專(zhuān)利名稱(chēng)：四種菌的三重實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)引物、探針、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonellacholeraesuis)、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella paratyphi)、傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhi)和雞傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella gal I inarum)的三重實(shí)時(shí)突光PCR檢測(cè)引物、探針、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
沙門(mén)氏菌(Salmonella)屬腸桿菌科，是人類(lèi)重要的腸道致病菌，也可在動(dòng)物腸道中繁殖或引起疾病。目前已知的沙門(mén)氏菌有2500多個(gè)血清型，我國(guó)發(fā)現(xiàn)了 200多個(gè)血清型。沙門(mén)氏菌所致的疾病主要有兩大類(lèi)。一類(lèi)是傷寒和副傷寒，由傷寒或副傷寒沙門(mén)氏菌引起，偶見(jiàn)由其他沙門(mén)氏菌引起傷寒樣的感染，如豬霍亂沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌等。雞傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella gal I inarum)是雞的重要致病菌,主要引起雞傷寒(fowl typhoid)。食品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)主要是依靠傳統(tǒng)的培養(yǎng)的方法，該方法需選擇性增菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型，通常要5-6天才能得出檢測(cè)結(jié)果，不利于及時(shí)診斷、查找病源，控制病情的蔓延。沙門(mén)氏菌的傳統(tǒng)方法鑒定需要經(jīng)過(guò)病原的初步分離、生化鑒定并結(jié)合血清學(xué)分型，然后不同血清型之間發(fā)生的交叉反應(yīng)會(huì)干擾血清學(xué)診斷的準(zhǔn)確性。如腸炎沙門(mén)氏菌菌毛蛋白在沙門(mén)氏菌D群血清 型中仍有編碼。用該菌毛蛋白進(jìn)行的凝集試驗(yàn)常與雞傷寒沙門(mén)氏菌、雞白痢沙門(mén)氏菌等發(fā)生交叉凝集，即使是應(yīng)用SEF14菌毛抗原制成的純化單克隆抗體進(jìn)行膠乳凝集試驗(yàn)，仍與都柏林沙門(mén)氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)，從而使傳統(tǒng)的檢測(cè)方法中存在一定比例的假陽(yáng)性等問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已有針對(duì)irwA、16s rRNA、SpvC、invB、fimA、agfA、SEF14、sefA、sdf、ssaQ、fimY 等為目標(biāo)基因，用普通 PCR 或?qū)崟r(shí)突光PCR檢測(cè)沙門(mén)氏菌的報(bào)道，但以上述序列作為目的片段的PCR法，只能檢測(cè)到一部分Sa血清型或其毒力基因，不能同時(shí)得出所檢測(cè)沙門(mén)氏菌屬的血清型、毒素分泌類(lèi)型等。目前也有商業(yè)化的杜邦公司生產(chǎn)的Bax系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用熒光PCR技術(shù)從屬的水平上檢測(cè)沙門(mén)氏菌，具有較高的特異性，但不能對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行分型。為目的基因設(shè)計(jì)引物，建立了多重PCR檢測(cè)沙門(mén)氏菌(Salmonella spp)、SE (Enteritidis)、傷寒Sa (Typhi)、ST (Typhimurium)的方法,應(yīng)用于雞肉中的沙門(mén)氏菌檢測(cè)，KIM等也根據(jù)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和傷寒沙門(mén)氏菌的特異序列設(shè)計(jì)多對(duì)弓丨物，建立了多重PCR檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和傷寒沙門(mén)氏菌的方法，均得到較好的效果，但上述方法需通過(guò)凝膠電泳判定結(jié)果，操作較為繁瑣。EdelO’Regan等用flic、sefA、sdf、acek基因設(shè)計(jì)引物探針，用多重?zé)晒釶CR方法檢測(cè) Enteritidis, Gallinarum, Typhimurium, Kentucky 和 Dublin 沙門(mén)氏菌，但 sefA 為目的基因無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分Enteritidis, Gallinarum和Dublin, flic為目的片段則無(wú)法區(qū)分Typhimurium和Kentucky，DavidFde等用普通PCR和應(yīng)該光PCR來(lái)檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌，但該研究也未對(duì)熒光PCR擴(kuò)增體系的擴(kuò)增效率等進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià)。因此，建立快速檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌和雞沙門(mén)氏菌的方法，對(duì)于食品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)、預(yù)防與控制具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、快速、可靠、靈敏度高、特異性強(qiáng)的豬霍亂沙門(mén)氏菌(SC)、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌(SP)、傷寒沙門(mén)氏菌(ST)、雞傷寒沙門(mén)氏菌(SG)三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物、探針、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，通過(guò)一次實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增就能判斷樣品是否受到豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌和雞傷寒沙門(mén)氏菌的污染，再通過(guò)單一熒光PCR擴(kuò)增區(qū)分豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌。本發(fā)明用豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列(GenBank AE017220.1)、傷寒沙門(mén)氏菌的特異序列(GenBank NC_016832.1 )、雞傷寒沙門(mén)氏菌的特異序列(GenBank:HQ703462)、豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列(GenBank CP000857)分別設(shè)計(jì)檢測(cè)引物和檢測(cè)探針，豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列用于檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌，傷寒沙門(mén)氏菌的特異序列用于檢測(cè)傷寒沙門(mén)氏菌，雞傷寒沙門(mén)氏菌的特異序列用于檢測(cè)雞傷寒沙門(mén)氏菌，豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列用于區(qū)分豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌，利用基于Taqman探針的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，通過(guò)一次實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增來(lái)判斷樣品中是否受到豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌及雞傷寒沙門(mén)氏菌的污染，再通過(guò)單一實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增區(qū)分豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌，達(dá)到簡(jiǎn)便、快速、可靠、靈敏度高和特異性強(qiáng)的目的，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，其特征在于，所述的檢測(cè)弓I物如下所示針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列SCF 5' -GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ;(如 SEQ ID NO.1 所示)SCR 5' -GG TGCAGATAACTCCAACAGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 2 所示) 針對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌特異序列STF 5' -GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)STR 5' -CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ；(如 SEQ ID NO. 4 所示)針對(duì)雞傷寒沙門(mén)氏菌特異序列SGF :5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；(如 SEQ ID NO. 5 所示)SGR :5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3'。(如 SEQ ID NO. 6 所示)針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列SPF 5' -AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3' ；(如 SEQ ID NO. 7 所示)SPR 5' -TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3' ；(如 SEQ ID NO. 8 所示)。本發(fā)明的豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)探針，其特征在于，所述的檢測(cè)探針如下所示豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列的探針SCP 5' -AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ；(如 SEQ ID NO. 9 所示)傷寒沙門(mén)氏菌特異序列的探針STP 5' -ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ;(如 SEQ ID NO. 10 所示)
雞傷寒沙門(mén)氏菌特異序列的探針SGP 5' -ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ;(如 SEQ ID NO. 11 所示)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列的探針SPP 5' -AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ;(如 SEQ ID NO. 12 所示)探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，四個(gè)探針的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。所述的熒光報(bào)告基因優(yōu)選為FAM、HEX、TET或R0X，所述的熒光淬滅基團(tuán)優(yōu)選為T(mén)AMARA 或 BHQI。本發(fā)明的豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，包括實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液、UNG酶、耐熱DNA聚合酶、檢測(cè)引物和檢測(cè)探針，其特征在于，所述的檢測(cè)引物包括四對(duì)(I)針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列SCF 5' -GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ;(如 SEQ ID NO.1 所示)SCR 5' -GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)(2 )傷寒沙門(mén)氏菌特異序列STF 5' -GTGG CTATGCAGTGAAAATGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)STR 5' -CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ；(如 SEQ ID NO. 4 所示)(3 )雞傷寒沙門(mén)氏菌特異序列SGF :5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；(如 SEQ ID NO. 5 所示)SGR :5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3'。(如 SEQ ID NO. 6 所示)(4)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列SPF 5' -AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3' ；(如 SEQ ID NO. 7 所示)SPR 5' -TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3' ；(如 SEQ ID NO. 8 所示)所述的檢測(cè)探針包括(I)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列的探針SCP 5' -AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ；(如 SEQ ID NO. 9 所示)(2 )傷寒沙門(mén)氏菌特異序列的探針STP 5' -ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ;(如 SEQ ID NO. 10 所示)(3 )雞傷寒沙門(mén)氏菌特異序列的探針SGP 5' -ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ;(如 SEQ ID NO. 11 所示)(4)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列的探針SPP 5' -AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ;(如 SEQ ID NO. 12 所示)探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，四個(gè)探針的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。本發(fā)明的非疾病的診斷和治療目的的豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟(I)對(duì)樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；(2)使用上述針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列、傷寒沙門(mén)氏菌特異序列和雞傷寒沙門(mén)氏菌特異序列的檢測(cè)引物及檢測(cè)探針，與實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增用的反應(yīng)液、UNG酶及耐熱DNA聚合酶混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系；(3)將擴(kuò)增反應(yīng)體系在熒光PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)探針標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)記錄的熒光信號(hào)，讀取并記錄各檢測(cè)樣品的PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)(Ct)；(4)根據(jù)各樣品的Ct值，按照建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，判斷樣品中是否含有豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌及雞傷寒沙門(mén)氏菌；(5)上述步驟(4)得出的樣品檢測(cè)結(jié)果中如果擴(kuò)增出豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌，則以步驟(I)所提取的增菌液中菌體的基因組DNA作為模板，使用上述針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針，與實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增用的反應(yīng)液、UNG酶及耐熱DNA聚合酶混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系，將擴(kuò)增反應(yīng)體系在熒光PCR儀上進(jìn)行單一實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)探針標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)記錄的熒光信號(hào)，讀取并記錄各檢測(cè)樣品的PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)(Ct)，根據(jù)各樣品的Ct值，按照建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，區(qū)分樣品中的豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌。所述的樣品優(yōu)選為食品。所述的步驟(2)的擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)選為模版DNA3 U L，IOXTaqMan緩沖液4 yl，5mmol/LMgCl22u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u 1，三種 20 y mol/L 檢測(cè)探針 SCP，STP 和 SGP 各Iil 1，共 1，六條 20iimol/L 檢測(cè)引物 SCF、SCR、STF、STR、SGF 和 SGR 各 I y 1，共 6 y 1，0.55U UNG 酶 0.2 ii 1,2. 5U/U I Taq 聚合酶 3 ii 1，去離子水 5.1。所述步驟(3)的進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，其反應(yīng)參數(shù)優(yōu)選為95°C 30s、95°C 5s、60°C 34s、40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)以熒光PCR檢測(cè)擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯，且Ct〈37為陽(yáng)件判定原則，如果擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯且Ct〈35可直接判定為陽(yáng)性，如果Ct值在35 37之間判斷為可疑，需要加大模板量進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若出現(xiàn)指數(shù)期明顯的擴(kuò)增曲線方可判定為陽(yáng)性，否則為陰性。所述步驟(5)的擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)選為模版DNAlii L，10 X TaqMan緩沖液4 iil，5mmol/LMgCl22u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u 1，20 y mol/L針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列的檢測(cè)探針SPP和檢測(cè)引物SPF、SPR各liil，0. 55U UNG酶0. 2iU，
2.5U/ U I Taq聚合酶3 U I,去離子水13. 8 U I。所述步驟(5)的進(jìn)行單一實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，其反應(yīng)參數(shù)優(yōu)選為95°C 30s、95°C 5s,60°C 34s、40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)以熒光PCR檢測(cè)擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯，且Ct〈37為陽(yáng)件判定原則，如果擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯且Ct〈35可直接判定為陽(yáng)性，如果Ct值在35 37之間判斷為可疑，需要加大模板量進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若出現(xiàn)指數(shù)期明顯的擴(kuò)增曲線方可判定為陽(yáng)性，否則為陰性。本發(fā)明根據(jù)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列(GenBank: AEO17220.1 )、傷寒沙門(mén)氏菌的特異序列(GenBank: NC_016832.1)、雞傷寒沙門(mén)氏菌的特異序列(GenBank: HQ703462 )、霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列(GenBank:CP000857)分別設(shè)計(jì)檢測(cè)引物和檢測(cè)探針，利用該檢測(cè)引物和檢測(cè)探針按照本發(fā)明的方法對(duì)樣品進(jìn)行三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，用豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷 寒沙門(mén)氏菌，用傷寒沙門(mén)氏菌的特異序列檢測(cè)傷寒沙門(mén)氏菌，用雞傷寒沙門(mén)氏菌的特異序列檢測(cè)雞傷寒沙門(mén)氏菌，在一次實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)中完成對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌和雞傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，再通過(guò)單一實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增區(qū)分豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌，從而簡(jiǎn)便、快速、可靠地判斷樣品是否受到豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌和雞傷寒沙門(mén)氏菌的污染。以本發(fā)明的檢測(cè)引物及檢測(cè)探針按照本發(fā)明的方法對(duì)樣品進(jìn)行三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，檢測(cè)快速，可在31h完成從制備樣品到出具檢測(cè)結(jié)果的過(guò)程，不受假陽(yáng)性和交叉污染等干擾，結(jié)果可靠，且靈敏度高、特異性強(qiáng)，為沙門(mén)氏菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查提供了有利工具。適用于食品的檢驗(yàn)檢疫，可供檢驗(yàn)檢疫局、疾病預(yù)防控制中心和質(zhì)量監(jiān)督部門(mén)對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。


圖1是豬霍亂沙門(mén)氏菌特異性試驗(yàn)熒光PCR擴(kuò)增圖；圖2是丙型副傷寒沙門(mén)氏菌特異性試驗(yàn)熒光PCR擴(kuò)增圖；圖3是傷寒沙門(mén)氏菌特異性試驗(yàn)熒光PCR擴(kuò)增圖；圖4是雞傷寒沙門(mén)氏菌特異性試驗(yàn)熒光PCR擴(kuò)增圖；圖5是區(qū)別丙型副傷寒沙門(mén)氏菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌熒光PCR擴(kuò)增圖；圖6是豬霍亂沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌梯度稀釋三重?zé)晒釶CR擴(kuò)增圖，其中，紅色為FAM，綠色為T(mén)ET，黃色為HEX ；圖7是丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌梯度稀釋三重?zé)晒釶CR擴(kuò)增圖，其中，紅色為FAM，綠色為H EX，藍(lán)色為T(mén)ET ；圖8是添加豬霍亂沙門(mén)氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖9是添加丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖10是添加傷寒沙門(mén)氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖11是添加雞傷寒沙門(mén)氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖12是添加豬霍亂沙門(mén)氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖13是添加丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖14是添加傷寒沙門(mén)氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖15是添加雞傷寒沙門(mén)氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖16是添加豬霍亂沙門(mén)氏菌的魚(yú)肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖17是添加丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的魚(yú)肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖18是添加傷寒沙門(mén)氏菌的魚(yú)肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖19是添加雞傷寒沙門(mén)氏菌的魚(yú)肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖；圖20是污染了豬霍亂沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌和雞傷寒沙門(mén)氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖，其中紅色為FAM，綠色為T(mén)ET，黃色為HEX ；圖21是污染了豬霍亂沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌和雞傷寒沙門(mén)氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖，其中紅色為FAM，綠色為T(mén)ET，黃色為HEX ；圖22是污染了豬霍亂沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌和雞傷寒沙門(mén)氏菌的魚(yú)肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖，其中紅色為FAM，綠色為T(mén)ET，黃色為HEX ；圖23是污染了丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌和雞傷寒沙門(mén)氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖，其中紅色為FAM，綠色為T(mén)ET，黃色為HEX ；
圖24是污染了丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌和雞傷寒沙門(mén)氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖，其中紅色為FAM，綠色為T(mén)ET，黃色為HEX ；圖25是污染了丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌和雞傷寒沙門(mén)氏菌的魚(yú)肉樣品熒光PCR擴(kuò)增圖，其中紅色為FAM，綠色為T(mén)ET，黃色為HEX。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1菌株的選取及檢測(cè)引物、檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)選取34種不同血清型沙門(mén)氏菌共142株，包括丙型副傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株I株(IQCC10527 )、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌分離株21株(SP1-SP21)、豬霍亂沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株I株(IQCC10502)、豬霍亂沙門(mén)氏菌分離株24株(SC1-SC24)、傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株I株(CMCC50071)、傷寒沙門(mén)氏菌分離株30株(ST1-ST30 )、雞傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株I株(CMCC50770)、雞傷寒沙門(mén)氏菌分離株33株(SG1-SG33)、30株其他血清型沙門(mén)氏菌，除此之外選取變形桿菌等21株非沙門(mén)氏菌，菌株信息如表I所示。上述菌株均經(jīng)API20E試劑條和血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行確證。上述菌株來(lái)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心、廣東省疾病預(yù)防控制中心、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心。

表I實(shí)驗(yàn)用菌株信息表
權(quán)利要求
1.一種豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，其特征在于，所述的檢測(cè)引物如下所示 針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列SCF 5'-GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ；SCR 5'-GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3' ； 針對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌特異序列STF 5'-GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3' ；STR 5'-CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ； 針對(duì)雞傷寒沙門(mén)氏菌特異序列SGF 5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；SGR 5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3' ； 針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列SPF 5'-AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3,；SPR 5'-TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3'。
2.一種豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)探針，其特征在于，所述的檢測(cè)探針如下所示 豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列的探針SCP 5'-AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ； 傷寒沙門(mén)氏菌特異序列的探針STP 5'-ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ； 雞傷寒沙門(mén)氏菌特異序列的探針SGP 5'-ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ； 豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列的探針 SPP 5'-AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ； 探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，四個(gè)探針的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)探針，其特征在于，所述的熒光報(bào)告基因?yàn)镕AM、HEX、TET或ROX，所述的熒光淬滅基團(tuán)為T(mén)AMARA或BHQl。
4.一種豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，包括實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液、UNG酶、耐熱DNA聚合酶、檢測(cè)引物和檢測(cè)探針，其特征在于，所述的檢測(cè)引物包括四對(duì) (1)針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列SCF 5'-GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ；SCR 5'-GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3' ； (2)傷寒沙門(mén)氏菌特異序列STF 5'-GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3' ；STR 5'-CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ； (3)雞傷寒沙門(mén)氏菌特異序列SGF 5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；SGR 5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3' ； (4)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列SPF 5'-AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3' ；SPR 5'-TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3' ； 所述的檢測(cè)探針包括 (I)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列的探針SCP 5'-AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ； (2 )傷寒沙門(mén)氏菌特異序列的探針STP 5'-ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ； (3 )雞傷寒沙門(mén)氏菌特異序列的探針SGP 5'-ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ； (4)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列的探針SPP 5'-AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ； 探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，三探針的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。
5.一種非疾病的診斷和治療目的的豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)對(duì)樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板； (2)使用權(quán)利要求1所述的針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的共有序列、傷寒沙門(mén)氏菌特異序列和雞傷寒沙門(mén)氏菌特異序列的檢測(cè)引物及權(quán)利要求2所述的檢測(cè)探針SCP、STP、SGP，與實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增用的反應(yīng)液、UNG酶及耐熱DNA聚合酶混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系； (3)將擴(kuò)增反應(yīng)體系在熒光PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)探針標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)記錄的熒光信號(hào)，讀取并記錄各檢測(cè)樣品的PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)(Ct)； (4)根據(jù)各樣品的Ct值，按照建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，判斷樣品中是否含有豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌及雞傷寒沙門(mén)氏菌； (5)上述步驟(4)得出的樣品檢測(cè)結(jié)果中如果擴(kuò)增出豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌，則以步驟(I)所提取的增菌液中菌體的基因組DNA作為模板，使用權(quán)利要求1所述的針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的差異序列的檢測(cè)引物和權(quán)利要求2所述的檢測(cè)探針SPP，與實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增用的反應(yīng)液、UNG酶及耐熱DNA聚合酶混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系，將擴(kuò)增反應(yīng)體系在熒光PCR儀上進(jìn)行單一實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)探針標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)記錄的熒光信號(hào)，讀取并記錄各檢測(cè)樣品的PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)(Ct)，根據(jù)各樣品的Ct值，按照建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，區(qū)分樣品中的豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述的樣品為食品。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述的步驟(2)的擴(kuò)增反應(yīng)體系為模版0嫩31^，10\1&9]\&111緩沖液411 l,5mmol/L MgCl22 u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u 1，三種20iimol/L權(quán)利要求2所述的檢測(cè)探針SCP，STP和SGP各lyl，共3^1，六條20iimol/L權(quán)利要求1所述的檢測(cè)引物SCF、SCR、STF、STR、SGF和SGR各I yl，共6 yl，0. 55U UNG酶0. 2u 1,2. 5U/u I Taq 聚合酶 3 ii 1，去離子水 5. 8yl。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(3)的進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng),其反應(yīng)參數(shù)為95°C 30s,95°C 5s,60°C 34s,40個(gè)循環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(5)的擴(kuò)增反應(yīng)體系為模版DNAl ii L，10XTaqMan 緩沖液4 ii l,5mmol/L MgCl22 u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u l,20umol/L權(quán)利要求2所述的檢測(cè)探針SPPl u I，權(quán)利要求1所述的檢測(cè)引物SPF、SPR各I iil，0. 55UUNG 酶 0.2 ii 1,2. 5U/u I Taq 聚合酶 3 ii 1，去離子水 13.8ii I。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(5)的進(jìn)行單一實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，其反應(yīng)參數(shù)為95°C 30s,95°C 5s,60°C 34s,40個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌及雞傷寒沙門(mén)氏菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物、探針、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。本發(fā)明利用三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，將豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌共有序列用于檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌，傷寒沙門(mén)氏菌的特異序列用于檢測(cè)傷寒沙門(mén)氏菌，雞傷寒沙門(mén)氏菌的特異序列用于檢測(cè)雞傷寒沙門(mén)氏菌，通過(guò)一次實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增來(lái)判斷樣品中是否受到豬霍亂沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌及雞傷寒沙門(mén)氏菌的污染，再通過(guò)單一熒光PCR擴(kuò)增區(qū)分豬霍亂沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌，檢測(cè)快速，可在31h完成從制備樣品到出具檢測(cè)結(jié)果的過(guò)程，結(jié)果可靠，且靈敏度高、特異性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103060447SQ201210581310
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者許龍巖, 袁慕云, 曹際娟, 柯碧霞, 相大鵬, 柯昌文 申請(qǐng)人:許龍巖, 袁慕云, 曹際娟, 柯碧霞, 相大鵬, 柯昌文