專利名稱：癌細(xì)胞濃縮過濾器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
癌細(xì)胞濃縮過濾器技術(shù)領(lǐng)域[0001]本實用新型涉及能夠高效捕獲血中循環(huán)癌細(xì)胞(Circulating Tumor Cell,以下, 視情況稱為“CTC”。)的過濾器。
背景技術(shù)：
[0002]癌細(xì)胞濃縮的研究 臨床的意義非常大，如果能夠濃縮血液中的癌細(xì)胞，則可以應(yīng)用于癌的診斷。例如，癌的預(yù)后和治療的最重要的因素是初診時和處理時有無癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞初期的擴(kuò)散遍及末梢血中的情況下，檢測出CTC是判斷癌的病情發(fā)展的有用手段。然而，由于在血液中，紅血球、白血球等血液成分以絕對多數(shù)存在，因此難以檢測出極少量的CTC。[0003]近年，提出了通過使用利用了聚對二甲苯(parylene)的過濾器來有效檢測出少量的CTC的方法(例如，參照專利文獻(xiàn)I)。[0004]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)[0005]專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :國際公開第2010 / 135603號實用新型內(nèi)容[0007]實用新型要解決的課題[0008]開始發(fā)生轉(zhuǎn)移的一般癌患者的情況下，相對于血液中每100億個血球細(xì)胞，CTC只不過大概存在I個。高效捕獲這樣的極低濃度的CTC是非常困難的。[0009]CTC與血液中的血球細(xì)胞，例如紅血球、白血球、或血小板等相比，尺寸大一圈。因此，理論上，能夠適用機(jī)械過濾法而除去這些血球成分，從而濃縮CTC。然而，白血球中存在具有與CTC相同程度的尺寸的細(xì)胞。因此，就以往的過濾器而言，存在如下情況濃縮的CTC 中混入許多白血球，難以高精度地檢測出CTC。[0010]因此，本實用新型的目的在于提供一種能夠減少血球成分、特別是白血球的殘存，并以高捕獲率濃縮CTC的過濾器。[0011]解決課題的方案[0012]本實用新型提供一種癌細(xì)胞濃縮過濾器，其包含形成有多個貫通孔的金屬基板， 貫通孔的開口形狀為橢圓、圓、長方形、正方形、圓角長方形或多角形中的I種以上的形狀。[0013]根據(jù)上述本實用新型的過濾器，能夠減少血球成分的殘存，并以高捕獲率濃縮 CTC0此處，殘存是指細(xì)胞未通過過濾器而殘留于過濾器上。由于金屬的加工性優(yōu)異，因此能夠提高過濾器的加工精度。從而能夠減少血球成分的殘存，并實現(xiàn)CTC的高捕獲率。[0014]另外，由于金屬與塑料等其他的材料相比是剛性的，因此即使從外部施加力，其尺寸、形狀也可維持。因此認(rèn)為，使比貫通孔稍大的血液成分(特別是白血球)變形而通過，能夠進(jìn)行高精度的分離·濃縮。白血球中存在具有與CTC相同程度的尺寸的細(xì)胞，有時僅憑借尺寸的差異無法以高濃度僅辨別出CTC。然而，白血球由于與癌細(xì)胞相比變形能力大，因此通過吸引、加壓等產(chǎn)生的外部的力，能夠通過比自身小的孔，從而能夠與CTC分離。[0015]另外，通過使上述貫通孔的開口形狀為橢圓、圓、長方形、正方形、圓角長方形或多角形中的I種以上的形狀，細(xì)胞不易堵塞貫通孔，能夠提高血液中的血球細(xì)胞的透過性，并實現(xiàn)CTC的高捕獲率。[0016]上述金屬基板的材料優(yōu)選為金、銀、銅、鋁、鎢、鎳、鉻、不銹鋼或它們的合金中的I種。[0017]這些金屬的加工性優(yōu)異，能夠進(jìn)一步提高過濾器的加工精度。從而能夠減少血球成分的殘存，并實現(xiàn)更高的CTC的捕獲率。[0018]上述貫通孔的開口形狀優(yōu)選為短邊的長度為5. O 15. O μ m的長方形或圓角長方形。圓角長方形是指由2條相等長度的長邊和2個半圓形構(gòu)成的形狀。通過使貫通孔的開口形狀為上述尺寸的長方形或圓角長方形，能夠進(jìn)一步高效防止過濾器的堵塞。[0019]上述貫通孔的平均開口率優(yōu)選為O. I 50%。通過使平均開口率處于該范圍，能夠?qū)崿F(xiàn)更高的CT C的捕獲率。[0020]上述過濾器的厚度優(yōu)選為3 100 μ m。該范圍的膜壓的過濾器容易操作，也適于精密加工。[0021]上述過濾器優(yōu)選為末梢血液、腹水或胸水中的癌細(xì)胞用，且優(yōu)選為小細(xì)胞肺癌或非小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞用。[0022]上述過濾器的結(jié)構(gòu)特別適于這些癌細(xì)胞的濃縮。[0023]實用新型的效果[0024]根據(jù)本實用新型，可以提供一種能夠減少白血球的殘存，且以高捕獲率濃縮CTC 的過濾器。


[0025]圖I (A)是表不過濾器的一個實施方式的概略圖。(B)是一個實施方式的過濾器的貫通孔的頂視圖。[0026]符號說明[0027]10 :貫通孔，20 :基板，30 :表面，100 :過濾器,a :短邊，b :長邊，c :半徑。
具體實施方式
[0028]以下，視情況一邊參照附圖一邊說明優(yōu)選的實施方式。另外，附圖的說明中對同一要素附上同一符號，并省略重復(fù)說明。另外，附圖中，為了容易理解，將一部分夸大描繪，尺寸比率未必與說明的尺寸比率一致。[0029]圖I (A)是表示過濾器的一個實施方式的概略圖。過濾器100包含形成有多個貫通孔10的基板20。貫通孔10的開口形狀是圓角長方形。貫通孔10的配置可以是圖I(A) 那樣的成列配置，也可以是每列錯位配置的鋸齒配置，還可以是任意配置的無規(guī)配置。[0030]圖I (B)是上述實施方式的過濾器的貫通孔10的頂視圖。貫通孔10的開口形狀是與短邊為a、長邊為b的長方形的短邊鄰接，半徑為c的2個半圓形結(jié)合而成的形狀。一個實施方式中，a、b、c分別為8、22和4 μ m。[0031]基板(過濾器)的材質(zhì)為金屬。作為金屬，可以例示金、銀等貴金屬，銅、鋁、鎢、鎳、4鉻等賤金屬，以及這些金屬的合金，但并不限定于此。金屬可以以單體使用，也可以為了賦予功能性而作為與其他的金屬的合金或金屬的氧化物使用。從價格、獲得的容易度的觀點出發(fā)，優(yōu)選使用鎳、銅和以它們?yōu)橹鞒煞值慕饘?。此處，主成分是指，在形成上述基板的材料中?0重量％以上的成分?？梢允褂霉饪涛g(photolithography)等方法在這些金屬上形成貫通孔。[0032]作為貫通孔的開口形狀，可以例示橢圓、圓、長方形、正方形、圓角長方形、多角形等。從能夠高效地捕獲癌細(xì)胞的觀點出發(fā)，優(yōu)選圓、長方形或圓角長方形。另外，從防止過濾器的堵塞的觀點出發(fā)，特別優(yōu)選長方形或圓角長方形。[0033]一般的CTC的大小為直徑IOym以上。此處，細(xì)胞的直徑是指，將用顯微鏡觀察時的細(xì)胞的輪廓上的任意2點連結(jié)的直線中最長的直線的長度。因此，從血球成分的透過性和CTC的捕捉性能的觀點出發(fā)，貫通孔的平均孔徑優(yōu)選為5 15 μ m，更優(yōu)選為6 12 μ m， 特別優(yōu)選為7 10 μ m。本說明書中，開口形狀是橢圓、長方形、多角形等圓以外的形狀的孔徑是指，能夠通過各個貫通孔的球的直徑的最大值。就貫通孔的孔徑而言，在例如開口形狀是長方形或圓角長方形的情況下為該長方形或圓角長方形的短邊的長度，在開口形狀是多角形的情況下為該多角形的內(nèi)接圓的直徑。開口形狀是長方形、圓角長方形時，即使在CTC、 白血球充滿貫通孔的情況下，在開口部，也可以在開口形狀的長邊方向上產(chǎn)生間隙。經(jīng)由該間隙，液體能夠通過，因此能夠防止過濾器的堵塞。[0034]過濾器的貫通孔的平均開口率優(yōu)選O. I 50%，更優(yōu)選O. 5 40%，特別優(yōu)選I 30%，最優(yōu)選I 10%。此處，開口率是指在過濾器上的規(guī)定區(qū)域中，貫通孔相對于該區(qū)域的面積所占的面積。平均開口率是指貫通孔相對于過濾器整體的面積所占的面積。從防止堵塞的觀點出發(fā)，平均開口率優(yōu)選越大越好，但超過50%時，存在過濾器的強(qiáng)度降低、或者加工困難的情況。另外小于O. 1%時，由于容易發(fā)生堵塞，因此有時過濾器的癌細(xì)胞濃縮性能降低。[0035]過濾器的厚度優(yōu)選為3 100 μ m,更優(yōu)選為5 50 μ m,特別優(yōu)選為10 30 μ m。 基板的厚度比3 μ m薄時，存在過濾器的強(qiáng)度降低、操作困難的情況。另外，基板的厚度超過 100 μ m時，由于消耗所需量以上的材料、或者加工花費較長時間，因此有時對成本不利、或者精密加工本身困難。[0036]接下來，說明本實施方式的過濾器的制造方法。過濾器的制造方法沒有特別限制， 例如可舉出，采用利用光刻蝕法，實施蝕刻、電鍍的制造方法。以下說明利用光刻蝕法等的制造方法。首先，在由不銹鋼等構(gòu)成的支持體上貼合感光性的抗蝕膜(感光層)。接著，將具有過濾器的貫通孔的開口形狀的圖案的掩模固定在感光層上。接下來，從掩模上照射光(活性光線)。光照射后，在感光層上有支持體的情況下將其除去，通過利用堿性水溶液、水系顯影液和有機(jī)溶劑等顯影液的濕式顯影，或干式顯影等除去未曝光部，從而顯影，形成抗蝕圖案。接下來，將顯影的抗蝕圖案作為掩模，在未遮掩而露出的基板上進(jìn)行鍍敷。作為鍍敷的方法，例如可舉出鍍銅、焊錫鍍敷、鍍鎳、鍍金等。鍍敷処理后，將鍍層從支持體和感光層上剝離時，可得到鍍層。該鍍層為過濾器?？梢詫λ玫倪^濾器的表面進(jìn)行粗化處理。作為粗化處理的方法，可舉出利用酸性或堿性水溶液等的化學(xué)蝕刻、噴砂等物理處理等。[0037]—個實施方式中，通過將過濾器裝入流路內(nèi)，并向流路中導(dǎo)入血液，從而可以濃縮 CTC。對于向流路導(dǎo)入血液而言,可以例示使用從流路的入口方向加壓的方法、使用從流路CN 202730123 U書明說4/5頁的出口方向減壓的方法、使用螺動泵(peristaltic pump)的方法等。另外,在例如由ImL的血液濃縮CTC的情況下,所使用的過濾器的面積適合為I. O 10. 0cm2。[0038]實施例[0039](實施例I)[0040](過濾器的制作)[0041]將抗蝕膜(PHOTEK ( 7才f ^ )Η_Υ920，20μπι厚，日立化成工業(yè)株式會社制)貼合在IOmm見方的不銹鋼板(SUS304，精加工3 / 4Η，厚度100 μ m，日新制鋼(株)制)的一面。貼合的條件是輥溫度105°C、壓力O. 5MPa、線速度Im /分鐘。接著，將形成為光的透過部為8X 30 μ m的圓角長方形、其間距為短軸方向60 μ m、長軸方向60 μ m的負(fù)片(negative film)靜置于不銹鋼板的貼合了抗蝕膜的表面上。該圓角長方形是圖I (B)所示的形狀，是圖I (B)的a、b和c分別為8、22和4μπι的形狀。此處，長軸方向是指圓角長方形的長邊方向，短軸方向是指與長軸方向垂直相交的方向。本實施例中，使用朝向同一方向的圓角長方形在長軸方向和短軸方向上以一定間距成列的負(fù)片。接下來，在600mmHg以下的真空下，使用紫外線照射裝置，從載置了負(fù)片的不銹鋼板的上部照射IOOmJ / cm2紫外線。接下來，用1%碳酸鈉水溶液進(jìn)行顯影，在不銹鋼板上形成抗蝕層。在PH調(diào)整為4. 5的鍍鎳液中，在該帶抗蝕膜的基材上，在50°C實施約20分鐘鍍鎳。將鍍鎳液的組成示于表I。[0043]表I[0044]鍍液組成濃度(g / L)氨基磺酸鎳450氯化鎳5硼酸30[0045]將所得的鍍鎳層從基材的不銹鋼板上剝離，用堿剝離液剝離抗蝕膜，得到厚度為 20 μ m、平均開口率為6. 7%的實施例I的過濾器。[0046](實施例2)[0047]使用形成為直徑8μπι的圓形的光的透過部以10000個/ cm2的密度等間隔地配置的負(fù)片來形成抗蝕層，除此以外，與實施例I同樣地操作，制作厚度為20μπκ平均開口率為I. 4%的實施例2的過濾器。[0048](小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的制備)[0049]使用含有10%牛胎兒血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基，將作為小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的NCI-H69細(xì)胞在37°C · 5% CO2條件下靜置培養(yǎng)。通過胰蛋白酶處理而使細(xì)胞從培養(yǎng)皿剝離并回收，使用磷酸緩沖液(Phosphate buffered saline, PBS)進(jìn)行洗漆后,通過使用 10 μ M CellTracker Red CMTPX (Life Technologies Japan 株式會社)在 37°C靜置 30 分鐘而將NCI-H69細(xì)胞染色。然后，用PBS進(jìn)行洗滌，通過胰蛋白酶處理在37°C靜置3分鐘而使細(xì)胞塊離解。然后，用培養(yǎng)基使胰蛋白酶處理停止，用PBS進(jìn)行洗滌后，在含有2mMEDTA 和0. 5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS (以下稱為“2mM EDTA-0. 5% BSA-PBS”。)中懸浮。[0050](血液樣品中的CTC的濃縮)[0051]組裝設(shè)置了實施例的過濾器的CTC回收裝置。CTC回收裝置具備用于導(dǎo)入血液樣品、試劑的流路，流路的入口與加工注射器而制作的貯液器連接。通過向該貯液器中依次投6入血液樣品、試劑，能夠連續(xù)且容易進(jìn)行CTC的捕捉、染色、洗滌等操作。[0052]向CTC回收裝置中導(dǎo)入血液樣品并將癌細(xì)胞濃縮。作為血液樣品，使用對于采血至含有乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的真空采血管中的健康正常者血液，每ImL血液中混合了 1000個癌細(xì)胞的樣品。作為癌細(xì)胞，使用上述人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H69。[0053]首先，向貯液器導(dǎo)入2mM EDTA-0. 5% BSA-PBS lmL，在過濾器上充滿。接下來，使用蠕動泵以流速200 μ L /分鐘開始送液。約5分后，向貯液器導(dǎo)入ImL的血液樣品。從而在過濾器上捕捉癌細(xì)胞。[0054]5分鐘后，為了洗滌血球成分，向貯液器導(dǎo)入2mL的2mM EDTA-0. 5% BSA-PBS。[0055]另外，10分鐘后，將泵流速變更為20 μ L /分鐘，向貯液器導(dǎo)入600 μ L的細(xì)胞染色液(Hoechst 333420. 5yg / mL)，對過濾器上的癌細(xì)胞或白血球進(jìn)行熒光染色。對在過濾器上捕捉的細(xì)胞進(jìn)行30分鐘染色后，向貯液器導(dǎo)入ImL的2mM EDTA-0. 5% BSA-PBS而進(jìn)行細(xì)胞的洗滌。[0056]接下來，使用配備了計算機(jī)控制式電動載物臺和冷卻數(shù)字照相機(jī)(DP70，奧林巴斯株式會社)的熒光顯微鏡(BX61，奧林巴斯株式會社)來觀察過濾器，數(shù)出過濾器上的癌細(xì)胞和白血球的數(shù)量。為了觀察源自Hoechst 33342和CellTracker Red CMTPX的熒光，分別使用WU和WIG過濾器(奧林巴斯株式會社)取得圖像。圖像取得和解析軟件使用Lumina Vision (三谷商事株式會社)。將結(jié)果示于表2。實驗各進(jìn)行3次，結(jié)果用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。癌細(xì)胞回收率(捕獲率)由以下計算式計算。[0057]癌細(xì)胞回收率(％)=在過濾器上回收的癌細(xì)胞數(shù)/在血液樣品中混合的癌細(xì)胞數(shù) XlOO[0058]表 2[0059]
權(quán)利要求1.一種癌細(xì)胞濃縮過濾器，其包含形成有多個貫通孔的金屬基板，所述貫通孔的開口形狀為橢圓、圓、長方形、正方形、圓角長方形或多角形中的I種以上的形狀。
2.如權(quán)利要求I所述的癌細(xì)胞濃縮過濾器，所述金屬基板的材料是金、銀、銅、鋁、鎢、 鎳、鉻、不銹鋼或它們的合金中的I種。
3.如權(quán)利要求I或2所述的癌細(xì)胞濃縮過濾器，所述貫通孔的開口形狀是短邊的長度為5. O 15. O μ m的長方形或圓角長方形。
4.如權(quán)利要求I或2所述的癌細(xì)胞濃縮過濾器，所述貫通孔的平均開口率為O.I 50%。
5.如權(quán)利要求I或2所述的癌細(xì)胞濃縮過濾器，厚度為3 100 μ m。
專利摘要本實用新型提供一種能夠減少血球成分、特別是白血球的殘存，并以高捕獲率濃縮血中循環(huán)癌細(xì)胞的過濾器。一種癌細(xì)胞濃縮過濾器，其包含形成有多個貫通孔的金屬基板，貫通孔的開口形狀為選自由橢圓、圓、長方形、正方形和圓角長方形組成的組中的1種以上的形狀。
文檔編號C12M1/12GK202730123SQ20122012712
公開日2013年2月13日 申請日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者上原壽茂, 松永是, 吉野知子, 細(xì)川正人 申請人:日立化成工業(yè)株式會社, 國立大學(xué)法人東京農(nóng)工大學(xué)