專利名稱：源于里氏木霉的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從真菌中分離的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，尤其涉及一種從里氏木霉(Trichoderma reesei)中克隆得到的環(huán)境pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl及其cDNA序列,本發(fā)明還提供了涉及含有該P(yáng)H調(diào)控因子cDNA序列的重組表達(dá)載體及重組宿主細(xì)胞，以及它們?cè)谡{(diào)控里氏木霉生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性中的應(yīng)用，屬于真菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的分離和應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
里氏木霉(Trichoderma reesei)是一種廣泛存在自然界的嗜溫腐生真菌,最初在第二次世界大戰(zhàn)期間從棉帆布中分離得到(Mandels et al.，1957)。里氏木霉是工業(yè)上重要的纖維素酶生產(chǎn)菌株，同時(shí)也是用于研究纖維素酶和半纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的模式菌株。里氏木霉具有較全的纖維素酶系，即內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(又稱纖維二糖水解酶)以及β_葡萄糖苷酶。一直以來(lái)，各國(guó)科研學(xué)者對(duì)這些酶結(jié)構(gòu)、生理生化功能等方而進(jìn)行了較為全而系統(tǒng)的研究，但對(duì)于纖維素酶表達(dá)調(diào)控過程中的諸多起始生物學(xué)問題至今尚不明確，纖維素酶的調(diào)控過程中還存在哪些其他途徑的參與，纖維素酶表達(dá)過程中的關(guān)鍵限制因素是什么等一些問題。近年來(lái)，里氏木霉分子生物學(xué)方而研究進(jìn)展迅速，尤其是2008年公布了里氏木霉基因組序列，里氏木霉分子水平上的相關(guān)研究多集中在纖維素酶的誘導(dǎo)表達(dá)方而，尤其是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方而的相關(guān)控制因子的研究。目前已經(jīng)克隆和分析參與纖維素酶代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有ACE1, ACE2, XYRl, CREI, HAP2/3/5 復(fù)合體，XYLl 等(Ilmen et al.，1996 ；Aro et al. ,2001 ；Aro et al. , 2002 ；Mach~Aigner et al. ,2008 ；Stricker et al.，2006 ；Stricker et al. , 2008) 0但最近5年的研究中，發(fā)現(xiàn)很多其他代謝途徑直接或間接參與到里氏木霉纖維素酶代謝的調(diào)控中，如光照信號(hào)GNA1，GNA3, PGLl對(duì)纖維素酶代謝的影響(Seibel et al. , 2009 ；Schmo11 et al. , 2009 ；Limonet al. ,2011)。說明纖維素酶的代謝調(diào)控遠(yuǎn)不止受到這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，還受到其他代謝途徑中的關(guān)鍵因子的調(diào)控。里氏木霉的生長(zhǎng)過程中受到諸多環(huán)境因素的影響，這些外界的環(huán)境因素也或多或少的影響里氏木霉中纖維素酶的代謝。尤其是PH對(duì)微生物的生命活動(dòng)有很大的影響，主要是使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶電荷變化影響生物活性；弓I起細(xì)胞膜電荷變化改變微生物細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能力等等。除上述對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，環(huán)境PH也影響纖維素酶的表達(dá)。環(huán)境PH作為一個(gè)信號(hào)因子，通過環(huán)境pH感應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的傳遞對(duì)纖維素酶的表達(dá)起到調(diào)控作用，PH感應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的終端是環(huán)境pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，由其激活或抑制被PH信號(hào)所調(diào)控基因的表達(dá)與產(chǎn)物分泌。酸性條件更適合里氏木霉纖維素酶的產(chǎn)生，一般PH值范圍為4-7。 綜上所述，鑒定、克隆新的pH轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，不僅對(duì)里氏木霉中纖維素酶的調(diào)控機(jī)理研究有著非常重要的作用，而且還可以利用分子生物學(xué)的手段對(duì)這些關(guān)鍵因子進(jìn)行改造，以提高里氏木霉的纖維素酶產(chǎn)率。到目前為止，并沒有一株通過分子生物學(xué)手段改造的工程菌株用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。因此，不斷的發(fā)現(xiàn)和研究里氏木霉中新的參與纖維素酶調(diào)控的關(guān)鍵因子對(duì)于構(gòu)建整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)有著非常重要的意義，同時(shí)也為通過分子生物學(xué)手段改造的工程菌株早日用于工業(yè)生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述狀況，本發(fā)明目的之一在于提供一種從里氏木霉(Trichoderma reesei)中分離得到的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl及其c DNA序列以及全基因序列。本發(fā)明的另一目的在于構(gòu)建一種涉及包括所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl cDNA的重組表達(dá)載體及重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明的目的之三是將含有該轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl或其cDNA應(yīng)用于調(diào)控里氏木霉生長(zhǎng)發(fā)育或提高里氏木霉的抗環(huán)境脅迫抗性。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明一方而提供一種從里氏木霉(Trichoderma reesei)中分離得到的環(huán)境PH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl cDNA序列，其多核苷酸序列為(a)或(b)或(C)所示(a)、SEQ ID No. 2所示的多核苷酸；(b)、編碼SEQ ID No. 3所示的氨基酸的多核苷酸；(c)、與SEQ ID NO. 2的多核苷酸的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多核苷酸仍具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的功能或活性。

優(yōu)選的,本發(fā)明所述的從里氏木霉(Trichoderma reesei)中所克隆的pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPaclcDNA序列為SEQ ID No. 2所示的多核苷酸序列。本發(fā)明所述pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPaclcDNA序列包含完整的開放閱讀框。本發(fā)明還提供了編碼pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl的全基因序列，所述全基因的多核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。本發(fā)明提供了上述環(huán)境pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl cDNA所編碼的能夠激活或抑制被PH信號(hào)所調(diào)控基因的環(huán)境pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，其氨基酸序列為(a)或(b)所示(a) SEQ ID No. 3 所示的氨基酸；(b)將SEQ ID No. 3所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No. 3所示轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子功能或活性的蛋白變體。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)錄因子為SEQ ID No. 3所示的氨基酸。所述的“多個(gè)”通常意味著2-8個(gè)，優(yōu)選為2-4個(gè)，這取決于轉(zhuǎn)錄因子三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的“替換”是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的“缺失”是指氨基酸殘基數(shù)量的減少，也即是分別缺少其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的“插入”是指氨基酸殘基序列的改變，相對(duì)天然分子而言，所述改變導(dǎo)致添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn)生，這些操作方法通常為本領(lǐng)域所了解。例如，可通過DNA的突變來(lái)制備轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列變體或片段，其中由于誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知。其中，保守的取代是將一種氨基酸殘基替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建了一種涉及該pH調(diào)控因子TrPacl cDNA序列或全基因序列的重組表達(dá)載體及含有該重組表達(dá)載體或表達(dá)盒的重組宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明將克隆得到的TrPacl cDNA或全基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接，構(gòu)建獲得重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到里氏木霉中調(diào)控里氏木霉的生長(zhǎng)發(fā)育或用以提高里氏木霉抗逆性。所述重組表達(dá)載體或表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、TrPacl cDNA或全基因、終止子；其中，TrPacl cDNA序列或全基因位于啟動(dòng)子的下游，終止子在TrPacl cDNA序列的下游。為了確證本發(fā)明所分離的TrPacl cDNA或全基因是否具有轉(zhuǎn)錄因子功能或活性，本發(fā)明構(gòu)建了 PH調(diào)控因子TrPaclcDNA敲除載體以及該敲除載體的互補(bǔ)載體。所述基因敲除載體或表達(dá)盒包括pH調(diào)控因子TrPacl cDNA的上游1000bp-2000bp長(zhǎng)度序列，報(bào)告基因，pH調(diào)控因子TrPac I cDNA的下游1000bp-2000bp長(zhǎng)度序列；其中，報(bào)告基因在pH調(diào)控因子TrPaclcDNA的上游序列的下游，pH調(diào)控因子TrPaclcDNA的下游序列在報(bào)告基因的下游。通過將該基因敲除載體轉(zhuǎn)化至里氏木霉中得到重組轉(zhuǎn)化體，即PH調(diào)控因子TrPacl基因功能缺失的突變體。本發(fā)明構(gòu)建的TrPaclcDNA敲除載體包含pH調(diào)控因子TrPacl cDNA序列的上下游同源重組片段，完全避開TrPacl cDNA的開放閱讀框，這樣在利用重組質(zhì)粒進(jìn)行基因敲除時(shí)，TrPaclcDNA基因就能被報(bào)告基因完全敲除。通過將該敲除基因互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化至里氏木霉中得到重組轉(zhuǎn)化體即PH調(diào)控因子TrPacl基因功能缺失的互補(bǔ)體。TrPacl敲除突變體菌落形態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明，pH值為6和8時(shí)，菌落形態(tài)有明顯差異，敲除了 TrPacl的突變體菌落較小，產(chǎn)孢量明顯低于野生型和互補(bǔ)菌株；根據(jù)產(chǎn)孢量及萌發(fā)率的試驗(yàn)結(jié)果可見，敲除了 TrPacl的突變體菌株的產(chǎn)孢量為野生型和互補(bǔ)突變體的1/2，而萌發(fā)率并未有明顯變化；敲出了 TrPacl的突變體菌株的產(chǎn)孢量為野生型和互補(bǔ)突變體的71. 8%。 根據(jù)TrPacl敲除突變體抗逆敏感性的測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果可見，敲除了 TrPacl的突變體菌株隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，其生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)低于野生型和突變體，說明由于TrPacl基因的缺失影響了菌株對(duì)H2O2的抗逆能力。上述試驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明從從里氏木霉(Trichoderma reesei)中克隆得到的TrPacl cDNA所編碼的蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子活性能夠調(diào)控里氏木霉的生長(zhǎng)發(fā)育以及提高里氏木霉的抗逆性。此外，本發(fā)明提供了利用上述TrPacl編碼的蛋白質(zhì)為目標(biāo)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索其他親緣關(guān)系較近的絲狀真菌中尋找同源蛋白，如鐮刀菌(Fusarium oxysporum),小麥赤霉菌(Gibberella zeae)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，黑曲霉(Aspergillus niger)
坐寸ο 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)定義。除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的條件。通常，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測(cè)程度比與其它序列雜交的可檢測(cè)程度更高(例如超過本底至少2倍。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會(huì)不同，較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性或洗滌條件可鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列。對(duì)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參考有關(guān)文獻(xiàn)(Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes， " Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays. 1993)。更具體的，所述嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強(qiáng)度PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)約5-10°C。Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度(在指定離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)(因?yàn)槟繕?biāo)序列過量存在，所以在Tm下在平衡狀態(tài)下50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件其中在pH 7.0到8.3下鹽濃度低于約1. OM鈉離子濃度，通常為約O. 01到1. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對(duì)于短探針(包括(但不限于)10到50個(gè)核苷酸)而言為至少約30°C，而對(duì)于長(zhǎng)探針(包括(但不限于)大于50個(gè)核苷酸)而言為至少約60°C。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下50%甲酰胺，5\33(和1% SDS，在42°C下培養(yǎng)；*5XSSC，1% SDS，在65°C下培養(yǎng)，在0. 2XSSC中洗滌和在65°C下于0. 1% SDS中洗滌。所述洗滌可進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。術(shù)語(yǔ)“基因敲除”意指在所屬領(lǐng)域中外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中。用于基因突變，也用于正確糾正機(jī)體的基因突變，及推測(cè)相應(yīng)基因的功能，還包括引入新基因及引入定點(diǎn)突變。本發(fā)明中意指向PH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl中插入外源抗性標(biāo)記基因使pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl基因失活而代替該轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl基因，經(jīng)基因敲除后，即獲得含有抗性標(biāo)記基因的敲除載體。術(shù)語(yǔ)“基因互補(bǔ)”意指本發(fā)明中恢復(fù)被敲除的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl基因，且包括該基因上下游的啟動(dòng)子，終 止子區(qū)域，確保被恢復(fù)的TrPacl基因順利表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化子”或“重組宿主菌株”意指涉及本發(fā)明pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl或其編碼的cDNA的重組質(zhì)粒載體的受體細(xì)胞，而不管使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生受體細(xì)胞，例如直接吸取、轉(zhuǎn)導(dǎo)或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”:將外源基因序列引入到宿主細(xì)胞或有機(jī)體的方法。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991) ;0htsuka 等人,J. Biol.Chem. 260 :2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes8 :91-98(1994))。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子”能夠識(shí)別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的調(diào)控序列的一類特定蛋白質(zhì)因子。術(shù)語(yǔ)“可操作的連接”指兩個(gè)或更多個(gè)元件之間功能性的連接，可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。術(shù)語(yǔ)“編碼序列”:轉(zhuǎn)錄成RNA的核苷酸序列。


圖1是源于里氏木霉環(huán)境pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl基因敲除載體構(gòu)建示意圖；圖2是源于里氏木霉環(huán)境pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl基因互補(bǔ)載體示意圖；圖3是源于里氏木霉環(huán)境pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl基因敲除過程示意圖；圖4是源于里氏木霉環(huán)境pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl基因敲除雜交圖；圖5是野生里氏木霉菌株、敲除TrPacl基因突變菌株、敲除TrPacl基因突變菌株的互補(bǔ)菌株在不同PH值的平板上的菌落形態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和 替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1 :里氏木霉中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl全基因克隆1、TrPacl基因DNA序列的克隆從里氏木霉菌株QM9414(本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存)中提取基因組DNA作為模板，再根據(jù)里氏木霉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息設(shè)計(jì)引物，采用高保真PCR獲得目的片段。(I)里氏木霉基因組DNA的提取將生長(zhǎng)于PDA平板上的里氏木霉孢子用滅菌水清洗，清洗后用滅菌三層擦鏡紙過濾，濃度稀釋至IO6個(gè)/ml ;將Iml孢子懸液接種于含有80ml CM培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C，ISOrpm培養(yǎng)24h。培養(yǎng)好的菌絲用滅菌三層擦鏡紙過濾，并用蒸餾水清洗菌絲2_3次后收集，用吸水紙吸干，凍存于_20°C。直接提取里氏木霉基因組DNA將收集得到的菌絲用液氮研磨，2-3次；所得的菌絲粉末轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管中，每管加入2%的CTAB 700 μ L ;將1. 5ml離心管上下顛倒混勻，65°C保溫30min，每隔IOmin搖勻I次；再加入等體積氯仿異戊醇(24 1，V/V)，平板搖床上輕搖IOmin后，12000r/min離心IOmin ;取上清,加入等體積異丙醇,顛倒混勻后,室溫放置IOmin, 12000r/min離心IOmin,倒掉上清，加70%的酒精500 μ L洗沉淀，室溫干燥加入50 μ LTE dd H2O使DNA完全溶解，加入 RNase A(10mg/mL)，65°C保溫 30min，最后 DNA 溶于 30 μ L ddH20 中。(2) TrPacl基因DNA序列的擴(kuò)增引物序列如下TrPac IDNApl :5’ -CCGACAATGTCGGCCCAAGTCCCCG-3’
TrPac lDNAp2 :5’ -TCAGGTTCCAGGAACAGGAAGGAC-3’PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，(94°C 30秒，55 °C 2分鐘，68°C I分30秒)共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72 °C 10分鐘。PCR反應(yīng)體系為里氏木霉基因組DNA I μ l,Taq plus聚合酶I μ 1，引物(IOOmM)各 O. 4 μ 1，Taq plus 緩沖液 5 μ 1，dNTP (25mM) I μ I，其余用水補(bǔ)足至 50 μ I。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后膠回收純化，與pUCM-T載體連接，經(jīng)大腸桿菌DH-5 α轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆，并經(jīng)菌落PCR及酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后送樣測(cè)序，序列見SEQID No.1。實(shí)施例2 :里氏木霉中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl基因cDNA序列的克隆1、里氏木霉總RNA的提取將生長(zhǎng)于PDA平板上的里氏木霉孢子用滅菌水清洗，清洗后用滅菌三層擦鏡紙過濾，濃度稀釋至IO6個(gè)/ml ;將Iml孢子懸液接種于含有80ml CM培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C，ISOrpm培養(yǎng)24h。培養(yǎng)好的菌絲用滅菌三層擦鏡紙過濾，并用蒸餾水清洗菌絲2_3次后收集，用吸水紙吸干，將收集好的菌絲采用RNA提取試劑盒立即提取RNA或者先在液氮中凍存后置于_80°C凍存用于后續(xù)提取。RNA提取樣品立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得單鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用作模板進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增。引物序列如下

TrPaclcDNAp1:5，-ATGTCGGCCCAAGTCCCCGACC-3’TrPaccDNAp2 :5， -TCAGGTTCCAGGAACAGGAAGGAC-3，PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，(94°C 30秒，55 °C 2分鐘，68 °C I分30秒)共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72 °C 10分鐘。PCR反應(yīng)體系為里氏木霉cDNAly 1，Taq plus聚合酶I μ 1，引物(IOOmM)各O. 4 μ 1，Taq plus 緩沖液 5 μ 1，dNTP (25mM) I μ I，其余用水補(bǔ)足至 50 μ I。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后膠回收純化，與pUCM-T載體連接，經(jīng)大腸桿菌DH-5 α轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆，并經(jīng)菌落PCR及酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后送樣測(cè)序，序列見SEQID No. 2。實(shí)施例3 =TrPacl基因敲除載體的構(gòu)建采用三段式方法構(gòu)建基因敲除載體，即分別將TrPacl基因的上游和下游1000bp-2000bp長(zhǎng)度的序列插入到潮霉素抗性基因的兩端。首先從里氏木霉基因組中分別擴(kuò)增TrPacl基因的上下游片段，各片段長(zhǎng)約lOOObp，先分別連接pGEM-T載體，上游采用KpnI和SalI限制性內(nèi)切酶雙酶切位點(diǎn)，下游采用HidIII和XbaI限制性內(nèi)切酶雙酶切位點(diǎn)，從T載體切下后，先將上游片段連到用同樣酶切位點(diǎn)的pBS-Hyr上，然后再用HidIII和XbaI酶切上述載體，將T載體酶切后的下游片段連到該酶切位點(diǎn)處，即構(gòu)建好基因敲除載體。引物序列如下Pacupl :5，-ATggtaccGGCCGTGTGACCGCTGGAGAGT-3，Pacup2 :5， -ATgtcgacCAGGCCTGGGATTGCGATGGAC-3，Pacdnl :5’ -AAaagcttGGCGTTTCCATTTTCTATCATTCT_3’Pacdn2 :5’ -AAtctagaCTCGGCCCTTCTGCTCCTCTCCAT_3’
引物序列中，小寫字母表示酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，(94°C 30秒，55 °C I分鐘，68 °C I分30秒)共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72 °C 10分鐘。PCR反應(yīng)體系為里氏木霉基因組DNAl μ 1，Taq plus聚合酶I μ 1，引物(IOOmM)各 O. 4 μ 1，Taq plus 緩沖液 5 μ 1，dNTP (25mM) I μ I，其余用水補(bǔ)足至 50 μ I。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后膠回收純化與pGEM-T載體連接，經(jīng)大腸桿菌DH-5a轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆，并經(jīng)菌落PCR及酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后提取質(zhì)粒，用KpnI和SalI酶切。連接到同樣酶切的pBS-Hyr上；采用同樣的方法連接下游片段至上述載體上，即構(gòu)建完成基因敲除載體pTrPacl-K0(圖1)。實(shí)施例4 =TrPacl基因敲除載體的互補(bǔ)載體的構(gòu)建采用高保真長(zhǎng)片段PCR方法、以里氏木霉基因組DNA為模板擴(kuò)增得到含有TrPacl基因全長(zhǎng)、啟動(dòng)子區(qū)域和終止子區(qū)域的DNA片段，先將該片段插入到pGEM-T載體中，然后用限制性內(nèi)切酶BamHI和SmaI限制性內(nèi)切雙酶切從pGEM_T載體上切下目的片段，插入到含有氯嘧磺隆抗性基因的載體pBS-SUR上，即構(gòu)建好TrPacl基因的互補(bǔ)載體pTrPacl_HB。引物序列如下TrPaclHBpl :5，-ATggatccAGGCCGTGTGACCGCTGGAGAGT-3，TrPacIHBp2 :5， -TTcccgggTCTTCAACATAACACCCACCGCAA-3’弓丨物序列中，小寫字母表示酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)條件為94°C 5 分鐘，(94°C 30 秒，55°C 3 分鐘 50 秒，68°C I 分 30 秒)共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72 0C 10分鐘。`PCR反應(yīng)體系為里氏木霉cDNAly 1，Taq plus聚合酶I μ 1，引物(IOOmM)各
O.4μ I, T aq plus 緩沖液 5 μ I，dNTP(25mM) I μ 1，其余用水補(bǔ)足至 50 μ I。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后膠回收純化，與pGEM-T載體連接，經(jīng)大腸桿菌DH-5 α轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆，并經(jīng)菌落PCR及酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后提取質(zhì)粒，用BamHI和SmaI酶切，并連接到同樣酶切的pBS-SUR上，重復(fù)轉(zhuǎn)化步驟，驗(yàn)證正確，即構(gòu)建好TrPacl基因的互補(bǔ)載體pTrPacl-HB(圖2，圖3)。實(shí)施例5 :里氏木霉原生質(zhì)體制備將里氏木霉接于PDA平板上，于28°C培養(yǎng)3天左右后，用蒸餾水洗平板，收集孢子，調(diào)整濃度至IO6個(gè)/ml。按5%的接種量將上述濃度的孢子懸液接于IOOml CM培養(yǎng)基中，28°C，180rpm培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)好的菌絲用3層紗布過濾，并用無(wú)菌水洗滌2_3次，壓干水分。得到的菌絲置于50ml三角瓶中，用酶解液(崩潰酶，濃度為5mg/ml，每克菌絲5ml酶解液)30°C，80rpm酶解2_3h。取出酶解液，O. 7MNaCl洗滌，三層濾紙過濾，除去殘?jiān)?，濾液收集到50ml的離心管中，并置于冰上。收集得到的濾液4°C，3000rpm，離心lOmin。沉淀用 10-20ml STC(1. 2M Sorbitol, IOmM Tris-HCl pH7. 5,20mM CaCl2)懸浮沉淀，用剪過的槍頭輕輕的吹打。懸浮液4°C，3000rpm離心，IOmin并重復(fù)兩次。所得到的原生質(zhì)體沉淀用STC懸浮，調(diào)節(jié)其終濃度為IO8個(gè)/ml。實(shí)施例6 =TrPacl敲除突變體的獲得和鑒定UTrPacl敲除突變體的獲得將實(shí)施例5中制備的原生質(zhì)體分裝于50ml離心管中，每管150 μ I。每管中加入已線性化的 DNA2y 1，4°C放置 25min。緩慢加入 Iml PTC (60% PEG4000, IOmM Tris-HCl pH7. 5,20mM CaCl2),輕輕混勻，4°C放置25min。緩慢加入5ml OCM液體培養(yǎng)基(Liu et al.，2007)，輕輕搖勻，置于28°C，IOOrpm,搖過夜。過夜培養(yǎng)的原生質(zhì)體，每管加入含有200 μ g/ml潮霉素的固體OCM培養(yǎng)基，混勻，倒平板。28°C黑暗培養(yǎng)3_4天后挑取轉(zhuǎn)化子。初步篩選得到的轉(zhuǎn)化子再次接于含有潮霉素的抗性平板上進(jìn)行2次篩選。2、里氏木霉轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定將具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子挑出，CM培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，獲得的菌絲DNA，進(jìn)行初步的PCR驗(yàn)證引物如下Paccheckl :5’ -GCGCCGCCAGATCGACCCTACC-3，Pac check2 :5， -GACGCCATGCTTGCCGCTGAGAC-3，PCR擴(kuò)增條件如下 940C 2 分鐘，(94°C 30 秒，55 V 30 秒，68°C I 分 30 秒)共計(jì) 25 個(gè)循環(huán)，72 °C 3分鐘。選取沒有擴(kuò)增得到的目的條帶的轉(zhuǎn)化子挑出，再次CM液體培養(yǎng)，獲得菌絲。獲得的菌絲大量提取基因組DNA，純化后酶切進(jìn)行Southern雜交驗(yàn)證。實(shí)施例7 =TrPacl互補(bǔ)突變體的獲得和鑒定將實(shí)施例2構(gòu)建好的互補(bǔ)突變體通過實(shí)施例3中的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到突變體中，挑取具有氯嘧磺隆抗性的轉(zhuǎn)化子再次培養(yǎng)，獲得大量菌絲并提取DNA，純化酶切后進(jìn)行Southern雜交驗(yàn)證(圖4)，WT為野生型菌株，18，24為突變體菌株，18HB為突變體18的互補(bǔ)菌株。從圖4中可以看出18，24為突變體菌株基因條帶與WT為野生型菌株和互補(bǔ)菌株相比，大小有差異，，說明TrPacl基因被敲除。實(shí)施例8 =TrPacl敲除突變體菌落形態(tài)、產(chǎn)孢量、萌發(fā)率及生長(zhǎng)速率的測(cè)定1、菌落形態(tài)的觀察將野生型和突變體菌株分別接于不同pH值的PDA平板上，PDA培養(yǎng)基配方為每升培養(yǎng)基中土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g。PDA的pH采用HCl和NaOH調(diào)節(jié)至4，6，8。30°c培養(yǎng)3天后拍攝菌落形態(tài)(圖5)。其中，18為突變體，18HB為互補(bǔ)菌株。從圖5中可以看到，在pH為4時(shí)，各個(gè)菌株之間形態(tài)上無(wú)明顯差異，pH值為6和8時(shí)，菌落形態(tài)有明顯差異，突變體菌落較小，產(chǎn)孢量明顯低于野生型和互補(bǔ)菌株。2、產(chǎn)孢量及萌發(fā)率在pH值為6和8的條件下，將培養(yǎng)3天的PDA平板用打孔器打3個(gè)孔，位置分別在靠近菌落中心，菌落中間位置和菌落邊緣；將打好的菌塊置于IOml離心管中，同時(shí)離心管里加入5個(gè)玻璃珠，每個(gè)管中加入5m I ddH20;漩渦振蕩器上震蕩5分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)(表I)。其中，WT為野生型菌株，18為突變體菌株，18HB為突變體18的互補(bǔ)菌株。將培養(yǎng)3天的PDA平板上的孢子用無(wú)菌水沖洗，并稀釋到IO6個(gè)/ml ;將載玻片用無(wú)水乙醇沖洗并擦干，吸取10 μ I孢子懸液滴于載玻片上，保濕培養(yǎng)。每隔2小時(shí)取出，觀察萌發(fā)情況(表1，表2)。其中，WT為野生型菌株，18為突變體菌株，18ΗΒ為突變體18的互補(bǔ)菌株。
表I不同菌株的產(chǎn)孢量及萌發(fā)率(pH = 6)
權(quán)利要求
1.一種從里氏木霉(Trichoderma reesei)中分離得到的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl cDNA,其特征在于，其多核苷酸序列為(a)或(b)或(C)所示 (a)、SEQID No. 2所示的多核苷酸； (b)、編碼SEQID No. 3所示的氨基酸的多核苷酸； (c)、與SEQID NO. 2的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多核苷酸仍具有PH調(diào)控因子的功能或活性。
2.一種從里氏木霉(Trichoderma reesei)中分離得到的編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl的全基因，其特征在于其多核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。
3.里氏木霉(Trichodermareesei)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl,其特征在于,其氨基酸序列為(a)或(b)所示 (a)、SEQID No. 3所示的氨基酸； (b)jfSEQ ID No. 3所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No. 3所示轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子功能或活性的蛋白變體。
4.含有權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPaclcDNA的重組表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求2所述全基因的重組表達(dá)載體。
6.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，包括啟動(dòng)子、權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl cDNA或權(quán)利要求2所述的全基因，終止子；其中，權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPacl cDNA或權(quán)利要求2所述的全基因在啟動(dòng)子的下游，終止子在TrPacl cDNA或全基因的下游。
7.用以敲除權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPaclcDNA或權(quán)利要求2所述全基因的基因敲除載體。
8.與權(quán)利要求6所述基因敲除載體相互補(bǔ)的互補(bǔ)載體。
9.含有權(quán)利要求4-6任何一項(xiàng)所述重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPaclcDNA或權(quán)利要求2所述的全基因在調(diào)控里氏木霉的生長(zhǎng)發(fā)育或提高里氏木霉抗逆性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了源于里氏木霉轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種從里氏木霉(Trichoderma reesei)中克隆得到的環(huán)境pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPac1全基因和cDNA序列，其核苷酸序列分別為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所編碼的氨基酸序列為SEQ ID No.3所示。本發(fā)明還構(gòu)建了包含有該pH轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPac1 cDNA序列的重組表達(dá)載體及重組宿主細(xì)胞，本發(fā)明進(jìn)一步提供了pH轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TrPac1 cDNA在調(diào)控里氏木霉生長(zhǎng)發(fā)育或抗逆性中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/80GK103060341SQ201210538579
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者赫榮琳, 馬立娟, 張東遠(yuǎn), 陳樹林 申請(qǐng)人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所