專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用多重PCR技術(shù)分析花生粕中黃曲霉毒素B₁產(chǎn)生趨勢(shì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物與分子生物學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一種利用多重PCR技術(shù)分析花生柏中黃曲霉毒素B1產(chǎn)生趨勢(shì)的方法。
背景技術(shù)：
花生柏極易感染黃曲霉和寄生曲霉等微生物，在一定溫度與濕度條件下產(chǎn)生黃曲霉毒素。而黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)的污染農(nóng)產(chǎn)品中毒性最強(qiáng)的一類(lèi)生物毒素，具有極強(qiáng)的致癌、致突變和致畸性；尤其是黃曲霉毒素B1，毒性分別是氰化鉀和砒霜的10倍和68倍；黃曲霉毒素的污染，已經(jīng)成為很多農(nóng)產(chǎn)品規(guī)模應(yīng)用的瓶頸與人畜生命安全的潛在威脅。目前黃曲霉菌毒素B1產(chǎn)生菌的鑒定十分困難，主要采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察微生物的形態(tài)特征以及平板單菌落的形態(tài)學(xué)分析，但是這兩種方法都很難將黃曲霉毒素B1產(chǎn)生菌與其他非產(chǎn)黃曲霉毒素霉菌區(qū)分開(kāi)來(lái)，盡管檢測(cè)黃曲霉和寄生曲霉的傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法已有許多，但由于花生柏樣品成分復(fù)雜，對(duì)分子生物學(xué)方法的直接應(yīng)用存在較大干擾，難以實(shí)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于改進(jìn)已有技術(shù)的不足而提供一種具有特異性高、能夠快速鑒定花生柏中是否感染黃曲霉毒素B1產(chǎn)生菌、檢測(cè)花生柏的黃曲霉毒素B1產(chǎn)生的趨勢(shì)的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種利用多重PCR技術(shù)分析花生柏中黃曲霉毒素B1產(chǎn)生趨勢(shì)的方法，其特征在于 提取樣品花生柏的基因組DNA后，通過(guò)多重PCR擴(kuò)增黃曲霉毒素B1合成基因，通過(guò)PCR結(jié)果判斷花生柏產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的趨勢(shì)，用于指導(dǎo)花生柏的儲(chǔ)藏和運(yùn)輸條件控制。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，可以是所述樣品花生柏采用縮分法取樣，最終樣品的重量為0.lg。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，可以是該方法包括以下步驟:
(I)將花生柏進(jìn)行液氮研磨預(yù)處理，用土壤DNA抽提試劑盒提取花生柏基因組DNA，得到的粗DNA用核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)后存于-20°C備用；
(2)以提取的DNA為模板，用4組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，所述4組引物為4對(duì)引物序列，第一組引物的正向序列如序列表中SEQ ID -1F所示，第一組引物反向序列則具有表中SEQ ID -1R的堿基序列；第二組正向、反向的序列分別對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQ ID -2F和SEQ ID -2R的堿基序列；第三組正向、反向的序列分別對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQID -3F和SEQ ID -3R的堿基序列；第四組正向、反向的序列分別對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQ ID-4F和SEQ ID -4R的喊基序列；
弓I物名稱(chēng)序歹Li_廣物大小序歹Li表中的序歹Li號(hào)
aflRF 一TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG ~24SEQID-1F
aflRR Iccgtcagacagccactccacacgg 丨24 |seqid-1r
權(quán)利要求
1.一種利用多重PCR技術(shù)分析花生柏中黃曲霉毒素B1產(chǎn)生趨勢(shì)的方法，其特征在于提取樣品花生柏的基因組DNA后，通過(guò)多重PCR擴(kuò)增黃曲霉毒素B1合成基因，通過(guò)PCR結(jié)果判斷花生柏產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的趨勢(shì)，用于指導(dǎo)花生柏的儲(chǔ)藏和運(yùn)輸條件控制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用多重PCR技術(shù)分析花生柏中黃曲霉毒素B1產(chǎn)生趨勢(shì)的方法，其特征在于所述樣品花生柏采用縮分法取樣，最終樣品的重量為0.lg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用多重PCR技術(shù)分析花生柏中黃曲霉毒素B1產(chǎn)生趨勢(shì)的方法，其特征是該方法包括以下步驟: (1)將花生柏進(jìn)行液氮研磨預(yù)處理，用土壤DNA抽提試劑盒提取花生柏基因組DNA，得到的粗DNA用核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)后存于-20°C備用； (2)以提取的DNA為模板，用4組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，所述4組引物為4對(duì)引物序列，第一組引物的正向序列如序列表中SEQ ID -1F所示，第一組引物反向序列則具有表中SEQ ID -1R的堿基序列；第二組正向、反向的序列分別對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQ ID-2F和SEQ ID -2R的堿基序列；第三組正向、反向的序列分別對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQ ID -3F和SEQ ID -3R的堿基序列；第四組正向、反向的序列分別對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQ ID -4F和SEQ ID -4R的喊基序列；
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用多重PCR技術(shù)分析花生柏中黃曲霉毒素B1產(chǎn)生趨勢(shì)的方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增是以待測(cè)花生柏的DNA為模板，用aflR、omt-l、Ver-l和ITS的4對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)均用無(wú)菌水代替DNA模板做一個(gè)陰性對(duì)照，其中:PCR 反應(yīng)體系(25 μ ):2μ L DNA 模板、2.5μ L IOXPCR Buffer,2y L I Ommo I/L dNTP、上下游引物(10_01/^)各14 1^和0.25 μ L Taq DNA聚合酶(5U/μ L)，用超純水補(bǔ)足總體積； PCR擴(kuò)增條件:采用95°C變性4min、94°C變性30s、59°C退火30s、72°C延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。
5.權(quán)利要求1所述的一種利用多重PCR技術(shù)分析花生柏中黃曲霉毒素B1產(chǎn)生趨勢(shì)的方法，其特征在于根據(jù)PCR結(jié)果的條帶數(shù)目，判定花生柏是否感染黃曲霉毒素B1產(chǎn)生菌，根據(jù)條帶豐度判定黃曲霉毒素B1產(chǎn)生趨勢(shì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用多重PCR技術(shù)分析花生粕中黃曲霉毒素B1產(chǎn)生趨勢(shì)的方法，該方法屬于微生物與分子生物學(xué)領(lǐng)域，是利用土壤DNA抽提試劑盒提取花生粕基因組DNA，通過(guò)黃曲霉毒素B1合成代謝途徑的關(guān)鍵酶基因設(shè)計(jì)引物序列，PCR鑒定潛藏性的黃曲霉毒素產(chǎn)生菌，通過(guò)PCR結(jié)果指導(dǎo)花生粕的儲(chǔ)藏、運(yùn)輸條件控制，也可為研究花生粕中黃曲霉毒素B1的動(dòng)態(tài)變化與控制提供科學(xué)依據(jù)，具有速度快，可靠性高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103103258SQ20121058428
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者陸健, 李恒嚴(yán), 蔡國(guó)林, 李秋, 朱德偉, 任曉靜 申請(qǐng)人:山東魯花集團(tuán)有限公司, 江南大學(xué)