一種離體高效構(gòu)建多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體的方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種離體高效構(gòu)建多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體的方法，其步驟為：1）在pPIC9K表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建載體pHBM905A；2）構(gòu)建重組載體pHBM905BDM；3）選擇需表達(dá)的外源基因蛋白；4）構(gòu)建含有外源基因蛋白的單拷貝重組載體pHBM905BDM-gene-1；5）基于Biobrick方法，構(gòu)建了人工體外串聯(lián)重復(fù)表達(dá)盒式結(jié)構(gòu)多拷貝的新載體pHBM905BDM-gene-n。本發(fā)明基于對(duì)pPIC9K表達(dá)載體的一系列改造，構(gòu)建了適合于離體構(gòu)建多拷貝的重組載體pHBM905BDM；進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建含有外源基因的單拷貝重組載體pHBM905BDM-gene-1和多拷貝重組載體pHBM905BDM-gene-n。這些高拷貝的重組質(zhì)粒只是在測序正確的1拷貝的基礎(chǔ)上酶切酶連得到，無需再測序，這樣就可以節(jié)約成本，省時(shí)省力，同時(shí)大大提高了外源基因蛋白表達(dá)能力。
【專利說明】一種離體高效構(gòu)建多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及離體高效構(gòu)建多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體的方法，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)起源于19世紀(jì)80年代，相對(duì)較晚，但后期發(fā)展快速。巴斯德畢赤酵母已經(jīng)成為了一種成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。
[0003]常用的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體含有一些共同的特征。很多載體都選擇巴斯德畢赤酵母HIS4基因作為選擇性標(biāo)記。來源于巴斯德畢赤酵母基因組AOXl基因的3’端的AOXl 3’側(cè)翼序列，也存在于很多載體中，并可作為外源基因整合和插入的位點(diǎn)。使用最多的是來自釀酒酵母MF a -SS前導(dǎo)肽編碼序列。
[0004]在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，乙醇氧化酶(AOX)啟動(dòng)子是使用最廣泛的。MF a -SS是使用最廣泛的信號(hào)序列，在翻譯后，MF a -SS信號(hào)肽被肽酶識(shí)別，并被kex2蛋白酶所切除，從而形成成熟的蛋白質(zhì)。影響畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌蛋白質(zhì)的含量主要有幾個(gè)因素:(1)啟動(dòng)子，(2)信號(hào)肽，(3)表達(dá)盒式結(jié)構(gòu)在宿主菌中整合的拷貝數(shù)。所以目前的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化主要從這幾個(gè)方面著手。
[0005]據(jù)報(bào)道，提高目標(biāo)基因盒式結(jié)構(gòu)在宿主菌中整合的拷貝數(shù)是增加單個(gè)細(xì)胞中重組蛋白的表達(dá)量的最有效的方法。篩選高拷貝菌株通常有2種方法:1)依賴于限制性內(nèi)切酶，人工體外構(gòu)建高拷貝重組質(zhì)粒；2)選用含有抗性篩選標(biāo)記的表達(dá)載體。使用“生物磚”技術(shù)(“Biobrick”)，利用簡單的手段，從最簡單的組件開始建立，最終可以構(gòu)建大規(guī)模的復(fù)雜多拷貝系統(tǒng)。
`[0006]目前使用最廣泛的畢赤酵母表達(dá)載體之一是pPIC9K載體(Invitrogen公司銷售)，該載體目前雖已成功表達(dá)了很多外源蛋白，但它還有其自身的局限性。
[0007]I)克隆方式復(fù)雜。目的基因克隆到該載體上都是用的依賴于限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶酶連的克隆方式，該載體的多克隆位點(diǎn)處只有四個(gè)酶切位點(diǎn)，其中兩個(gè)酶切位點(diǎn)并不常用，這使得克隆外源片段時(shí)可供選擇的插入位點(diǎn)大為減少；并且如果以PCR產(chǎn)物克隆目的基因，必須要考慮到目的片段上是否有該限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，由于該載體上的酶切位點(diǎn)有限，所以對(duì)于不同的基因克隆到載體上就會(huì)受到限制，這樣可能就會(huì)造成很多基因內(nèi)部也包含有克隆所需的酶切位點(diǎn)，導(dǎo)致目的基因克隆到該載體上要突變其基因內(nèi)部的一些酶切位點(diǎn)，從而使克隆步驟復(fù)雜化；
[0008]2)生物安全性不夠。目的基因克隆到PPIC9K載體上之后，線性化的重組質(zhì)粒以插入的方式同源重組到巴斯德畢赤酵母宿主基因組中，由于PPIC9K上的抗氨芐青霉素的表達(dá)盒式元件“Amp”和在大腸桿菌中用于復(fù)制起始的元件“Ori”會(huì)隨著目的基因表達(dá)盒一起整合到酵母基因組上去，這樣使得構(gòu)建的基因工程菌具有一定抗性，并且拷貝數(shù)越高，抗性就越強(qiáng)，如果抗性基因不慎泄露到環(huán)境中，就可能會(huì)增加環(huán)境生物安全性的風(fēng)險(xiǎn)，并且拷貝數(shù)越高，抗性就越強(qiáng)；3)線性化片段轉(zhuǎn)化的效率低。傳統(tǒng)的PPIC9K載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒用Sail線性化之后，由于“Amp+Ori”元件隨著目的基因表達(dá)盒一起整合到酵母基因組上去，線性片段太大，轉(zhuǎn)化效率就大大降低；4)pPIC9K載體采用的是AOXl啟動(dòng)子，雖然調(diào)控方式很嚴(yán)謹(jǐn)，但是該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平還不是很高，還有待進(jìn)一步增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性；5) PPIC9K載體使用的信號(hào)序列是來自編碼釀酒酵母MF a -SS序列的DNA序列。釀酒酵母和畢赤酵母同屬于酵母，但是在密碼子偏愛性方面仍存在一定的差距，使之對(duì)外源蛋白的表達(dá)和分泌可能沒有達(dá)到最佳的效果；6)由于存在基因的劑量效應(yīng)，大多數(shù)基因，隨著拷貝數(shù)的增加，目的基因的轉(zhuǎn)錄也大為提聞，從而有可能提聞目的基因的表達(dá)量。由于目前傳統(tǒng)的畢赤酵母表達(dá)載體多拷貝出現(xiàn)的頻率很低，自然狀態(tài)下，如果轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母的表達(dá)載體是單拷貝，轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)多拷貝整合的概率約為1-10%，并且拷貝數(shù)不可控(Cereghino JL, Cregg JM.Heterologous protein expression in the methylotrophicyeast Pichia pastoris.[J] FEMS Microbiol Rev.2000; 24(1): 45-66),具有偶然性，體內(nèi)方法可篩選插入多拷貝外源基因的His+轉(zhuǎn)化子，但是效率很低，要篩選足夠量的轉(zhuǎn)化子才能得到高拷貝的轉(zhuǎn)化子，這樣大大提高了篩選高拷貝菌株的成本和工作量。因?yàn)镻PIC9K載體含有細(xì)菌來源的抗卡那抗生素的表達(dá)盒單元(“kan”)，賦予畢赤酵母G418抗性，所以現(xiàn)在一般用的都是用不同的G418抗性水平來篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，但是這種篩選方法有缺陷:一是會(huì)造成假陰性，因?yàn)樾罗D(zhuǎn)化的細(xì)胞需要時(shí)間表達(dá)足夠量的抗G418的代謝產(chǎn)物，由于酵母生長比細(xì)菌慢得多，大部分重組酵母在積累足夠多的抗G418的代謝產(chǎn)物以抵抗平板上抗生素之前就已經(jīng)被殺死了 ；二是由于隨著拷貝數(shù)的增加，酵母基因組上整合的“kan”的拷貝數(shù)也增加，如果“kan”泄露到環(huán)境中，可能會(huì)給環(huán)境的生物安全性帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)。
[0009]基于現(xiàn)有的pPIC9K表達(dá)載體以上的一些缺陷，本發(fā)明基于對(duì)PPIC9K表達(dá)載體一系列的改造，提出了一種離體高效構(gòu)建多拷貝的畢赤酵母表達(dá)載體的方法，能夠離體實(shí)現(xiàn)目的基因表達(dá)盒的多拷貝，對(duì)于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白質(zhì)有很大的提聞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提出一種離體高效構(gòu)建多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體的方法，對(duì)巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K進(jìn)行一`系列的改造，以優(yōu)化克隆方式和提高目的蛋白的表達(dá)量。
[0011]具體做法如下(見圖1):
[0012]1.構(gòu)建載體 PHBM905A。
[0013]首先在原始的畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)以下引物分別擴(kuò)增不同的片段，按照表1的引物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的片段(序列表對(duì)應(yīng)NO 1、2、3、4、5、6)，然后利用overlapping PCR方法，將1，2，3片段套疊成一個(gè)大片段并命名為A，將4，5，6片段套疊一個(gè)大片段并命名為B。A，B片段都經(jīng)過Dpn I處理消化模板后，用膠回收試劑盒回收純化后，將片段A和片段B按照1:1混合，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlO β感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，待平板上長出明顯菌落時(shí)，挑選轉(zhuǎn)化菌落，小量提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行測序鑒定。測序正確的重組子就命名為載體ΡΗΒΜ905Α。
[0014]表1
[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種離體高效構(gòu)建多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體的方法，其特征在于步驟為: 1).構(gòu)建載體PHBM905A 首先在原始的畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)以下引物分別擴(kuò)增不同的片段，按照表1的引物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的片段，然后利用overlapping PCR方法，將1，2，3片段套疊一個(gè)大片段并命名為A，將4，5，6片段套疊一個(gè)大片段并命名為B ;A，B片段都經(jīng)過I處理消化模板后，用膠回收試劑盒回收純化后，將片段A和片段B按照1:1混合，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 表1
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種離體高效構(gòu)建多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體的方法，其特征在于構(gòu)建含有外源基因蛋白的單拷貝重組載體pHBM905BDM-gene-l的步驟為: 通過引物設(shè)計(jì)，在目的基因gene正向引物的5’端加上GTCA，反向引物的5’端加上GGCCA，使用高保真酶擴(kuò)增目的基因片段后，回收，然后在dTTP存在的條件下，用T4 DNA聚合酶于12°C處理該片段20min，生成粘性末端，同時(shí)將pHBM905BDM質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和I依次酶切，產(chǎn)生兩個(gè)帶有固定堿基的單鏈粘性末端，瓊脂糖膠回收目的片段；最后，將雙酶切后的載體和Τ4 DNA聚合酶處理后片段經(jīng)Takara公司的連接試劑盒I )連接酶16°C連接2h后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOP菌株，氨節(jié)青霉素抗性LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑取一些轉(zhuǎn)化子小量提取質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒大小比對(duì)、PCR鑒定以及限制性酶酶切鑒定獲得完整的重組質(zhì)粒，將鑒定正確的重組子測序，測序正確者命名為pHBM905BDM-gene_l。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種離體高效構(gòu)建多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體的方法，其特征在于構(gòu)建含有外源基因蛋白的多拷貝重組載體pHBM905BDM-gene-n的步驟為: 將部分重組質(zhì)粒pHBM905BDM-gene-l用雙酶切，瓊脂糖膠回收得到片段`1，將部分pHBM905BDM-gene-l雙酶切，瓊脂糖膠回收得到片段2，將部分pHBM905BDM-gene用EcoRLmHl雙酶切，瓊脂糖膠回收得到pHBM905BDM載體骨架；將雙酶切后的載體骨架、片段I和片段2按照1:2:2混合，經(jīng)Solution I連接酶16°C連接2h后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌?ΗΙΟβ菌株，氨芐青霉素抗性LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒大小比對(duì)、PCR鑒定以及酶切鑒定獲得正確的2拷貝重組質(zhì)粒pHBM905BDM-gene-`2 ；3拷貝就在2拷貝的基礎(chǔ)上，用類似上述步驟就可以獲得，以此類推，就可以獲得3拷貝以上的重組質(zhì)粒。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK103555749SQ201210591987
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月29日
【發(fā)明者】馬立新, 趙西選, 陳晚蘋, 李曄星, 付玲, 姚永蘭 申請(qǐng)人:湖北大學(xué), 湖北花果山實(shí)業(yè)有限公司