(xì)胞培養(yǎng)物、液體或固體培養(yǎng)基、以及液體和固體食物和飼料產(chǎn)品和成分諸如乳制品項(xiàng)、蔬菜、肉類和肉類副產(chǎn)品和廢物。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料諸如表面物質(zhì)、土壤、水、空氣和工業(yè)樣品及從食物和乳制品加工儀、裝置、設(shè)備、器皿、一次性和非一次性項(xiàng)獲得的樣品。特別優(yōu)選的是生物學(xué)樣品，包括但不限于宮頸上皮細(xì)胞(例如從宮頸拭樣或活組織檢查獲得的樣品)、腺樣細(xì)胞、和上皮細(xì)胞、血液、唾液、腦脊髓液、胸膜液、乳、淋巴、痰和精液。樣品可以包含包括信使RNA(mRNA)的核糖核酸。
[0069]本公開內(nèi)容提供了用于測(cè)定樣品中靶RNA存在的方法，其中所述方法包括:a)使靶RNA與具有與靶RNA互補(bǔ)的序列的DNA捕捉探針雜交以形成靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物，其中所述DNA捕捉探針與支持物綴合；b)分開靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物與未結(jié)合的RNA(例如通過清洗進(jìn)行)；c)任選地，使至少一種放大探針與祀RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物雜交，其中所述至少一種放大探針具有與靶RNA互補(bǔ)的序列，由此形成靶RNA:DNA捕捉/放大探針復(fù)合物；d)添加識(shí)別并結(jié)合RNA:DNA雜合物的抗體以結(jié)合靶RNA:DNA捕捉/放大探針復(fù)合物，由此形成靶RNA:DNA:抗體復(fù)合物，其中所述抗體用可檢測(cè)標(biāo)志物標(biāo)記；e)檢測(cè)所述抗體上的標(biāo)志物，其中所述檢測(cè)指示靶核糖核酸的存在；并f)比較檢測(cè)結(jié)果與從放大探針的不同組合產(chǎn)生的結(jié)果，其中所述比較指示存在特定的RNA剪接形式。
[0070]本公開內(nèi)容提供了用于測(cè)定樣品中靶RNA存在的方法，其中所述方法包括:a)使靶RNA與具有與靶RNA互補(bǔ)的序列的DNA捕捉探針雜交以形成靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物，其中所述DNA捕捉探針與支持物綴合；b)分開靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物與未結(jié)合的RNA ；c)任選地，使至少一種放大探針與祀RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物雜交，其中所述至少一種放大探針具有與靶RNA互補(bǔ)的序列，由此形成靶RNA:DNA捕捉/放大探針復(fù)合物；d)添加識(shí)別并結(jié)合RNA:DNA雜合物的抗體以結(jié)合靶RNA:DNA捕捉/放大探針復(fù)合物，由此形成靶RNA:DNA:抗體復(fù)合物；e)添加識(shí)別并結(jié)合一抗的二抗，其中所述二抗用可檢測(cè)標(biāo)志物標(biāo)記；f)檢測(cè)二抗上的標(biāo)志物，其中所述檢測(cè)指示靶核糖核酸的存在；并3比較檢測(cè)結(jié)果與從放大探針的不同組合產(chǎn)生的結(jié)果，其中所述比較指示存在特定的RNA剪接形式。
[0071]本公開內(nèi)容還提供了檢測(cè)樣品中核糖核酸(RNA)剪接形式存在的方法，其中所述方法包括a)在容許探針和靶核糖核酸雜交的條件下使靶RNA與具有與靶RNA互補(bǔ)的序列的DNA捕捉探針雜交，由此形成靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物；b)添加識(shí)別并結(jié)合RNA:DNA雜合物的一抗以結(jié)合靶RNA: DNA捕捉探針復(fù)合物，由此形成靶RNA: DNA捕捉探針抗體復(fù)合物，其中一抗與支持物綴合；c)分開靶RNA:DNA捕捉探針抗體復(fù)合物與未結(jié)合的RNA ；d)使至少一種放大探針與靶RNA:DNA捕捉探針抗體復(fù)合物雜交，其中所述至少一種放大探針具有與靶RNA互補(bǔ)的序列，并且組合添加，其會(huì)覆蓋特定靶RNA區(qū)，由此形成靶RNA: DNA:抗體復(fù)合物；e)添加識(shí)別并結(jié)合RNA:DNA:雙鏈體的二抗以形成靶RNA:DNA:抗體復(fù)合物，其中二抗用可檢測(cè)標(biāo)志物標(biāo)記；f)檢出所述二抗上的標(biāo)志物，其中所述檢出指示靶RNA的存在；并
g)比較檢測(cè)結(jié)果與從放大探針的不同組合產(chǎn)生的結(jié)果，其中所述比較指示存在特定的RNA剪接形式。
[0072]本公開內(nèi)容還提供了檢測(cè)樣品中核糖核酸(RNA)剪接形式的存在的方法，其中所述方法包括a)在容許探針和靶核糖核酸雜交的條件下使靶RNA與具有與靶RNA互補(bǔ)的序列的DNA捕捉探針雜交，由此形成靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物；b)添加識(shí)別并結(jié)合RNA:DNA雜合物的一抗以結(jié)合靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物，由此形成靶RNA:DNA捕捉探針:抗體復(fù)合物，其中一抗與支持物綴合；c)分開靶RNA:DNA捕捉探針:抗體復(fù)合物與未結(jié)合的RNA ；
d)使至少一種放大探針與祀RNA:DNA捕捉探針:抗體復(fù)合物雜交，其中至少一種放大探針具有與靶RNA互補(bǔ)的序列，并且組合添加，其會(huì)覆蓋特定靶RNA區(qū)，由此形成靶RNA:DNA:抗體復(fù)合物；e)添加識(shí)別并結(jié)合RNA:DNA:雙鏈體的二抗以結(jié)合靶RNA:DNA:抗體復(fù)合物，從而形成靶RNA:DNA:抗體復(fù)合物；f)分開靶RNA:DNA:抗體復(fù)合物與未結(jié)合的二抗；g)添加用可檢測(cè)標(biāo)志物標(biāo)記的三抗，其中三抗識(shí)別并結(jié)合二抗和/或一抗；h)檢出三抗上的標(biāo)志物，其中檢出指示靶RNA的存在；并i)比較檢測(cè)結(jié)果與從至少一種放大探針的不同組合產(chǎn)生的結(jié)果，其中所述比較指示存在RNA剪接形式。 [0073]RNA經(jīng)常自不同啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄并剪接，由此生成多種形式，其包括不同基因的編碼區(qū)。重要的是表征RNA的這些多種剪接形式，用于基礎(chǔ)研究及用于如下的應(yīng)用，其中檢測(cè)特定mRNA同等型是至關(guān)重要的。
[0074]本公開內(nèi)容的一個(gè)應(yīng)用是檢測(cè)及表征人乳頭瘤病毒(HPV)中的mRNA表達(dá)。已經(jīng)顯示了宮頸癌與高風(fēng)險(xiǎn)HPV類型的存在有關(guān)；目前鑒定出約13至約18種高風(fēng)險(xiǎn)類型。HPVDNA測(cè)試可以鑒定高風(fēng)險(xiǎn)HPV類型，但是是癌前臨床標(biāo)本中疾病進(jìn)展的一種較差的預(yù)測(cè)項(xiàng)。如此，需要?jiǎng)e的方法和標(biāo)志物來改善HPV測(cè)試的預(yù)測(cè)價(jià)值。對(duì)mRNA表征E6/7癌基因和其它mRNA的存在(如通過本公開內(nèi)容提供的)會(huì)容許一種精確且可靠的方法，該方法測(cè)定這些癌基因?qū)ζ渌《净虻谋磉_(dá)比率。E6/E7與E2、E4、和/或LlmRNA的比率可以是癌前宮頸損傷進(jìn)展的一種較好的預(yù)測(cè)項(xiàng)(參見例如美國(guó)專利N0.6，355，424，其通過提及并入本文)。雜合物捕捉技術(shù)是一種線性信號(hào)放大方法。如此，本公開內(nèi)容提供了在使需要陰道鏡檢查(colposcopy)的患者數(shù)目最小化的情況下引導(dǎo)治療策略的有價(jià)值方法。本公開內(nèi)容提供了使用能夠與RNA(且特別是mRNA)的不同長(zhǎng)度/基因雜交的短寡核苷酸的混合物以表征剪接形式的方法。
[0075]靶核酸
[0076]在一個(gè)方面，要檢測(cè)的靶核糖核酸可以是mRNA、核糖體RNA、核仁RNA、轉(zhuǎn)移RNA、病毒RNA、異質(zhì)核RNA等，其中一種或多種多核苷酸探針是DNA探針。靶核糖核酸包括但不限于存在于標(biāo)本或培養(yǎng)物(例如細(xì)胞、微生物學(xué)和病毒培養(yǎng)物)，包括生物學(xué)和環(huán)境樣品中的核酸。靶核糖核酸可以存在于生物學(xué)樣品中，所述生物學(xué)樣品來自動(dòng)物(包括人)、流體、固體(例如糞)或組織及液體和固體食物和飼料產(chǎn)品和成分諸如乳制品項(xiàng)、蔬菜、肉類和肉類副產(chǎn)品和廢物。靶核糖核酸可以存在環(huán)境樣品中，并且包括環(huán)境材料諸如表面物質(zhì)、土壤、水和工業(yè)樣品及從食物和乳制品加工儀、裝置、設(shè)備、器皿、一次性和非一次性項(xiàng)獲得的樣品。特別優(yōu)選的是存在于生物學(xué)樣品中的靶核酸，所述生物學(xué)樣品包括但不限于宮頸樣品(例如從宮頸拭樣獲得的樣品)、腺樣細(xì)胞、和上皮細(xì)胞、血液、唾液、腦脊髓液、胸膜液、乳、淋巴、痰、尿液和精液。
[0077]在其它方面，靶核糖核酸來自病毒、細(xì)菌、分枝桿菌或瘧原蟲，例如但不意圖限于巨細(xì)胞病毒(CMV)、皰疹病毒科(Herpesviridae)、人免疫缺陷病毒(HIV)、衣原體(Chlamydia spp.)、奈瑟氏球菌(Neisseria spp.)(例如淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhea))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、分枝桿菌(例如結(jié)核分枝桿菌)、SARS冠狀病毒(SARS-CoV)或正粘液病毒科(Orthomixoviridae)(例如流感病毒)。
[0078]在一個(gè)方面，靶核糖核酸是人乳頭瘤病毒(HPV)，并且包括HPV的遺傳變體。變體包括靶核酸的多態(tài)性、突變體、衍生物、經(jīng)修飾的、經(jīng)改變的形式等。在一個(gè)方面，靶核酸是HPV核酸。在另一個(gè)方面，HPV核酸是高風(fēng)險(xiǎn)HPV類型的HPV DNA。在另一個(gè)方面，靶核酸是高風(fēng)險(xiǎn) HPV16, 18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，26，66，73 和 82 型。
[0079]可以將RNA分離并準(zhǔn)備好進(jìn)行雜交，其通過多種方法和試劑，包括(但不限于)硫氰酸胍-酚-氯仿提取(例如用TRIzu! 〃試劑，又稱為TRI試劑)、低滲裂解和羧基(C00H)珠捕捉。RNA分離的原則基于細(xì)胞/組織裂解，接著進(jìn)行提取、沉淀和清洗。雖然非常有效，但是這些技術(shù)需要高水平的技術(shù)精確性，并且不是自動(dòng)化的候選。其它RNA制備方法沒有完全消除DNA和其它潛在的污染物，需要昂貴的酶，而且需要許多(有時(shí)是費(fèi)時(shí)的)清洗步驟。挑戰(zhàn)是開發(fā)一種用于mRNA檢測(cè)的方法，其降低許多目前的考驗(yàn)，并且可以提供關(guān)于特定基因表達(dá)的快速信息。已經(jīng)設(shè)計(jì)兩種主要的樣品制備方法用于本公開內(nèi)容:低滲細(xì)胞裂解；和羧基珠捕捉。也可以在此測(cè)定法中使用TRIzol?或QIAGEN樹脂技術(shù)(例如QIAGENRNeasy Plus微型試劑盒)分離的RNA。
[0080]在某些實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品由宮頸細(xì)胞，尤其是人宮頸細(xì)胞構(gòu)成。可以用本領(lǐng)域中已知的任何方法或裝置收集樣品，所述方法或裝置包括化學(xué)惰性收集裝置諸如Dacron? (聚乙烯對(duì)苯二甲酸酯 poly (ethylene terephthalate))尖端拭子(tippedswab)?？梢允褂闷渌山邮艿氖占b置，包括但不限于棉拭子、宮頸刷、植絨拭子(flockedswab)(形狀與DacroiT.K拭子一樣，但是由尼龍纖維構(gòu)成的拭子，其實(shí)現(xiàn)較多細(xì)胞的收集和較容易釋放細(xì)胞)、宮頸帚(cervical broom)、微型帚(mini broom)、灌洗、或在PAP涂片測(cè)試(Papanicolaou測(cè)試)中經(jīng)常使用的任何收集裝置。宮頸細(xì)胞也可以是活組織檢查標(biāo)本的部分。
[0081]樣品制備
[0082]可以在本公開內(nèi)容的方法中采用TR丨zoM'分離RNA的用途及其它已知的RNA分離方法。通過低滲裂解細(xì)胞團(tuán)粒的樣品制備降低可以干擾測(cè)定法檢測(cè)步驟的內(nèi)源RNA:DNA雜合物的釋放，并且這是優(yōu)選的RNA分離方法。在此樣品制備方法中，經(jīng)由離心機(jī)將細(xì)胞沉淀，除去上清液，并將團(tuán)粒重懸，并裂解細(xì)胞。在裂解后，將細(xì)胞碎片沉淀，并收集上清液(含有RNA)。降低裂解嚴(yán)格性(如通過緩沖液中的鹽和去污劑濃度測(cè)量的)降低自基于甲醇的宮頸標(biāo)本集合生成的臨床背景(圖5和6)。信號(hào):噪音比率也是較高的，并且集合間的背景及干擾的變化性是較低的。其它研究已經(jīng)顯示了低滲裂解由于細(xì)胞與環(huán)境之間的張力差異通過破裂細(xì)胞膜，使細(xì)胞對(duì)大分子可透過來起作用。如此，將細(xì)胞中的RNA從細(xì)胞釋放到溶液中，而測(cè)定法的污染物(諸如內(nèi)源RNA:DNA雜合物)會(huì)在不溶性細(xì)胞碎片中保留。此方法在如下的情況中可以是有用的，即由于增加標(biāo)本量不導(dǎo)致背景升高，標(biāo)本中的RNA量是有限的。[0083]另一種樣品制備方法使用羧基(C00H)磁珠，其可以直接添加至生物學(xué)樣品以濃縮細(xì)胞進(jìn)行DNA分離。經(jīng)由疏水性相互作用將樣品中的細(xì)胞吸引到珠。在使用磁性架將珠沉淀后，可以將上清液取出，并裂解細(xì)胞。也可以使用非磁性C00H珠或其它吸附性顆粒，代替離心以經(jīng)由磁性架來沉淀。在裂解(其通常于65°C發(fā)生15分鐘)后，將珠再次沉淀，并可以在本公開內(nèi)容的方法中直接使用剩余的上清液。雖然降低裂解嚴(yán)格性再次降低此方法中的背景，但是單獨(dú)的水不足以從細(xì)胞釋放。因而，優(yōu)選的是使用包含約1M硫氰酸胍和約0.7%去污劑的裂解緩沖液進(jìn)行本公開內(nèi)容的所有樣品制備方法(參見例如圖5和6)。
[0084]雜交/捕捉:捕捉探針
[0085]在制備樣品并釋放靶RNA后，在對(duì)于至少一種多核苷酸探針與樣品中的靶RNA雜交足夠的條件下使其與至少一種多核苷酸DNA捕捉探針接觸，以形成雙鏈核酸雜合物。DNA捕捉探針可以是全長(zhǎng)的、截短的或合成的DNA。DNA捕捉探針是對(duì)靶RNA特異性的序列。理想地，DNA捕捉探針長(zhǎng)約25至35個(gè)堿基，并且可以與靶RNA的任何區(qū)域互補(bǔ)。DNA捕捉探針的長(zhǎng)度范圍可以為約15至約200個(gè)堿基。在其它方面，捕捉探針的長(zhǎng)度可以是不超過100或不超過50個(gè)核苷酸。在又一些方面，捕捉探針的長(zhǎng)度可以是:20至100、25至100、30至100,35 至 100、40 至 100、45 至 100、或 50 至 100 個(gè)堿基。
[0086]作為例子而非作為限制，捕捉探針可以包含至少一種核苷酸序列，基本上由所述至少一種核苷酸序列組成或由所述至少一種核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與選自下組的核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%同源性:SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:20。在別的方面，捕捉探針包含選自下組的核苷酸序列，由該核苷酸序列組成或基本上由該核苷酸序列組成:SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:20。在一個(gè)方面，提供了對(duì)HPV16特異性的捕捉探針組，其包含至少一種選自下組的捕捉探針:SEQ ID N0:1至SEQ IDN0:10。在一個(gè)方面，提供了對(duì)HPV18特異性的捕捉探針組，其包含至少一種選自下組的捕捉探針:SEQ ID NO: 11 至 SEQ ID NO:20。
·[0087]DNA捕捉探針可以與支持物結(jié)合?！敖Y(jié)合的”包括但不限于化學(xué)附著、共價(jià)結(jié)合和共價(jià)連接。多個(gè)DNA捕捉探針和多個(gè)不同DNA捕捉探針可以與同一支持物(例如同一磁珠)結(jié)合，如圖3中示意性顯示的。最佳結(jié)果僅需要3-5個(gè)不同捕捉探針(見圖4)，如此提供大量靈活性以容許這些探針是序列特異性的，并且不落在在一些變體中可以剪接出去的區(qū)域中。在一個(gè)方面，序列特異性DNA捕捉探針是生物素化的，并且已經(jīng)通過綴合與鏈霉抗生物素蛋白磁珠結(jié)合。捕捉探針在其包含橋接剪接位點(diǎn)的單一寡聚物時(shí)可以分離特定剪接形式。
[0088]支持物包括但不限于珠、磁珠、柱、板、濾紙、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、和浸量尺。可以使用任何支持物，只要它容許提取液相，并提供分出結(jié)合的和未結(jié)合的捕捉探針或抗體的能力。磁珠是特別有用的，因?yàn)槿魬?yīng)用磁場(chǎng)將珠適當(dāng)保持，可以將它們?cè)谌芤褐辛粝?，并且可以提取或棄去液相。較小且具有高表面積的珠是優(yōu)選的，諸如直徑約lym的珠。在某些方面，支持物包含經(jīng)修飾的磁珠，其包被或已經(jīng)對(duì)其附著與靶mRNA互補(bǔ)且特異性的DNA捕捉探針。使用磁場(chǎng)來分離雙鏈核酸/磁珠復(fù)合物與非結(jié)合的核糖核酸。在某些方面，支持物包含經(jīng)修飾的磁珠，其中磁珠通過用對(duì)雙鏈雜合物核酸免疫特異性的一抗包被珠來修飾。使用磁場(chǎng)來分離核酸雜合物/抗體/磁珠復(fù)合物與未結(jié)合的核糖核酸。也可以使用采用電荷轉(zhuǎn)換(charge switching)或娃土捕捉(與磁場(chǎng)形成比對(duì))的其它珠。在另一個(gè)方面，具有檢測(cè)能力的磁珠(諸如Lumonex磁珠)可以捕捉并檢測(cè)特定剪接形式。
[0089]在如上文中描述的靶RNA或靶RNA:DNA雜合物的捕捉后，可以將捕獲的靶RNA或RNA:DNA雜合物與樣品的剩余部分分開，其通過應(yīng)用磁場(chǎng)(在磁珠的情況中)，并洗去非捕獲的核酸進(jìn)行?？梢杂酶鱾€(gè)溫度使用的含有鹽和/或去污劑的緩沖液實(shí)現(xiàn)將不想要的干擾性物質(zhì)洗去。在使用與磁珠不同的支持物時(shí)，進(jìn)行將捕獲的雜合物與樣品的剩余部分分開的備選方法，包括但不限于清洗?？梢允褂妹复龠^程諸如用于雙鏈DNA或RNA:DNA的DNA酶來促進(jìn)靶RNA的分離。
[0090]雜交/捕捉:放大探針
[0091]在為了確保僅保留靶物的清洗步驟后，使信號(hào)放大DNA探針與靶mRNA雜交，其中信號(hào)放大探針是與靶mRNA互補(bǔ)和/或特異性的未標(biāo)記的DNA探針。放大探針對(duì)于靶核酸不需要是特異性的。例如，DNA放大探針可以能夠結(jié)合與設(shè)計(jì)的靶物不同的其它核酸。將與mRNA區(qū)互補(bǔ)的DNA信號(hào)放大探針設(shè)計(jì)，并在混合物中組合，其會(huì)覆蓋特定基因。通過延伸并改變覆蓋，可以確定哪些基因是存在的及RNA的特定剪接形式。覆蓋定義為側(cè)翼有互補(bǔ)信號(hào)探針的靶序列的程度或長(zhǎng)度。信號(hào)放大探針的長(zhǎng)度是大致40個(gè)堿基，但是因?yàn)樗鼈冊(cè)诓蹲教结樦車O(shè)計(jì)，所以一些可以是超過或小于40個(gè)堿基。信號(hào)放大探針的長(zhǎng)度可以是約15至約200個(gè)堿基。在又一些方面，信號(hào)放大探針可以是:20至100、25至100、30至100、35至100、40至100、45至100或50至100個(gè)堿基。升高的覆蓋(即，使多種信號(hào)探針與靶RNA的互補(bǔ)區(qū)雜交)會(huì)導(dǎo)致信號(hào)升高。因此，優(yōu)選的是使用多種探針來獲得放大的信號(hào)。檢測(cè)限部分取決于靶核酸(即，靶基因)的長(zhǎng)度。
[0092]作為例子而非作為限制，放大探針可以包含至少一種核苷酸序列，基本上由所述至少一種核苷酸序列組成或由所述至少一種核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與選自下組的核苷酸序列具有至少7 5%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同源性:SEQ ID NO: 21至SEQ ID NO: 105。在別的方面，放大探針包含核苷酸序列，由核苷酸序列組成或基本上由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列選自下組:SEQ ID N0:21至SEQ ID NO: 105。在一個(gè)方面，提供了對(duì)HPV16特異性的放大探針組，其包含至少一種選自下組的放大探針:SEQ ID NO:21至SEQ ID N0:62。在一個(gè)方面，提供了對(duì)HPV18特異性的放大探針組，其包含至少一種選自下組的放大探針:SEQ ID N0:63至SEQID N0:105。
[0093]組合添加擴(kuò)增信號(hào)探針，其會(huì)在已知的RNA剪接形式的遺傳序列里延伸。信號(hào)放大探針的組合會(huì)決定靶mRNA上的覆蓋程度，并因此決定信號(hào)輸出。來自放大探針的不同組合的所得信號(hào)輸出的比較會(huì)指示特定mRNA剪接形式變體的存在。這樣，此方法是一種“分子尺”，因?yàn)樾盘?hào)輸出依賴于存在的剪接形式。例如，預(yù)期捕捉探針3與E6/7靶mRNA，而非與E1、E2、E4、E5、L1或L2(見例如表3和圖12)雜交。在與捕捉探針3雜交后使用的信號(hào)放大探針1和6會(huì)產(chǎn)生來自剪接E6/7形式的強(qiáng)信號(hào)和來自剪接/整合E6/7形式的弱信號(hào)。通過改變捕捉探針和放大探針的組合和數(shù)目，信號(hào)輸出提供關(guān)于哪些病毒基因表達(dá)(例如其比率)及那些基因的哪些剪接形式表達(dá)的信號(hào)。預(yù)期與臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合的此類信息為癌前宮頸損傷進(jìn)展提供一種較好的預(yù)測(cè)項(xiàng)。
[0094]經(jīng)由測(cè)量mRNA水平表征細(xì)胞中的基因表達(dá)是一種在測(cè)定細(xì)胞是否受到病原體感染，及疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)中有用的工具。
[0095]本公開內(nèi)容提供了一種測(cè)定已知的和未知的剪接形式變體的基因轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度的方法。用于測(cè)量可變剪接轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的可靠且強(qiáng)力的方法是在調(diào)查每種變體的重要性中的一個(gè)重要步驟。迄今為止，剪接變體的精確量化，諸如Northern印跡、RT-PCR和實(shí)時(shí)RT-PCR由于常規(guī)方法的固有限制而是費(fèi)力且困難的。本公開內(nèi)容提供了測(cè)定剪接形式變體的存在的方法。例如，可以如下測(cè)定早期HPV轉(zhuǎn)錄物(例如HPV E6*I)是否攜帶晚期基因序列的問題，即用于早期區(qū)互補(bǔ)的捕捉探針捕捉轉(zhuǎn)錄物，然后用于晚期區(qū)互補(bǔ)的放大探針檢測(cè)；所得的信號(hào)可以指示早期基因轉(zhuǎn)錄物上晚期區(qū)的存在。此外，通過提供會(huì)覆蓋預(yù)測(cè)剪接形式序列的簡(jiǎn)并信號(hào)放大探針組合，可以測(cè)定剪接變體的存在。此外，可以通過選擇的DNA探針捕捉的缺乏指示某個(gè)區(qū)域的缺乏。
[0096]使用識(shí)別RNA: DNA雜合物的分子捕捉/檢測(cè)所得的雜合物。對(duì)雙鏈核酸雜合物特異性的分子包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、蛋白質(zhì)(諸如但不限于RNA酶H)、核酸(包括但不限于適體)、或序列特異性核酸。適體是結(jié)合特定靶分子的較短寡核苷酸或肽分子。它們經(jīng)常通過將其自較大的隨機(jī)序列集合選擇來創(chuàng)建，盡管天然存在的適體(例如核糖開關(guān)(riboswitch)適體)是已知的。
[0097]雜交/捕捉:抗雜合物抗體
[0098]在一個(gè)方面，對(duì)雙鏈核酸雜合物特異性的分子是抗體(抗雜合物抗體)。將雜合物與抗雜合物抗體一起溫育足夠的時(shí)間量，以容許對(duì)雙鏈核酸雜合物的結(jié)合?？闺s合物抗體可以是單克隆或多克隆的。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，抗體是單克隆的。
[0099]在另一個(gè)方面，一抗與支持物結(jié)合。在此方面，在制備樣品并釋放RNA后，在足以使至少一種多核苷酸探針與樣品中的靶RNA雜交的條件下使其與至少一種多核苷酸DNA捕捉探針接觸以形成雙鏈核酸雜合物。通過清洗將靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物形式的靶RNA與未結(jié)合的RNA分開。在為了確保僅保留的RNA是靶RNA的清洗步驟后，使信號(hào)放大DNA探針與靶RNA雜交，其中所述信號(hào)放大探針是與靶RNA互補(bǔ)和/或特異性的未標(biāo)記的DNA探針。捕捉和放大探針與靶RNA的雜交創(chuàng)建雙鏈核酸雜合物。使用識(shí)別RNA:DNA雜合物的分子檢測(cè)所得的雜合物。在一個(gè)優(yōu)選的方面，對(duì)雙鏈核酸雜合物特異性的分子是抗體(抗雜合物抗體)。將雜合物與抗雜 合物抗體一起溫育足夠的時(shí)間量，以容許對(duì)雙鏈核酸雜合物區(qū)的結(jié)合?？闺s合物抗體與支持物結(jié)合，并且對(duì)RNA:DNA雜合物的結(jié)合形成RNA:DNA雜合物:抗體復(fù)合物。將該復(fù)合物與未結(jié)合的抗體分開。在支持物是磁珠的應(yīng)用中，使用磁場(chǎng)來分出任何未結(jié)合的抗體。
[0100]檢測(cè)
[0101]在除去未結(jié)合的抗雜合物抗體后，添加二抗，其中二抗用可檢測(cè)標(biāo)志物標(biāo)記，并且識(shí)別并結(jié)合一抗。檢測(cè)存在于二抗上的標(biāo)記物，如此之事靶核糖核酸的存在。用于檢測(cè)各種標(biāo)記物的方法是本領(lǐng)域中已知的。例如，例如Coutlee, et al.，J.Cl in.Microbiol.27:1002-1007(1989)描述了比色法、放射性、表面等離振子共振或化學(xué)發(fā)光方法。
[0102]例如，可以使用檢測(cè)儀諸如E/Lumina?發(fā)光計(jì)(Source ScientificSystems, Inc., Garden Grove, CA)、Optocomp I? 發(fā)光計(jì)(MGM Instruments, Hamden, CT)等通過化學(xué)發(fā)光用試劑諸如Lum1-Phos?530試劑(Lumigen, Detroit, MI)或DR2 (AppliedBiosystems, Foster City, CA)檢測(cè)與至少一種堿性磷酸酶分子綴合的抗體。如本文中描述的，二抗上標(biāo)記物的檢出指示樣品中與一種或多種探針互補(bǔ)的一種或多種靶核糖核酸的存在。在清洗后，將樣品在檢測(cè)緩沖液中懸浮，所述檢測(cè)緩沖液例如含有二抗上的標(biāo)記物的底物。
[0103]可以將抗雜合物抗體在本測(cè)定法中使用和/或與磁珠偶聯(lián)和/或在支持物上固定化，如下文描述的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，用于捕捉和檢測(cè)靶核酸的抗體是單克隆抗體。一抗和二抗可以是相同的，用于捕捉和檢測(cè)(即由相同雜交骨髓瘤細(xì)胞系生成)，或者可以來自不同雜交骨髓瘤細(xì)胞系及由不同雜交骨髓瘤細(xì)胞系生成。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，用于捕捉和/或檢測(cè)的單克隆一抗和二抗是相同的，并且對(duì)RNA/DNA雜合物是特異性的。還包括對(duì)雙鏈雜合物特異性的抗體的免疫片段或衍生物，其中此類片段或衍生物含有抗體的結(jié)合區(qū)。
[0104]例如，可以使用單克隆RNA:DNA雜合物抗體，其源自與用RNA:DNA雜合物免疫的脾細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞?？梢酝ㄟ^針對(duì)固體支持物上固定化的RNA: DNA雜合物的親和純化來純化雜合物特異性抗體，例如如記載于Kitawaga et al., Mol.1mmunology, 19:413 (1982);及美國(guó)專利N0.4，732，847的，每篇通過提及并入本文。
[0105]可以使用生成或分離抗體，包括人或人工抗體的其它合適方法，包括例如如下的方法，其從文庫(kù)選擇重組抗體(例如單鏈Fv或Fab，或其其它片段)，或者其依賴于免疫能夠生成人抗體全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)(參見例如Jakobovits et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:2551 (1993) ; Jakobovits et al, Nature, 362:255(1993);及美國(guó)專利N0.5，545，806 和 5，545，807)。
[0106]在又一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了試劑盒，其容許檢測(cè)生物學(xué)樣品或含有核酸的樣品中的核糖核酸。在一個(gè)優(yōu)選的方面，試劑盒包含a)與磁珠綴合的DNA捕捉探針；b)DNA放大探針；c)抗雜合物一抗；d)包含二抗的檢測(cè)試劑，其中二抗結(jié)合一抗，并且是可檢測(cè)標(biāo)記的；e)基于去污劑的清洗緩沖液和f)第二檢測(cè)試劑，其包含二抗上標(biāo)記物的底物。優(yōu)選的基于去污劑的清洗緩沖液是40mM Tris-HClU00mM NaCl、0.5%Triton X-100。
`[0107]在某些方面，本公開內(nèi)容的檢測(cè)方法如下檢測(cè)RNA，即首先將靶物捕獲到互補(bǔ)的生物素DNA探針上，所述DNA探針與鏈霉抗生物素蛋白磁珠綴合?？梢詫⒋颂结?珠復(fù)合物預(yù)綴合，并且于4°C持續(xù)幾個(gè)月是穩(wěn)定的。優(yōu)選地，將此捕捉步驟于60°C在不斷搖動(dòng)的情況中實(shí)施，并且容許進(jìn)行約30分鐘(足以容許捕捉的時(shí)間)。然后，將具有捕獲靶物的珠清洗，使得除去任何非靶物RNA序列。由于雜合物捕捉抗體結(jié)合個(gè)別DNA-RNA雜合物，優(yōu)選的是用DNA放大探針覆蓋靶區(qū)域以實(shí)現(xiàn)最大信號(hào)(參見圖1和2)。如此，然后使別的探針與靶mRNA雜交。由于在此點(diǎn)時(shí)僅捕獲靶物，這些探針不需要是序列特異性的，而且可以覆蓋基因的全長(zhǎng)，其排除已經(jīng)由生物素化的特定探針覆蓋的區(qū)域。信號(hào)放大探針與mRNA區(qū)是互補(bǔ)的，并且進(jìn)行設(shè)計(jì)并在混合物中組合，其會(huì)覆蓋特定基因。通過延伸并改變覆蓋，可以測(cè)定特定基因和特定剪接變體。優(yōu)選地，這些信號(hào)放大探針以濃度4.2nM使用。優(yōu)選地，此雜交還于60°C于7.8左右的pH發(fā)生30分鐘。然后，雜交繼之以用上文討論的雜合物捕捉抗體系統(tǒng)檢測(cè)(使用抗雜合物抗體和二抗來檢測(cè)抗雜合物抗體)。
[0108]用于測(cè)定靶核酸的存在、破壞或缺乏的方法
[0109]在另一個(gè)方面，提供了用于測(cè)定樣品中靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括:(a)在足以誘導(dǎo)下列各項(xiàng)形成的條件下處理樣品的第一部分:(α)包含靶核酸的第一組DNA:RNA雜合物；和(β )包含參照核酸的第二組DNA:RNA雜合物；(b)在足以誘導(dǎo)第二組DNA:RNA雜合物，而非第一組DNA:RNA雜合物形成的條件下處理樣品的第二部分；(c)在樣品的第一部分和樣品的第二部分中產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，其中可檢測(cè)信號(hào)具有與DNA:RNA雜合物濃度相關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度；并(d)比較樣品的第一部分中的可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度和樣品的第二部分中的可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，其中:(α)若樣品的第一部分中的可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度大于樣品的第二部分中的可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，則樣品中存在靶核酸；且(β)若樣品的第一部分中的可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度小于或等于樣品的第二部分中的可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，則樣品中缺乏靶核酸。
[0110]如本文中使用的，“樣品的一部分”應(yīng)當(dāng)指以任何方式分開的樣品。例如，可以將樣品依照體積和/或質(zhì)量分成相等的部分?；蛘?，可以通過從樣品扣除不同組分生成不同部分。作為例子而非作為限制，“樣品的一部分”可以指與支持物結(jié)合并與樣品的剩余部分分開的靶核酸和參照核酸的集合。不管生成多少部分，每個(gè)部分應(yīng)當(dāng)包含大致相等量的參照核酸。
[0111]在一個(gè)例示性方面，通過如下的方法形成樣品的第一部分和樣品的第二部分，所述方法包括使樣品與下列各項(xiàng)接觸:(a)在嚴(yán)格條件下對(duì)靶核酸特異性的第一捕捉探針，其中第一捕捉探針與靶核酸的雜交生成第一捕捉復(fù)合物；和(b)在嚴(yán)格條件下對(duì)參照核酸特異性 的第二捕捉探針，其中第二捕捉探針與參照核酸的雜交生成第二捕捉復(fù)合物。然后，可以將捕捉復(fù)合物與支持物結(jié)合。
[0112]第 一和/或第二捕捉探針可以以與支持物共價(jià)結(jié)合方式提供或者備選地可以適合于與支持物結(jié)合。作為例子而非作為限制，可以將捕捉探針用配體修飾，并且用能夠結(jié)合配體的模塊包被支持物。在此類構(gòu)造中，捕捉探針憑借配體與配體結(jié)合模塊之間的結(jié)合與支持物結(jié)合。作為例子而非作為限制，配體可以是生物素，而配體結(jié)合模塊是能夠結(jié)合生物素的分子，諸如親合素和鏈霉抗生物素蛋白。若想要的話，第一和第二捕捉探針可以具有不同配體。在此類情況中，可以提供能夠結(jié)合第一和第二捕捉探針兩者的第一支持物，而提供僅能夠結(jié)合第二捕捉探針的第二支持物。在此類方式中，可以添加進(jìn)一步的特異性水平。
[0113]在某些其它方面，捕捉探針與靶核酸和/或參照核酸形成DNA:RNA雜合物。在此類構(gòu)造中，可以如下形成樣品的各部分，即使樣品與通過能夠結(jié)合DNA:RNA雜合物的實(shí)體，諸如對(duì)雙鏈雜合核酸免疫特異性的抗體(或其片段)修飾的支持物接觸。然后，可以將由捕捉探針和靶序列和/或參照核酸形成的DNA:RNA雜合物結(jié)合到支持物，并且經(jīng)由抗體結(jié)合與樣品的剩余部分分開?？贵w可以與支持物共價(jià)結(jié)合，憑借配體/配體結(jié)合模塊結(jié)合，或者通過包被到支持物的能夠結(jié)合抗體的實(shí)體，諸如Ig特異性抗體結(jié)合。
[0114]在另一個(gè)方面，支持物用本文中稱為錨探針的核酸包被。在此類構(gòu)造中，捕捉探針可以設(shè)計(jì)為具有能夠與錨核酸的至少一部分雜交，由此將捕捉復(fù)合物結(jié)合到支持物的序列。在此類構(gòu)造中，捕捉探針可以包含:(α )能夠在嚴(yán)格條件下與靶序列和/或參照核酸雜交的區(qū)域；和(β)能夠與錨探針序列雜交的區(qū)域。每種捕捉探針的錨探針可以是相同的，或者它可以是不同的。另外，每種捕捉探針可以包含能夠與相同錨探針的不同序列雜交的序列?？梢栽谙嗤虿煌^探針中布置不同序列。
[0115]在另一個(gè)例示性方面:(a)通過包括將第一捕捉復(fù)合物和第二捕捉復(fù)合物捕獲到第一支持物上的方法形成樣品的第一部分；和(b)通過包括將第二捕捉復(fù)合物，而非第一捕捉復(fù)合物捕獲到第二支持物上的方法形成樣品的第二部分。在此類方面，第一支持物可以包含與其共價(jià)結(jié)合的第一和第二捕捉探針(或能夠捕捉其的實(shí)體)，而第二支持物可以包含與其結(jié)合的第二捕捉探針，而非第一捕捉探針(或能夠捕捉其的實(shí)體)。或者，第一和第二支持物可以是基本上相同的。在此類情況中，首先應(yīng)當(dāng)將樣品分開，然后與合適的捕捉探針接觸，之后與相應(yīng)的支持物接觸。
[0116]在另一個(gè)方面，通過如下的方法形成樣品的第一和第二部分，所述方法包括:(a)將第一捕捉復(fù)合物和第二捕捉復(fù)合物捕獲到第一支持物以形成樣品的第一部分；并(b)將第一捕捉復(fù)合物和第二捕捉復(fù)合物捕獲到第二支持物以形成樣品的第二部分。
[0117]在通過捕獲到支持物形成樣品的各部分的情況中，任選地，可以清洗捕捉復(fù)合物以除去非捕獲的核酸?？梢允褂靡愿鱾€(gè)溫度使用的含有鹽和去污劑的緩沖液實(shí)現(xiàn)洗去不想要的干擾性物質(zhì)。
[0118]一旦已經(jīng)將樣品分成第一和第二部分并任選地清洗，通過形成包含靶核酸的第一組DNA:RNA雜合物和包含參照核酸的第二組DNA:RNA雜合物檢測(cè)靶核酸和/或參照核酸。
[0119]在一個(gè)方面，通過使樣品的各部分與能夠與靶序列和/或參照核酸形成DNA:RNA雜合物的信號(hào)探針接觸形成DNA:RNA雜合物。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“信號(hào)探針”指能夠在嚴(yán)格條件下與靶核酸或參照核酸雜交以形成DNA:RNA雜合物的任何寡或多核苷酸。信號(hào)探針可以是但不需要是對(duì)靶序列或參照序列特異性的。例如，信號(hào)探針可以能夠結(jié)合與設(shè)計(jì)的靶物不同的其它核酸。優(yōu)選地，信號(hào)探針的長(zhǎng)度是約15至約200個(gè)堿基。在一些方面，信號(hào)探針設(shè)計(jì)為長(zhǎng)度35至40個(gè)核苷酸。在其它方面，提供了信號(hào)探針組，其包含多個(gè)能夠與靶序列和/或參照序列的獨(dú)特區(qū)域雜交的信號(hào)探針。
[0120]在一個(gè)方面:(a)通過包括使樣品與能夠與靶核酸雜交的第一信號(hào)探針接觸的方法形成第一組DNA:RNA雜合物；并(b)通過包括使樣品與能夠與參照核酸雜交的第二信號(hào)探針接觸的方法形成第二組DNA:RNA雜合物。在每種情況中，應(yīng)當(dāng)使樣品的第一部分與第一和第二信號(hào)探針兩者接 觸。在樣品的第二部分包含靶序列和參照核酸兩者的情況中，不應(yīng)使其與第一信號(hào)探針接觸。
[0121]一旦形成DNA: RNA雜合物，產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，其強(qiáng)度與樣品部分中的DNA: RNA雜合物總濃度相關(guān)聯(lián)。在與樣品的第一部分相比，可檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度在樣品的第二部分中相同或更大的情況中，靶核酸是缺乏的。另一方面，在與樣品的第一部分相比，可檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度在樣品的第二部分中更小的情況中，靶核酸是存在的。
[0122]在一些方面，多個(gè)信號(hào)探針設(shè)計(jì)為使得覆蓋靶核酸和/或參照核酸的實(shí)質(zhì)性部分。通過延伸并改變覆蓋，可以確定存在的大概的靶核酸部分。提高覆蓋(即，使多個(gè)信號(hào)探針與靶核酸的互補(bǔ)區(qū)雜交)會(huì)導(dǎo)致信號(hào)升高。因此，優(yōu)選的是使用多種探針來獲得放大的信號(hào)。檢測(cè)限部分取決于靶核酸(即，靶基因)的長(zhǎng)度。在一個(gè)方面，探針組包含足以覆蓋至少70%的靶序列和/或參照核酸的探針。在其它方面，探針組包含足以覆蓋至少75%、至少80%、至少85%、至少90%和至少95%的靶序列和/或參照核酸的探針。在其它方面，探針組的信號(hào)探針設(shè)計(jì)為具有長(zhǎng)度20至50個(gè)核苷酸的平均長(zhǎng)度。
[0123]在一個(gè)方面，組合添加信號(hào)探針，其會(huì)在懷疑截短或可變剪接的靶mRNA的遺傳序列里延伸。信號(hào)探針的組合會(huì)決定靶mRNA上的覆蓋程度，并且因此決定信號(hào)輸出。比較來自不同信號(hào)探針組合的所得信號(hào)輸出會(huì)指示特定mRNA剪接形式變體的存在。這樣，此方法是一種“分子尺”，因?yàn)樾盘?hào)輸出依賴于存在的剪接形式。
[0124]本公開內(nèi)容還提供了用于測(cè)定高風(fēng)險(xiǎn)HPV E2基因在宿主細(xì)胞中是否表達(dá)或受到破壞的測(cè)定法，其中靶核酸是E2mRNA，且參照核酸選自下組:HPV EUHPV E6/E7、HPV L1和HPV L2mRNA。此類方法也可以應(yīng)用于檢測(cè)HPV對(duì)宿主細(xì)胞基因組中的整合和/或預(yù)測(cè)HPV相關(guān)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和/或癌癥例如宮頸癌的開始。高風(fēng)險(xiǎn)HPV類型包括但不必限于HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68 和 82。
[0125]在某些方面，本公開內(nèi)容的檢測(cè)方法通過使樣品與生物素化的與靶核酸互補(bǔ)的DNA捕捉探針和生物素化的與參照核酸互補(bǔ)的DNA捕捉探針接觸來檢測(cè)mRNA，其中捕捉探針與鏈霉抗生物素蛋白磁珠偶聯(lián)?？梢詫⒋颂结?珠復(fù)合物預(yù)綴合，并且于4°C持續(xù)幾個(gè)月是穩(wěn)定的。優(yōu)選地，將此捕捉步驟于60°C在不斷搖動(dòng)的情況中實(shí)施，并且容許進(jìn)行約30分鐘(足以容許捕捉的時(shí)間)。然后，將具有捕獲靶物的珠清洗，使得除去任何非靶物/參照RNA序列。然后，將珠捕獲的靶物/參照核酸復(fù)合物分成多個(gè)相等部分。然后，使樣品的每個(gè)部分與DNA信號(hào)探針接觸，所述DNA信號(hào)探針足以覆蓋參照mRNA的相當(dāng)大的部分。還將各部分與DNA信號(hào)探針接觸，所述DNA信號(hào)探針足以覆蓋靶mRNA的不斷增加的部分。不應(yīng)使至少一個(gè)部分與能夠與靶mRNA雜交的信號(hào)探針接觸。由于在此點(diǎn)時(shí)僅捕獲靶物和/或參照mRNA，這些探針不需要是序列特異性的，而且可以覆蓋mRNA的全長(zhǎng)，其排除已經(jīng)由生物素化的特定探針覆蓋的區(qū)域。優(yōu)選地，這些信號(hào)探針以4.2nM左右的濃度使用。優(yōu)選地，此雜交還于60°C于7.8左右的pH發(fā)生30分鐘。然后，雜交繼之以用上文討論的雜合物捕捉抗體系統(tǒng)檢測(cè)(使用抗雜合物抗體和二抗來檢測(cè)抗雜合物抗體)。
[0126]本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明可以在許多平臺(tái)上實(shí)施，所述平臺(tái)包括但不限于管、浸量尺、微陣列、微板、384孔板、其它微量滴定板和微流控系統(tǒng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，如與發(fā)展中國(guó)家相關(guān)的，目前可以利用低技術(shù)方法諸如滴瓶、橡膠泡(rubber bulb)、巴斯德(Pasteur)移液管、或噴射瓶(squirt bottle),用于牽涉液體流動(dòng)的步驟。這些裝置在測(cè)定法需要的合適范圍內(nèi)投遞相對(duì)精確的體積。在一個(gè)方面，公開內(nèi)容的方法不包括自動(dòng)化移液器或其它電池供電或能量供電的移液裝置。
實(shí)施例
[0127]實(shí)施例1
[0128]經(jīng)由細(xì)胞團(tuán)粒的低滲裂解的樣品制備
[0129]內(nèi)源雜合物對(duì)檢測(cè)測(cè)定法提出一項(xiàng)獨(dú)特的考驗(yàn)，因?yàn)樗鼈儠?huì)被雜合物捕捉抗體檢出。如此，優(yōu)選地，樣品制備使內(nèi)源雜合物的背景失活，這通過隔絕(sequestration)、結(jié)合或降解阻止它們 增加信號(hào)來進(jìn)行。低滲水解依賴于前一種策略。在此方法中，經(jīng)由離心機(jī)將細(xì)胞沉淀，將上清液除去，并裂解團(tuán)粒。如圖6中顯示的，通過改變緩沖液中的鹽和去污劑濃度降低裂解嚴(yán)格性降低由基于甲醇的宮頸標(biāo)本集合產(chǎn)生的臨床背景。信號(hào):噪音比也是較高的，并且集合間背景和干擾的變化性是較低的(表2)。其它研究已經(jīng)顯示了低滲裂解如下起作用，即由于與環(huán)境相比細(xì)胞張力的差異使細(xì)胞膜破裂，使細(xì)胞對(duì)較為可溶的mRNA(但對(duì)于雜合物和核DNA而言不太可溶)可透過。如此，將細(xì)胞中的RNA從細(xì)胞釋放到溶液中，而測(cè)定法的污染物(諸如雜合物)會(huì)在不溶性細(xì)胞碎片中保留。此方法在如下的情況中可以是有用的，即由于增加標(biāo)本量不導(dǎo)致背景升高，標(biāo)本中的RNA量是有限的(圖7)。使用將HPV陽(yáng)性細(xì)胞摻入陰性宮頸標(biāo)本集合中的模型，相繼的低滲裂解和本公開內(nèi)容的檢測(cè)方法可以檢出僅來自1000個(gè)細(xì)胞的HPV E6/7RNA(圖8)。
[0130]實(shí)施例2[0131]經(jīng)由羧基磁珠的樣品制備
[0132]已經(jīng)在本公開內(nèi)容的方法中使用方面表征的另一種樣品制備方法使用經(jīng)羧基修飾的(C00H)磁珠，其可以直接添加至生物學(xué)樣品(例如Sera-Mag?經(jīng)羧酸鹽修飾的磁性顆粒；Thermo Fisher Scientific, Inc.)。經(jīng)由疏水性相互作用將樣品中的細(xì)胞吸引到珠。在使用磁性架使珠沉淀后，可以將上清液除去，并裂解細(xì)胞。裂解后，將珠再次沉淀，并轉(zhuǎn)移剩余的上清液，用于本公開內(nèi)容的方法。雖然降低裂解嚴(yán)格性再次降低此方法中的背景(參見表1)，單獨(dú)的水不足以從細(xì)胞釋放。表1中的數(shù)字代表2%溶液(不是最終溶液)的百分比。此外，優(yōu)選的裂解緩沖液是約1M硫氰酸胍和約0.7%去污劑(見圖9)，因?yàn)樗С至呀夂退鈨烧?。若在雜交捕捉步驟前將其稀釋，則可以使用較強(qiáng)的裂解緩沖液濃度。如圖10中顯示的，將細(xì)胞捕獲到珠上是二相反應(yīng)。將羧基珠直接摻入基于Pruerv(..:yU<;的宮頸細(xì)胞樣品中。將占樣品中所有細(xì)胞的約50-60%在暴露的第一分鐘內(nèi)吸引到珠。此過程達(dá)到穩(wěn)定水平，持續(xù)至少15分鐘，但是添加珠后約30分鐘，已經(jīng)捕獲至少95%的細(xì)胞(如通過對(duì)上清液中剩余的細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量的；見圖10)。圖11顯示了使用本公開內(nèi)容的方法，可以僅使用約1000個(gè)HPV陽(yáng)性細(xì)胞獲得結(jié)果；相繼的羧基珠細(xì)胞捕捉和本公開內(nèi)容的檢測(cè)方法比相繼的低滲細(xì)胞裂解和本公開內(nèi)容的檢測(cè)方法在從細(xì)胞獲得mRNA方面更有效(見圖 11)。
[0133]表1
[0134]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的核酸,其具有不超過200個(gè)核苷酸的總體長(zhǎng)度且包含至少一種與選自下組的核苷酸序列具有至少75%同源性的核苷酸序列:SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 105和SEQID NO: 111至SEQ ID NO:308、其RNA等同物及其互補(bǔ)物。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸探針，其具有不超過100個(gè)核苷酸的總體長(zhǎng)度。
3.權(quán)利要求1的分離的核酸,其具有不超過50個(gè)核苷酸的總體長(zhǎng)度。
4.依照權(quán)利要求1的分離的核酸，其由選自下組的核苷酸序列組成:SEQID N0:1至SEQ ID NO: 105 和 SEQ ID NO: 111 至 SEQ ID NO:308、其 RNA 等同物及其互補(bǔ)物。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的分離的核酸，其中所述核酸能夠在嚴(yán)格條件下與下列各項(xiàng)雜交: (a)人乳頭瘤病毒(HPV)基因組中選自由HPV16和HPV18組成的組的部分， (b)源自所述HPV基因組的mRNA轉(zhuǎn)錄物，或 (c)所述mRNA的互補(bǔ)物。
6.權(quán)利要求1-5的分離的核酸，其中所述核酸能夠在高嚴(yán)格性條件下與下列各項(xiàng)雜交: (a)人乳頭瘤病毒(HPV)基因組中選自由HPV16和HPV18組成的組的部分， (b)源自所述HPV基因組的mRNA轉(zhuǎn)錄物，或 (c)所述mRNA的互補(bǔ)物。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的分離的核酸，其中所述核酸不能在嚴(yán)格條件下與超過一類人乳頭瘤病毒(HPV)基因組雜交。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的分離的核酸，其能夠在嚴(yán)格條件下與選自下組的HPV16或HPV18基因和/或mRNA雜交:E2和E6/E7。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離的核酸，該分離的核酸在其整個(gè)長(zhǎng)度間與HPV16或HPV18基因中選自下組的部分具有至少75%同源性:E2和E6/E7。
10.一種核酸探針，其包含依照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的分離的核酸，且任選地進(jìn)一步包含可檢測(cè)標(biāo)記物和/或配體。
11.權(quán)利要求10的核酸探針，其中所述核酸探針與固體支持物結(jié)合。
12.—種探針組，其包含依照權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的至少一種核酸探針。
13.一種檢測(cè)靶RNA存在的方法，該方法包括: a)提供至少一種DNA捕捉探針，其中所述至少一種DNA捕捉探針與支持物結(jié)合； b)使所述靶RNA與所述至少一種DNA捕捉探針雜交，生成靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物； c)分離所述靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物； d)提供至少一種DNA放大探針，并使所述至少一種DNA放大探針與所述靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物雜交，生成靶RNA:DNA捕捉/放大探針復(fù)合物； e)提供抗RNA:DNA雜合物抗體，并將所述靶RNA:DNA捕捉/放大探針復(fù)合物與所述抗體一起溫育，生成靶RNA:DNA:抗體復(fù)合物； f)檢出所述抗體，其中所述檢出指示所述靶RNA的存在， 其中所述捕捉探針和/或放大探針包含依照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的分離的核酸。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述靶RNA是剪接變體，且其中選擇所述至少一種DNA捕捉探針和所述至少一種DNA放大探針以檢測(cè)所述剪接變體的存在。
15.一種檢測(cè)靶RNA的存在的方法，該方法包括: a)提供至少一種DNA捕捉探針； b)提供第一抗RNA:DNA雜合物抗體，其中所述第一抗RNA:DNA雜合物抗體與支持物結(jié)合； c)使所述IERNA與所述至少一種DNA捕捉探針雜交，生成|ERNA:DNA捕捉探針復(fù)合物； d)使所述靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物與所述抗RNA:DNA雜合物抗體一起溫育，生成結(jié)合的靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物； e)提供至少一種DNA放大探針，并使所述至少一種DNA放大探針與所述結(jié)合的靶RNA:DNA捕捉探針復(fù)合物雜交，生成結(jié)合的靶RNA:DNA捕捉/放大探針復(fù)合物； f)提供第二抗RNA:DNA雜合物抗體，并將所述結(jié)合的靶RNA:DNA捕捉/放大探針復(fù)合物與所述第二抗RNA:DNA雜合物抗體一起溫育，生成結(jié)合的靶RNA:DNA:抗體復(fù)合物； g)檢出所述第二抗RNA:DNA雜合物抗體，其中所述檢出指示所述靶RNA的存在， 其中至少一種所述捕捉探針和/或放大探針包含依照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的分離的核酸。
16.權(quán)利要求15的 方法，其中所述靶RNA是剪接變體，且其中選擇所述至少一種DNA捕捉探針和所述至少一種DNA放大探針以檢測(cè)所述剪接變體的存在。
17.一種用于測(cè)定靶核酸在樣品中是否缺乏或受破壞的方法，所述方法包括: a)在足以誘導(dǎo)下列各項(xiàng)形成的條件下處理所述樣品的第一部分: i)包含所述靶核酸的第一組DNA:RNA雜合物；和 ii)包含參照核酸的第二組DNA:RNA雜合物； b)在足以誘導(dǎo)所述第二組DNA:RNA雜合物，而非所述第一組DNA:RNA雜合物形成的條件下處理所述樣品的第二部分； c)在所述樣品的所述第一部分和所述樣品的所述第二部分中產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，其中所述可檢測(cè)信號(hào)具有與DNA:RNA雜合物濃度相關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度；及 d)比較所述樣品的所述第一部分中的所述可檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度和所述樣品的所述第二部分中的所述可檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度，其中: i)若所述樣品的所述第一部分中的所述可檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度大于所述樣品的所述第二部分中的所述可檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度，則所述靶核酸是完整的且存在于所述樣品中；及 ?)若所述樣品的所述第一部分中的所述可檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度小于或等于所述樣品的所述第二部分中的所述可檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度，則所述靶核酸是樣品缺乏的。
18.權(quán)利要求17的方法，其中通過包括使所述樣品與下列各項(xiàng)接觸的方法形成所述樣品的所述第一部分和所述樣品的所述第二部分: a)在嚴(yán)格條件下對(duì)所述靶核酸特異性的第一捕捉探針，其中所述第一捕捉探針與所述靶核酸的雜交生成第一捕捉復(fù)合物；和 b)在嚴(yán)格條件下對(duì)所述參照核酸特異性的第二捕捉探針，其中所述第二捕捉探針與所述參照核酸的雜交生成第二捕捉復(fù)合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其進(jìn)一步包括將所述第一捕捉復(fù)合物和所述第二捕捉復(fù)合物捕捉到支持物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一和第二捕捉探針與所述支持物結(jié)合或適合于與所述支持物結(jié)合。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述捕捉探針包含配體，且所述支持物包含配體結(jié)合模塊。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述第一捕捉探針和所述第二捕捉探針包含相同配體。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述第一捕捉探針和所述第二捕捉探針包含不同配體，其中: a)使所述樣品的所述第一部分與第一組固體支持物接觸，所述第一組固體支持物包含能夠結(jié)合所述第一捕捉探針的所述配體的配體結(jié)合模塊和能夠結(jié)合所述第二捕捉探針的所述配體的配體結(jié)合模塊；和 b)使所述樣品的所述第二部分與第二組固體支持物接觸，所述第二組固體支持物包含能夠結(jié)合所述第二捕捉探針，而非所述第一捕捉探針的所述配體的配體結(jié)合模塊。
24.權(quán)利要求23的方法，其中使所述樣品的所述第一部分和所述樣品的所述第二部分與下列各項(xiàng)接觸: i)第一探針組，其包含多個(gè)能夠與所述靶核酸雜交的信號(hào)探針；和 ?)第二探針組，其包含多個(gè)能夠在嚴(yán)格條件下與所述參照核酸雜交的信號(hào)探針。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述第一捕捉探針和所述第二捕捉探針是生物素化的，且其中所述第一支持物和所述第二支持物包含生物素結(jié)合模塊。
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述捕捉探針與所述支持物共價(jià)結(jié)合。
27.權(quán)利要求19的方法，其中: a)所述第一和第二捕捉復(fù)合物包含DNA:RNA雜合物；并 b)將所述第一和第二捕捉復(fù)合物捕捉到所述第一和第二支持物，其通過包括使所述第一和第二捕捉復(fù)合物與能夠特異性結(jié)合DNA:RNA雜合物的實(shí)體接觸的方法進(jìn)行，其中所述能夠特異性結(jié)合DNA:RNA雜合物的實(shí)體與所述支持物結(jié)合或適合于與所述支持物結(jié)合。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述能夠特異性結(jié)合DNA:RNA雜合物的實(shí)體包括配體，且所述第一和第二支持物包含配體結(jié)合模塊。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述能夠特異性結(jié)合DNA:RNA雜合物的實(shí)體是生物素化的，且其中所述支持物包含生物素結(jié)合模塊。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述能夠特異性結(jié)合DNA:RNA雜合物的實(shí)體與所述支持物共價(jià)結(jié)合。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述能夠特異性結(jié)合DNA:RNA雜合物的實(shí)體是DNA:RNA雜合物特異性抗體或其片段。
32.權(quán)利要求19的方法，其中: a)所述第一捕捉探針包含: i)能夠在嚴(yán)格條件下與所述靶核酸雜交的區(qū)域；和 ii)能夠與錨探針的第一核酸序列雜交的區(qū)域； b)所述第二捕捉探針包含: i)能夠在嚴(yán)格條件下與所述靶核酸雜交的區(qū)域；和 ii)能夠與錨探針的第二核酸序列雜交的區(qū)域， 其中所述錨探針與所述第一支持物和/或第二支持物結(jié)合或適合于與所述第一支持物和/或第二支持物結(jié)合。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列是相同的。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列是不同的。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列在同一錨探針中布置。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列在不同錨探針中布置。
37.權(quán)利要求32的方法，其中: a)所述第一支持物含有包含所述第一核酸序列的錨探針和包含第二核酸序列的錨探針；和 b)所述第二支持物含有包含所述第二核酸序列的錨探針，但是不含包含所述第一核酸序列的錨探針。
38.權(quán)利要求17的方法，其中: a)通過包括使所述樣品與能夠與所述靶核酸雜交的第一信號(hào)探針接觸的方法形成所述第一組DNA: RNA雜合物；并 b)通過包括使所 述樣品與能夠與所述參照核酸雜交的第二信號(hào)探針接觸的方法形成所述第二組DNA: RNA雜合物。
39.權(quán)利要求38的方法，其中: a)使所述樣品的所述第一部分與所述第一信號(hào)探針和所述第二信號(hào)探針接觸；并 b)使所述樣品的所述第二部分與所述第二信號(hào)探針，而非所述第一信號(hào)探針接觸， 其中所述第一信號(hào)探針在嚴(yán)格條件下對(duì)所述靶核酸是特異性的，且所述第二信號(hào)探針在嚴(yán)格條件下對(duì)所述參照核酸是特異性的。
40.權(quán)利要求28的方法，其中: a)所述第一信號(hào)探針在第一探針組中布置，所述第一探針組包含多個(gè)能夠與所述靶核酸雜交的信號(hào)探針；并且 b)所述第二信號(hào)探針在第二探針組中布置，所述第二探針組包含多個(gè)能夠與所述參照核酸雜交的信號(hào)探針。
41.權(quán)利要求40的方法，其中: a)所述第一探針組的所述多個(gè)信號(hào)探針能夠與所述靶核酸的至少70%雜交； b)所述第二探針組的所述多個(gè)信號(hào)探針能夠與所述參照核酸的至少70%雜交。
42.權(quán)利要求17的方法，其中通過包括使所述樣品的所述第一部分和所述樣品的所述第二部分與能夠特異性結(jié)合DNA:RNA雜合物的實(shí)體接觸的方法產(chǎn)生所述可檢測(cè)信號(hào)。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述能夠特異性結(jié)合DNA:RNA雜合物的實(shí)體是DNA:RNA雜合物特異性抗體或其片段。
44.權(quán)利要求17的方法，其包括: a)通過如下的方法生成所述樣品的所述第一部分和所述樣品的所述第二部分，所述方法包括: i)使所述樣品至少與在嚴(yán)格條件下對(duì)所述靶核酸特異性的第一生物素化的捕捉探針接觸；?)使所述樣品至少與在嚴(yán)格條件下對(duì)所述參照核酸特異性的第二生物素化的捕捉探針接觸； iii)在如下條件下使所述樣品與經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠接觸，所述條件足以容許所述生物素化的捕捉探針與所述經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白包被的珠結(jié)合；并 iv)將所述經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白包被的珠分入不同容器中以形成所述樣品的所述第一部分和所述樣品的所述第二部分； b)通過包括使所述樣品的所述第一部分與探針混合物接觸的方法在所述樣品的所述第一部分中形成所述第一組DNA:RNA雜合物和所述第二組DNA:RNA雜合物，所述探針混合物包含: i)多個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記的核酸探針，其能夠在嚴(yán)格條件下與所述靶核酸雜交，其中所述多個(gè)足以覆蓋所述靶核酸；和 ?)多個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記的核酸探針，其能夠在嚴(yán)格條件下與所述參照核酸雜交，其中所述多個(gè)足以覆蓋所述靶核酸；并 c)通過包括使所述樣品的所述第二部分與探針混合物接觸的方法在所述樣品的所述第二部分中形成所述第二組DNA:RNA雜合物，所述探針混合物包含多個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)探針，其能夠在嚴(yán)格條件下與所述參照核酸雜交，其中所述多個(gè)足以覆蓋所述靶核酸， 其中通過所述可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)探針產(chǎn)生所述可檢測(cè)信號(hào)。
45.權(quán)利要求17的方法，其中: a)所述靶核酸是HPV E2核酸；且 b)所述參照核酸選自下組: i)HPVEl 核酸， ii)HPVE6/E7 核酸， iii)HPVL1 核酸， iv)HPVL2 核酸。
46.權(quán)利要求45的方法，其中檢測(cè)參照核酸組，該組包含至少兩種選自下組的參照核酸:
i)HPVElmRNA 或 cDNA，
ii)HPVE6/E7mRNA 或 cDNA，
iii)HPVLlmRNA 或 cDNA ;和
iv)HPVL2mRNA 或 cDNA。
47.權(quán)利要求45或46的方法，其中所述參照核酸組包含:
i)HPVElmRNA ；
ii)HPVE6/E7mRNA ；
iii)HPVLlmRNA ;和
iv)HPVL2mRNA。
48.一種預(yù)測(cè)患者中HPV誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化開始的方法，所述方法包括通過權(quán)利要求45-47中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)受HPV感染的源自患者的組織中HPVE2mRNA的存在或缺乏，其中HPV E2mRNA的缺乏指示所述HPV誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化的開始。
49.一種檢測(cè)HPV基因組整合入宿主細(xì)胞基因組中的方法，所述方法包括通過權(quán)利要求45-47中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)受HPV感染的源自患者的組織中HPV E2mRNA的存在或缺乏，其中HPV E2mRNA的缺乏指示所·述HPV基因組整合入宿主細(xì)胞基因組中。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103597095SQ201280020071
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年2月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月24日
【發(fā)明者】B.洛維, A.K.福爾布萊特, I.納扎倫科 申請(qǐng)人:奇亞根蓋瑟斯堡股份有限公司