專利名稱：黃曲霉毒素B₁生物降解劑的制備方法及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃曲霉毒素B1生物降解劑的制備方法及其應用，屬飼料添加劑領(lǐng)域。(ニ)
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是由黃曲霉、寄生曲霉等幾種真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是ー類結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似的分子真菌毒素，是ー種劇毒物和強致癌物質(zhì)，其中AFBi為迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定、毒性最強的ー種。由于產(chǎn)毒的黃曲霉菌產(chǎn)生毒素B1的量最多，而且毒性最強，所以一般測定B1的含量代表食品中黃曲霉毒素的含量。大量的流行病學調(diào)查及研究均證實，畜禽食入被污染的飼料會降低動物的生產(chǎn)性能、引發(fā)一系列疾病，可間接通過食物鏈進入人體并具有極強的 致癌作用，嚴重威脅人類健康。1993年，AFB1被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)劃定為A類致癌物。傳統(tǒng)的去除AFB1方法主要有吸附、萃取、熱處理、射線處理、酸堿處理、氧化還原處理，但是有費時費力、去毒率不高、易造成營養(yǎng)物質(zhì)流失的缺點。因此，迫切需要一種高效安全的脫毒方法消除這類毒素對人畜健康的危害。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明利用能夠降解黃曲霉毒素B1的黑曲霉(aspergillusniger)及其所產(chǎn)生的降解酶提供了ー種黃曲霉毒素B1生物降解劑的制備方法及其應用。本發(fā)明所使用的黑曲霉(aspergillus niger),購自中國普通微生物菌種保藏中心，其保存編號為CGMCC NO. 3. 2915。黃曲霉毒素B1生物降解劑的制備方法如下
將黑曲霉(CGMCC NO. 3. 2915)在PDA固體培養(yǎng)基平板上劃線分離，37°C培養(yǎng)48h，調(diào)取單菌落，接入IOOmlPDB液體培養(yǎng)基中，在37°C下振蕩培養(yǎng)3 5d，取發(fā)酵液將發(fā)酵液在4°C,8000 r / min條件下離心20 min，或采用抽濾的方法，分離上清液與菌體細胞；取上清液，用濃度為30 90%的硫酸銨沉淀；用發(fā)酵液1/10體積的生理鹽水溶解沉淀物，透析6 24小時脫鹽，即得黃曲霉毒素BI生物降解劑，所得黃曲霉毒素BI生物降解劑中蛋白含量在 20 40mg/ml。所述PDA固體培養(yǎng)基(g/L)制備方法為馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，混合后，121°C高壓蒸汽滅菌15min。所述PDB培養(yǎng)基(g/L)制備方法為馬鈴薯200，葡萄糖20，混合后，121 °C高壓蒸汽滅菌15min。所述振蕩培養(yǎng)的條件為發(fā)酵溫度為20 40で，發(fā)酵時間24 1201!，？!1值5.0 9. 0，轉(zhuǎn)速為 120 200r/min。將該降解劑按5 10% (V/W)與啤酒酵母細胞等物質(zhì)混合，烘干后制備成黃曲霉毒素BI生物降解飼料添加劑，添加劑應用于全價飼料的添加量為I 2% (重量比)。
具體實施方式
實例I
將黑曲霉(CGMCC NO. 3. 2915)在PDA固體培養(yǎng)基平板上劃線分離，37°C培養(yǎng)48h，調(diào)取單菌落，接入IOOmlPDB液體培養(yǎng)基中；
在37°C下振蕩培養(yǎng)3 5d，取發(fā)酵液；在4°C，8000 r / min條件下離心20 min，或采用抽濾的方法，分離上清液與菌體細胞，取上清液，即得粗提液；
用30 90%的硫酸銨沉淀粗提液,用10 ml生理鹽水溶解沉淀物,裝入透析袋。用清水透析6 24小時脫鹽，即得精制黃曲霉毒素B1降解劑(蛋白含量在20 40mg/ml)。該降解劑按5 10% (V/W)用啤酒酵母細胞混合，制備成黃曲霉毒素BI生物降解飼料添加劑，按I 2% (重量比)與全價飼料混合使用。使用效果驗證
I.取含黃曲霉毒素B1液體樣品100ml (AFB1含量為40mg/L)，加入精制黃曲霉毒素B1降解劑1ml，混勻，37°C作用2d后，樣品中黃曲霉毒素B1的降解率達80 90%為合格。 2.取飼料SOOgUFB1含量為20 100mg/kg)，添加其重量的I %按照本發(fā)明制備的黃曲霉毒素BI生物降解飼料添加劑，同時加入300ml去離子水，混勻。在溫度37°C作用3d后,詞料中黃曲霉韋素B1的降解率為70 80%為合格。目前，市售全價飼料中由于使用了霉菌污染的玉米，或多或少都含有黃曲霉毒素B1 (AFB1X畜禽長期使用AFB1含量超過20mg/kg的飼料，即會出現(xiàn)黃曲霉毒素中毒，表現(xiàn)為采食量下降、增重緩慢、消痩、甚至死亡。利用本發(fā)明制備的黃曲霉毒素BI生物降解飼料添加剤，按I 2% (重量比)與全價飼料混合，可將飼料中的大部分AFB1降解，較少或消除畜禽黃曲霉毒素中毒現(xiàn)象。
權(quán)利要求
1.ー種黃曲霉毒素B1生物降解劑的制備方法，其特征在于先將黑曲霉(CGMCCNO. 3. 2915)在PDA固體培養(yǎng)基平板上劃線分離，37°C培養(yǎng)48h，調(diào)取單菌落，接入IOOmlPDB液體培養(yǎng)基中，在37°C下振蕩培養(yǎng)3 5d，取發(fā)酵液；將發(fā)酵液在4°C，8000 r / min條件下離心20 min，或采用抽濾的方法，分離上清液與菌體細胞；取上清液，用濃度為30 90%的硫酸銨沉淀；用發(fā)酵液1/10體積的生理鹽水溶解沉淀物，透析6 24小時脫鹽，即得黃曲霉毒素BI生物降解劑，所得黃曲霉毒素BI生物降解劑中蛋白含量在20 40mg/ml ； 所述PDA固體培養(yǎng)基(g/L)制備方法為馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，混合后，121°C高壓蒸汽滅菌15min ； 所述PDB培養(yǎng)基(g/L)制備方法為馬鈴薯200，葡萄糖20，混合后，121°C高壓蒸汽滅M 15min ； 所述振蕩培養(yǎng)的條件為發(fā)酵溫度為20 40°C，發(fā)酵時間24 120h，pH值5. O 9. 0，轉(zhuǎn)速為120 200r/min。
2.ー種黃曲霉毒素B1生物降解劑的應用，其特征在于將該降解劑按V/W 5 10%與啤酒酵母細胞混合，烘干后制備成黃曲霉毒素BI生物降解飼料添加劑，添加劑應用于全價飼料的添加量為重量比I 2%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種黃曲霉毒素Bl生物降解劑的制備方法及其應用，是利用能夠降解黃曲霉毒素B1的黑曲霉(aspergillusniger)及其所產(chǎn)生的降解酶提供了一種黃曲霉毒素Bl生物降解劑的制備方法及其應用；將該降解劑按5～10%(V/W)與啤酒酵母細胞等物質(zhì)混合，烘干后制備成黃曲霉毒素B1生物降解飼料添加劑，將添加劑按1～2％(重量比)與全價飼料混合，可將飼料中的大部分AFB1降解，較少或消除畜禽黃曲霉毒素中毒現(xiàn)象。
文檔編號A23K1/16GK102687800SQ20121013370
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月3日
發(fā)明者常維山, 李冰 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學