專利名稱：禽流感病毒及其檢測(cè)試劑盒和疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及三種H9N2禽流感病毒的新毒株及用于檢測(cè)、預(yù)防禽流感病毒的試劑盒和疫苗。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian influenza, Al)是由A型流感病毒引起的一種嚴(yán)重危害禽類健康的傳染性疾病。禽類感染禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)后，癥狀可表現(xiàn)為非顯性感染、亞臨診感染，或輕度呼吸道疾病、產(chǎn)蛋量降低直至急性全身致死性疾病等多種形式。根據(jù)AIV對(duì)易感雞致病性的差異，可將AIV分為高致病性AIV和低致病性AIV。高致病性AIV(HPAIV)感染禽類所導(dǎo)致的禽流感對(duì)養(yǎng)禽業(yè)具有毀滅性的打擊，故被國(guó)際獸疫局規(guī)定為A類疾?。欢恍┑椭虏⌒訟IV,如H9AIV的感染雖然對(duì)感染禽的致死率低，但可引起產(chǎn)蛋量的減少和淘汰率的上升，并造成免疫抑制，引起其他疫病的發(fā)生或混合感染，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失也相當(dāng)可觀。因此，Al —直是威脅世界養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，世界各國(guó)都十分重視對(duì)AIV的研究工作。已有研究表明來自于禽類的H9N2禽流感病毒能偶爾從禽類傳染給哺乳動(dòng)物，包括人和豬。Ck/Be1-like和Gl-1ike H9N2禽流感病毒在1990底首次從人和豬中分離到。2003年分離到的人H9N2禽流感病毒是一個(gè)新的重組體，很可能來源于當(dāng)?shù)氐幕钋菔袌?chǎng)。這種跨種間傳播表明目前的H9N2禽流感病毒對(duì)人仍有潛在的感染性。AIV存在著廣泛的抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變現(xiàn)象，其抗原變異頻率很高。因此測(cè)定AIV的全基因序列，對(duì)于研究禽流感病毒的檢測(cè)、分布、流行規(guī)律以及控制禽流感的流行、蔓延均具有重要的意義。本研究分離鑒定了 2002-2008年上海地區(qū)活禽市場(chǎng)的H9N2亞型禽流感病毒，經(jīng)全基因序列測(cè)定分為三種基因型，對(duì)這三種基因型毒株的8個(gè)基因片段進(jìn)行關(guān)鍵位點(diǎn)的分析以及基因進(jìn)化關(guān)系分析，表明這三種基因型與目前報(bào)道的基因型存在差異，為H9N2禽流感病毒Ck/Bei系中的三種新的基因型，分別命名為Yl，Y2, Ti。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了三種H9N2禽流感病毒及用于檢測(cè)、預(yù)防禽流感病毒的試劑盒和疫苗，所述的這三種H9N2禽流感病毒及用于檢測(cè)、預(yù)防禽流感病毒的試劑盒和疫苗要解決現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)法確認(rèn)和預(yù)防新的禽流感病毒從而導(dǎo)致新的禽流感疫情在禽類或者人類傳播的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種分離的禽流感病毒(Y1)，其基因組由SEQ ID NO=USEQ ID NO2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8所示的RNA片段組成。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒，其保藏號(hào)為CGMCC NO :3117。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)上述的分離的禽流感病毒的試劑盒，含有上述的分離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和含有引物的PCR反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液中的引物為HA 基因上游引物 P1:5 ’ -CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3 ’，下游引物P2:5 ’ -GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3 ’ ；M 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3 ’，下游引物P2:5’ -CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’ ；NA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3 ’，
下游引物P2:5 ’ -AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3 ’ ；NP 基因上游引物 P1: 5 ’ -ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3 ’，下游引物P2:5，-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3，；NS 基因上游引物 P1: 5 ’ -ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3 ’，下游引物P2:5 ’ -GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，；PA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3 ’，下游引物P2:5 ’ -ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3 ’ ；PB I 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3 ’，下游引物P2:5’ -AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’ ；PB2 基因上游引物 P1: 5 ’ -GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3 ’，下游引物P2:5 ’ -AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3 ’。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防上述的禽流感病毒的疫苗，含有滅活的上述的分離的禽流感病毒。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其包括如下步驟a)，一個(gè)疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定的步驟，將上述的禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)在109. 6-109. 8ELD50, HA價(jià)在I =256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個(gè)抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗(yàn)合格后作為制備抗原液；c)，一個(gè)制備油相佐劑的步驟；d)，一個(gè)制備疫苗水相的步驟；e)，一個(gè)配制疫苗的步驟，將油相與水相預(yù)混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內(nèi)乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。進(jìn)一步的，所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。進(jìn)一步的，在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗原液中，吐溫-80的終濃度在2% - 5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。本發(fā)明還提供了一種抗體，抗上述的一種分離的禽流感病毒(Yl)。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒(Y2)，其基因組由SEQ ID NO :9、SEQ IDNO 10,SEQ ID NO 1USEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO : 14、SEQ ID N0:15 和 SEQID NO 16所示的RNA片段組成。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒，其保藏號(hào)為CGMCC NO :3118。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)上述的分離的禽流感病毒的試劑盒，含有上述的分離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和含有引物的PCR反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液中的引物為HA 基因上游引物 P1:5 ’ -CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3 ’，下游引物P2:5 ’ -GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3 ’ ；M 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3 ’，下游引物P2:5，-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3 ’ ；NA 基因上游引物 P1: 5，-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3 ’，
下游引物 P2:5 ’ -AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3 ’ ；NP 基因上游引物 P1: 5 ’ -ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3 ’，下游引物P2:5 ’ -GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3 ’ ；NS 基因上游引物 P1: 5 ’ -ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3 ’，下游引物P2:5，-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，；PA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3 ’，下游引物P2:5 ’ -ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3 ’ ；PB I 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3 ’，下游引物P2:5，-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3 ’ ；PB2 基因上游引物 P1: 5 ’ -GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3 ’，下游引物 P2:5 ’ -AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3，。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防上述的禽流感病毒的疫苗，含有滅活的上述的禽流
感病毒。本發(fā)明還提供了上述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其包括如下步驟a)，一個(gè)疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定的步驟，將上述的禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)在109 6-109 8ELD50，HA價(jià)在1:256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b ), —個(gè)抗原液滅活的步驟,將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗(yàn)合格后作為制備抗原液；c)，一個(gè)制備油相佐劑的步驟；d)，一個(gè)制備疫苗水相的步驟；e)，一個(gè)配制疫苗的步驟，將油相與水相預(yù)混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內(nèi)乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。進(jìn)一步的，所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。進(jìn)一步的，在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗原液中，吐溫-80的終濃度在2% - 5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。本發(fā)明還提供了一種抗體，抗上述的一種分離的禽流感病毒(Y2 )。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒(Y3)，其基因組由SEQ ID NO :17、SEQ IDNO 18,SEQ ID NO 19,SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23 和 SEQID NO 24所示的RNA片段組成。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒，其保藏號(hào)為CGMCC NO :3119。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)上述的分離的禽流感病毒的試劑盒，含有上述的分離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和含有引物的PCR反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液中的引物為HA 基因上游引物 P1:5 ’ -CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3 ’，下游引物P2:5，-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3 ’ ；M 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3 ’，下游引物P2:5’ -CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’ ；
NA 基因上游引物 P1: 5，-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3 ’，下游引物P2:5，-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3 ’ ；NP 基因上游引物 P1: 5 ’ -ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3 ’，下游引物P2:5’ -GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’ ；NS 基因上游引物 P1: 5 ’ -ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3 ’，下游引物P2:5，-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，；PA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3 ’，下游引物P2:5，-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3 ’ ；PB I 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3 ’，下游引物P2:5，-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’ ；PB2 基因上游引物 P1: 5 ’ -GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3 ’，下游引物P2:5，-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3 ’。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防上述的禽流感病毒的疫苗，含有滅活的上述的禽流
感病毒。本發(fā)明還提供了上述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其包括如下步驟a)，一個(gè)疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定的步驟，將上述的禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)在109_6-109 8ELD50，HA價(jià)在1:256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個(gè)抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗(yàn)合格后作為制備抗原液；c)，一個(gè)制備油相佐劑的步驟；d)，一個(gè)制備疫苗水相的步驟；e)，一個(gè)配制疫苗的步驟，將油相與水相預(yù)混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內(nèi)乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。進(jìn)一步的，所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。進(jìn)一步的，在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗原液中，吐溫-80的終濃度在2% - 5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。本發(fā)明還提供了一種抗體，抗權(quán)利要求1所述的一種分離的禽流感病毒(Y3)。本發(fā)明借助MEGA3.1分析軟件，對(duì)這三種基因型H9N2禽流感病毒的8個(gè)基因片段分別進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制和分析。這三種基因型毒株屬于Ck/Bei系，均為四重重組體，并且這三種基因型與目前報(bào)道的Ck/Bei系中的基因型不同，因此為RT-PCR檢測(cè)這三種新基因型8個(gè)基因片段提供了模板序列。通過本發(fā)明的試劑盒，可以迅速的檢測(cè)或者排除是否是新的禽流感由本發(fā)明的三種基因型的H9N2禽流感病毒所致，從而盡快的控制禽流感疫情。同時(shí)，接種本發(fā)明的疫苗，可以預(yù)防本發(fā)明的三種基因型的H9N2禽流感病毒的感染。使用本發(fā)明的抗體，可以治療本發(fā)明的三種基因型的H9N2禽流感病毒的感染。本發(fā)明對(duì)分離的三種H9N2禽流感病毒進(jìn)行了保藏。第一種分離的H9N2禽流感病毒的分類命名為甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，該病毒保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)中，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2009年6月12號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC N0:3117。第二種分離的H9N2禽流感病毒的分類命名為甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，該病毒保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)中，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2009年6月12號(hào)，保藏號(hào) 為CGMCC NO: 3118。第三種分離的H9N2禽流感病毒的分類命名為甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，該病毒保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CG MCC)中，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2009年6月12號(hào)，保藏號(hào)為CGMCCN0:3119。本發(fā)明還可以對(duì)禽流感病毒監(jiān)測(cè)系統(tǒng)提供生物信息。對(duì)這三種基因型病毒關(guān)鍵位點(diǎn)的分析能提供這三種基因型是否有向人類感染的威脅以及8個(gè)片段重排的規(guī)律，尤其是有無(wú)H5片段的存在等，提供是否有向高致病性禽流感轉(zhuǎn)變的可能性，并為我國(guó)H9N2禽流感病毒種子庫(kù)提供儲(chǔ)備，并為病毒的追蹤溯源提供序列信息。


圖1是H9N2禽流感病毒中HA基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖2是H9N2禽流感病毒中NA基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖3是H9N2禽流感病毒中PB2基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖4是H9N2禽流感病毒中PBl基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖5是H9N2禽流感病毒中PA基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖6是H9N2禽流感病毒中M基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖7是H9N2禽流感病毒中NP基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖8是H9N2禽流感病毒中NS基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1病毒的獲得于2002年至2008年從上海地區(qū)的活禽批發(fā)市場(chǎng)獲得商品代三黃雞，采集活禽樣品包括氣管或泄殖腔拭子，將采集樣品放在含有抗菌素的PH值7. (T7. 4的等滲磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi)。將鑒定為陽(yáng)性樣品的棉拭子充分捻動(dòng)、擰干后棄去拭子，樣品液經(jīng)lOOOr/min離心lOmin，取上清液作為接種材料。取處理好的樣品以0. 2mL/胚的量經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡 11日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種5個(gè)胚，于35°C 37°C孵化箱內(nèi)孵育，18h后每8h觀察雞胚死亡情況。無(wú)菌收取18h以后的死胚及96h仍存活雞胚的雞胚尿囊液，測(cè)血凝活性，通過下面的實(shí)施例對(duì)從雞胚尿囊液中的病毒進(jìn)行基因測(cè)序和鑒定，是三種新的甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，對(duì)此進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)分別為CGMCC NO :3117(Ck/SH/Yl/06)、CGMCC NO :3118 (Ck/SH/Yl/07)、CGMCC NO :3119 (Ck/SH/Yl/08)。實(shí)施例2三種基因型H9N2禽流感病毒的全基因測(cè)序2.1于2002年至2008年從上海地區(qū)的活禽批發(fā)市場(chǎng)獲得商品代三黃雞，共分離、鑒定了三種基因型H9N2禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/Yl/06(簡(jiǎn)寫為Ck/SH/Yl/06，基因型 Yl) ;A/Chicken/Shanghai/Yl/07(簡(jiǎn)寫為 Ck/SH/Yl/07,基因型 Y2)；A/Chicken/Shanghai/Yl/08(簡(jiǎn)寫為 Ck/SH/Yl/08,基因型 Y3)。病毒鑒定用的 H9亞型血清購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增H9亞型AIV所有8個(gè)基因片段的特異引物由寶生物(大連)工程公司合成。
HA 基因上游引物 P1:5 ’ -CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3 ’ ；下游引物P2:5 ’ -GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3 ’。M 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3 ’。NA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3 ’。NP 基因上游引物 P1: 5 ’ -ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3，。NS 基因上游引物 P1: 5 ’ -ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，。PA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3 ’。PB I 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3 ’。PB2 基因上游引物 P1: 5 ’ -GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3 ’。2. 2將陽(yáng)性樣本接種SPF雞胚，取感染雞胚尿囊液用TRIzol抽提試劑進(jìn)行RNA的抽提。2.3 8個(gè)基因片段RT-PCR擴(kuò)增如下采用20iiL的cDNA合成體系置于0. 2mL反應(yīng)管中，取溶于DEPC處理水中的AIV RNA樣品9iiL，分別加入上游引物3 y L，5倍RT-PCR緩沖液 4 ii L, dNTPs (IOmmoI/L) 2. 5 u L, RNA 酶抑制劑 0. 5 y L, AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 2 y L,用無(wú) RNase的超純水加至總體積為20 u L,置于PCR儀中進(jìn)行cDNA合成，以30°C IOmin, 42°C 60min,進(jìn)入PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系IOOiiL:在PCR反應(yīng)管中分別加入cDNAlOiiL，上、下游引物各3u L(20pmol/u L), 10XLA PCR BufferlOu L, dNTPs (2. 5mmol/L) 10 y L, MgCl2 (25mmol/L) 8 u L, LA Taq DNA聚合酶0. 5 y L (5U/ u L)，滅菌超純水加至100 u L,置于PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先95°C預(yù)變性2min，然后進(jìn)行以94°C 30s，55°C 60s (HA，PB1，M，NP這4個(gè)基因的退火溫度為55°C , PB2, NS, PA, NA的退火溫度為52°C)，72°C 180s的PCR循環(huán)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后于72°C延伸lOmin。
2. 48個(gè)基因片段的cDNA克隆、鑒定和測(cè)序RT_PCR產(chǎn)物電泳經(jīng)凝膠回收后，按PMD18-T載體說明書進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定；鑒定為陽(yáng)性克隆后送英駿生物有限公司測(cè)序。其具體實(shí)施步驟如下2. 4.1RT-PCR 產(chǎn)物電泳取RT-PCR產(chǎn)物加IOXloading buffer,在1%瓊脂糖凝膠(含0. lug/ml的溴化乙錠)中，以TAE緩沖液(0. 04M Tris-acetate, ImMEDTA)電泳0. 5hr，電泳結(jié)束后，在紫外線下觀察。2. 4. 2RT-PCR 產(chǎn)物回收 I)將目的片段切下；2)先凍融，再搗碎；3)加 500ul 平衡酚混勻，置 _20°C，60min ；4)取出后立即離心，5000gX5min ;5)小心地將水相轉(zhuǎn)移至另一 EP管中；6)在原EP管內(nèi)加200ulTE (PH8. 0),充分混勻。必要時(shí)可用玻棒再次搗碎，置-20°C,30min ；7)離心，500gX5min，將水相轉(zhuǎn)移并合并至含有上次水相的EP管中；8)加等體積酚、氯仿異戊醇各抽提一次；9)在轉(zhuǎn)移出的水相中加1/10體積3mol乙酸鈉(PH5. 2)和2. 5倍體積的無(wú)水乙醇置-20 0C 30min ；10)離心，12000gX15min。棄上清，70%乙醇洗滌一次，真空干燥；11)沉淀用7ul TE緩沖液(PH8. 0)溶解，_20°C保存?zhèn)溆茫簧鲜霾僮饕部赏ㄟ^相關(guān)公司生產(chǎn)的膠回收試劑盒進(jìn)行回收。2. 4. 3回收的產(chǎn)物與PMD18-T載體的連接SolutionI 5ul;pMD18_T Vector 0. 5ul;PCR Product: 4. 5ul;4°C 連接 12h_24h。2. 4. 4感受態(tài)細(xì)胞的制備I)劃平板，盡量形成單一菌落，使性質(zhì)均一(一定要熟悉E. coli的顏色、大小、亮度，什么時(shí)候最好)，37°C過夜，16h。選擇分散、單個(gè)菌落，一般8h可見菌落，16h差不多；2)挑取單個(gè)菌落，接種到3-5mlLB培養(yǎng)過夜(37°C振搖，200_300rpm)；3)取 Iml 菌液到 LB 中，37°C，2-4h，200-300rpm 振蕩培養(yǎng)至 OD55tl=O. 3-0. 5，此時(shí)正好是E. coli對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期，生命力最好；4)放入冰水中，停止增殖，保持該狀態(tài)10-15min ；5)離心，棄上清，留沉淀于冰浴中(4°C，4000gX10min)；6) 0.1MCaCI2 (4°C預(yù)冷)，體積多一些沒關(guān)系，作用20_30min，時(shí)間可以長(zhǎng)一些；7 ) 4°C，4000gX IOmin 離心，去 CaCI2 ；8)加CaCI2，量只有上一次的1/5到1/10 ；
9)分裝 200ul 于 EP 管中。置4°C冰箱，12-24h即可用于轉(zhuǎn)化。2. 4. 5細(xì)菌的轉(zhuǎn)化I)無(wú)菌操作取一定量的感受態(tài)細(xì)胞(200ul)置冰?。?)加入需1. 4. 3制備的連接物10ul，輕輕手腕旋轉(zhuǎn)或吹打以充分混勻；3)取出置42°C熱休克90S，不要搖動(dòng)，立刻冰浴l-2min;4)每管加預(yù)熱的LB800ul, 37°C振搖45min_lh ,以復(fù)蘇抗性；5)稍離心一下,棄去部分上清,剩200ul左右全部涂板,帶有Amp抗性的平板；待液體被吸收后，置37°C培養(yǎng)12-18hr ；6)觀察見有數(shù)個(gè)單、小菌落，繼續(xù)培養(yǎng)，挑選單菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中2. 4. 6重組質(zhì)粒的提取及酶切鑒定I)從搖床中取出上述培養(yǎng)物，取1.5ml于EP管中，l，2000rpm，lmin ;2)棄上清，加預(yù)冷的溶液I lOOul，用槍吹起菌體；3)加新鮮配制溶液II200ul，通過手腕混勻；4)加預(yù)冷溶液 III150ul,倒轉(zhuǎn)混勻，12000rpm, 5min ；5)上清移于另一 EP管中，加等體積酹/氯仿，混勻，12000rpm, 5min ；6)上清移于另一 EP管中，并加2倍體積冷無(wú)水乙醇-20°C沉淀一段時(shí)間，12000rpm，5min ；7)棄上清，加lml70%乙醇洗滌沉淀，棄去，完全干燥沉淀，并用20ul TE (ph8. 0，含20ug/mlRNase)重懸沉淀。用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定。發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性克隆的送英駿公司測(cè)序(具體見序列表)。實(shí)施例3HA基因氨基酸序列分析推導(dǎo)的氨基酸序列分析表明，三種基因型毒株均含有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)(Asn-X-Ser/Thr, X為除Pro以外的任意氨基酸)，其中5個(gè)位于HAl部分(29aa 31aa、141aa 143aa、218aa 220aa、298aa 300aa、305aa 307aa),2 個(gè)位于 HA2 部分(492aa 494aa、551aa 553aa)。裂解位點(diǎn)序列分析發(fā)現(xiàn)，所有毒株均為RSSR丨GLFJf禽類為低致病力。構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸(109aa、161aa、163aa、191aa、202aa、203aa)除198位氨基酸變化較大外，其它位點(diǎn)在所有毒株中都是相當(dāng)保守的。此外本研究表明Ck/SH/Y1/06在HA基因226位點(diǎn)為Gln，證明為人類非易感性的H9亞型AIV，而其余2個(gè)毒株在該位點(diǎn)為L(zhǎng)eu,表明有向人類感染的嗜性(如表I所示)。表IHA基因幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的比較
權(quán)利要求
1.一種分離的禽流感病毒，其基因組由SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO :11、 SEQ ID NO 12,SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO : 14、SEQ ID N0:15 和 SEQ ID N0:16 所示的 RNA 片段組成。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分離的禽流感病毒，其保藏號(hào)為CGMCCN0:3118。
3.一種用于檢測(cè)權(quán)利要求1或2所述的分離的禽流感病毒的試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求1或2所述的分離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和含有引物的PCR 反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液中的引物為HA 基因上游引物 P1: 5 ’ -CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3 ’ ，下游引物 P2: 5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’ ；M 基因上游引物 Pl :5’ -AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’，下游引物 P2: 5’ - CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’ ；NA 基因上游引物 Pl :5’ - AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’，下游引物 P2: 5’ - AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’ ；NP 基因上游引物 Pl :5’ - ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’，下游引物 P2: 5’ - GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’ ；NS 基因上游引物 Pl :5’ - ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’，下游引物 P2: 5’ - GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’ ；PA 基因上游引物 Pl :5’ - AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’，下游引物 P2: 5’ - ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’ ；PBl 基因上游引物 Pl :5’ - AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’，下游引物 P2: 5’ - AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’ ；PB2 基因上游引物 Pl :5’ - GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，下游引物 P2: 5’ - AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。
4.一種用于預(yù)防權(quán)利要求1或2所述的禽流感病毒的疫苗，其特征在于含有滅活的權(quán)利要求1或2所述的禽流感病毒。
5.權(quán)利要求4所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟a)，一個(gè)疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定的步驟，將權(quán)利要求1或2所述的禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)在109_6-109 8ELD50，HA價(jià)在1:256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個(gè)抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗(yàn)合格后作為制備抗原液；C)，一個(gè)制備油相佐劑的步驟； d), 一個(gè)制備疫苗水相的步驟；e), 一個(gè)配制疫苗的步驟，將油相與水相預(yù)混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內(nèi)乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。
6.如權(quán)利要求5所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。
7.如權(quán)利要求5所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗原液中，吐溫-80的終濃度在2% - 5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。
8.一種抗體，抗權(quán)利要求1或2所述的一種分離的禽流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及分離的禽流感病毒新毒株，本發(fā)明公開了一種H9N2禽流感病毒。本發(fā)明還公開了一種檢測(cè)H9N2禽流感病毒的試劑盒，以及一種用于預(yù)防的H9N2禽流感病毒的疫苗，以及抗H9N2禽流感病毒的抗體。通過本發(fā)明的試劑盒，可以迅速的檢測(cè)或者排除是否是由本發(fā)明的這種基因型的H9N2禽流感病毒所致的禽流感，從而盡快的控制禽流感疫情。同時(shí)，接種本發(fā)明的疫苗，可以預(yù)防本發(fā)明的這種基因型的H9N2禽流感病毒的感染。并且本發(fā)明還可以為禽流感病毒監(jiān)測(cè)系統(tǒng)提供生物信息。
文檔編號(hào)C12N7/00GK103013929SQ201210537639
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者劉佩紅, 周錦萍, 葛菲菲, 劉健, 張維誼, 鞠厚斌, 李凱航 申請(qǐng)人:上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心