專利名稱：一種h9n2禽流感病毒及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及三種H9N2禽流感病毒的新毒株及用于檢測、預防禽流感病毒的試劑盒和疫苗。
背景技術：
禽流感(Avian influenza, Al)是由A型流感病毒引 起的一種嚴重危害禽類健康的傳染性疾病。禽類感染禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)后，癥狀可表現為非顯性感染、亞臨診感染，或輕度呼吸道疾病、產蛋量降低直至急性全身致死性疾病等多種形式。根據AIV對易感雞致病性的差異，可將AIV分為高致病性AIV和低致病性AIV。高致病性AIV(HPAIV)感染禽類所導致的禽流感對養(yǎng)禽業(yè)具有毀滅性的打擊，故被國際獸疫局規(guī)定為A類疾?。欢恍┑椭虏⌒訟IV,如H9AIV的感染雖然對感染禽的致死率低，但可引起產蛋量的減少和淘汰率的上升，并造成免疫抑制，引起其他疫病的發(fā)生或混合感染，對養(yǎng)禽業(yè)造成的經濟損失也相當可觀。因此，Al —直是威脅世界養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，世界各國都十分重視對AIV的研究工作。已有研究表明來自于禽類的H9N2禽流感病毒能偶爾從禽類傳染給哺乳動物，包括人和豬。Ck/Be1-like和Gl-1ike H9N2禽流感病毒在1990底首次從人和豬中分離到。2003年分離到的人H9N2禽流感病毒是一個新的重組體，很可能來源于當地的活禽市場。這種跨種間傳播表明目前的H9N2禽流感病毒對人仍有潛在的感染性。AIV存在著廣泛的抗原漂移和抗原轉變現象，其抗原變異頻率很高。因此測定AIV的全基因序列，對于研究禽流感病毒的檢測、分布、流行規(guī)律以及控制禽流感的流行、蔓延均具有重要的意義。本研究分離鑒定了 2002-2008年上海地區(qū)活禽市場的H9N2亞型禽流感病毒，經全基因序列測定分為三種基因型，對這三種基因型毒株的8個基因片段進行關鍵位點的分析以及基因進化關系分析，表明這三種基因型與目前報道的基因型存在差異，為H9N2禽流感病毒Ck/Bei系中的三種新的基因型，分別命名為Yl，Y2, Ti。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了三種H9N2禽流感病毒及用于檢測、預防禽流感病毒的試劑盒和疫苗，所述的這三種H9N2禽流感病毒及用于檢測、預防禽流感病毒的試劑盒和疫苗要解決現有技術中無法確認和預防新的禽流感病毒從而導致新的禽流感疫情在禽類或者人類傳播的技術問題。本發(fā)明提供了一種分離的禽流感病毒(Y1)，其基因組由SEQ ID NO=USEQ ID NO2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQID NO 8所示的RNA片段組成。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒，其保藏號為CGMCC NO :3117。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測上述的分離的禽流感病毒的試劑盒，含有上述的分離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉錄反應液和含有引物的PCR反應液，所述的PCR反應液中的引物為HA 基因上游引物 P1:5 ’ -CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3 ’，下游引物P2:5 ’ -GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3 ’ ；M 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3 ’，下游引物P2:5’ -CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’ ；NA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGCAGGAGTGAAAA TGAATCCA-3 ’，下游引物P2:5 ’ -AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3 ’ ；NP 基因上游引物 P1: 5 ’ -ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3 ’，下游引物P2:5，-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3，；NS 基因上游引物 P1: 5 ’ -ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3 ’，下游引物P2:5 ’ -GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，；PA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3 ’，下游引物P2:5 ’ -ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3 ’ ；PB I 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3 ’，下游引物P2:5’ -AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’ ；PB2 基因上游引物 Pl :5’ 一GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，下游引物P2:5 ’ -AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3 ’。本發(fā)明還提供了一種用于預防上述的禽流感病毒的疫苗，含有滅活的上述的分離的禽流感病毒。本發(fā)明還提供了一種用于預防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其包括如下步驟a)，一個疫苗抗原液制備及毒價測定的步驟，將上述的禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測定其毒價在109. 6-109. 8ELD50, HA價在I =256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗合格后作為制備抗原液；c)，一個制備油相佐劑的步驟；d)，一個制備疫苗水相的步驟；e)，一個配制疫苗的步驟，將油相與水相預混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。進一步的，所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。進一步的，在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經高溫滅菌后，加入到己滅活抗原液中，吐溫-80的終濃度在2% - 5%之間，經充分溶解混合即為水相。本發(fā)明還提供了一種抗體，抗上述的一種分離的禽流感病毒(Yl)。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒(Y2)，其基因組由SEQ ID NO :9、SEQ IDNO 10,SEQ ID NO 1USEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO : 14、SEQ ID N0:15 和 SEQID NO 16所示的RNA片段組成。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒，其保藏號為CGMCC NO :3118。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測上述的分離的禽流感病毒的試劑盒，含有上述的分離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉錄反應液和含有引物的PCR反應液，所述的PCR反應液中的引物為HA 基因上游引物 P1:5 ’ -CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3 ’，下游引物P2:5 ’ -GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3 ’ ；M 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3 ’，下游引物P2:5，-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3 ’ ；NA 基因上游引物 P1: 5，-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3 ’，
下游引物 P2:5 ’ -AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3 ’ ；NP 基因上游引物 P1: 5 ’ -ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3 ’，下游引物P2:5 ’ -GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3 ’ ；NS 基因上游引物 P1: 5 ’ -ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3 ’，下游引物P2:5，-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，；PA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3 ’，下游引物P2:5 ’ -ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3 ’ ；PB I 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3 ’，下游引物P2:5，-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3 ’ ；PB2 基因上游引物 P1: 5 ’ -GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3 ’，下游引物 P2:5 ’ -AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3，。本發(fā)明還提供了一種用于預防上述的禽流感病毒的疫苗，含有滅活的上述的禽流
感病毒。本發(fā)明還提供了上述的用于預防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其包括如下步驟a)，一個疫苗抗原液制備及毒價測定的步驟，將上述的禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測定其毒價在109 6-109 8ELD50，HA價在1:256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆茫籦 ), —個抗原液滅活的步驟,將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗合格后作為制備抗原液；c)，一個制備油相佐劑的步驟；d)，一個制備疫苗水相的步驟；e)，一個配制疫苗的步驟，將油相與水相預混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。進一步的，所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。進一步的，在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經高溫滅菌后，加入到己滅活抗原液中，吐溫-80的終濃度在2% - 5%之間，經充分溶解混合即為水相。本發(fā)明還提供了一種抗體，抗上述的一種分離的禽流感病毒(Y2 )。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒(Y3)，其基因組由SEQ ID NO 17, SEQIDNO 18,SEQ ID NO 19,SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 2U SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23和SEQ ID NO 24所示的RNA片段組成。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒，其保藏號為CGMCC NO :3119。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測上述的分離的禽流感病毒的試劑盒，含有上述的分離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉錄反應液和含有引物的PCR反應液，所述的PCR反應液中的引物為HA 基因上游引物 P1:5 ’ -CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3 ’，下游引物P2:5，-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3 ’ ；M 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3 ’，下游引物P2:5’ -CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’ ；NA 基因上游引物 P1: 5，-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3 ’，
下游引物P2:5，-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3 ’ ；NP 基因上游引物 P1: 5 ’ -ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3 ’，下游引物P2:5’ -GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’ ；NS 基因上游引物 P1: 5 ’ -ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3 ’，下游引物P2:5，-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，；PA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3 ’，下游引物P2:5，-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3 ’ ；PB I 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3 ’，下游引物P2:5，-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’ ；PB2 基因上游引物 P1: 5 ’ -GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3 ’，下游引物P2:5，-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3 ’。本發(fā)明還提供了一種用于預防上述的禽流感病毒的疫苗，含有滅活的上述的禽流
感病毒。本發(fā)明還提供了上述的用于預防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其包括如下步驟a)，一個疫苗抗原液制備及毒價測定的步驟，將上述的禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測定其毒價在109 6-109 8ELD50，HA價在1:256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗合格后作為制備抗原液；c)，一個制備油相佐劑的步驟；d)，一個制備疫苗水相的步驟；e)，一個配制疫苗的步驟，將油相與水相預混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。進一步的，所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。進一步的，在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經高溫滅菌后，加入到己滅活抗原液中，吐溫-80的終濃度在2% - 5%之間，經充分溶解混合即為水相。本發(fā)明還提供了一種抗體，抗權利要求1所述的一種分離的禽流感病毒(Y3)。本發(fā)明借助MEGA3.1分析軟件，對這三種基因型H9N2禽流感病毒的8個基因片段分別進行了系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制和分析。這三種基因型毒株屬于Ck/Bei系，均為四重重組體，并且這三種基因型與目前報道的Ck/Bei系中的基因型不同，因此為RT-PCR檢測這三種新基因型8個基因片段提供了模板序列。通過本發(fā)明的試劑盒，可以迅速的檢測或者排除是否是新的禽流感由本發(fā)明的三種基因型的H9N2禽流感病毒所致，從而盡快的控制禽流感疫情。同時，接種本發(fā)明的疫苗，可以預防本發(fā)明的三種基因型的H9N2禽流感病毒的感染。使用本發(fā)明的抗體，可以治療本發(fā)明的三種基因型的H9N2禽流感病毒的感染。本發(fā)明對分離的三種H9N2禽流感病毒進行了保藏。第一種分離的H9N2禽流感病毒的分類命名為甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，該病毒保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(C GMC C)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2009年6月12號，保藏號為CGMCC N0:3117。第二種分離的H9N2禽流感病毒的分類命名為甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，該病毒保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(C GMC C)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2009年6月12號，保藏號為CGMCCNO: 3118。第三種分離的H9N2禽流感病毒的分類命名為甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，該病毒保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(C G M C C )中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2009年6月12號，保藏號為CGMCCN0:3119。本發(fā)明還可以對禽流感病毒監(jiān)測系統(tǒng)提供生物信息。對這三種基因型病毒關鍵位點的分析能提供這三種基因型是否有向人類感染的威脅以及8個片段重排的規(guī)律，尤其是有無H5片段的存在等，提供是否有向高致病性禽流感轉變的可能性，并為我國H9N2禽流感病毒種子庫提供儲備，并為病毒的追蹤溯源提供序列信息。


圖1是H9N2禽流感病毒中HA基因片段的進化關系圖。圖2是H9N2禽流感病毒中NA基因片段的進化關系圖。圖3是H9N2禽流感病毒中PB2基因片段的進化關系圖。圖4是H9N2禽流感病毒中PBl基因片段的進化關系圖。圖5是H9N2禽流感病毒中PA基因片段的進化關系圖。圖6是H9N2禽流感病毒中M基因片段的進化關系圖。圖7是H9N2禽流感病毒中NP基因片段的進化關系圖。圖8是H9N2禽流感病毒中NS基因片段的進化關系圖。
具體實施例方式實施例1病毒的獲得于2002年至2008年從上海地區(qū)的活禽批發(fā)市場獲得商品代三黃雞，采集活禽樣品包括氣管或泄殖腔拭子，將采集樣品放在含有抗菌素的PH值7. (T7. 4的等滲磷酸鹽緩沖液(PBS)內。將鑒定為陽性樣品的棉拭子充分捻動、擰干后棄去拭子，樣品液經lOOOr/min離心lOmin，取上清液作為接種材料。取處理好的樣品以0. 2mL/胚的量經尿囊腔途徑接種9日齡 11日齡SPF雞胚，每個樣品接種5個胚，于35°C 37°C孵化箱內孵育，18h后每8h觀察雞胚死亡情況。無菌收取18h以后的死胚及96h仍存活雞胚的雞胚尿囊液，測血凝活性，通過下面的實施例對從雞胚尿囊液中的病毒進行基因測序和鑒定，是三種新的甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，對此進行了保藏，保藏號分別為CGMCC NO :3117(Ck/SH/Yl/06)、CGMCC NO :3118 (Ck/SH/Yl/07)、CGMCC NO :3119 (Ck/SH/Yl/08)。實施例2三種基因型H9N2禽流感病毒的全基因測序2.1于2002年至2008年從上海地區(qū)的活禽批發(fā)市場獲得商品代三黃雞，共分離、鑒定了三種基因型H9N2禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/Yl/06(簡寫為Ck/SH/Yl/06，基因型 Yl) ;A/Chicken/Shanghai/Yl/07(簡寫為 Ck/SH/Yl/07,基因型 Y2)；A/Chicken/Shanghai/Yl/08(簡寫為 Ck/SH/Yl/08,基因型 Y3)。病毒鑒定用的 H9亞型血清購自中國農科院哈爾濱獸醫(yī)研究所。設計用于擴增H9亞型AIV所有8個基因片段的特異引物由寶生物(大連)工程公司合成。HA 基因上游引物 P1:5 ’ -CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3 ’ ； 下游引物P2:5，-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3，。M 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3 ’。NA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3 ’ ;下游引物P2:5，-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3，。NP 基因上游引物 P1: 5 ’ -ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3，。NS 基因上游引物 P1: 5 ’ -ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3 ’。PA 基因上游引物 P1: 5 ’ -AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3 ’。PB I 基因上游引物 P1: 5 ’ -AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3，。PB2 基因上游引物 P1: 5 ’ -GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3 ’ ;下游引物P2:5 ’ -AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3 ’。2. 2將陽性樣本接種SPF雞胚，取感染雞胚尿囊液用TRIzol抽提試劑進行RNA的抽提。2. 38個基因片段RT-PCR擴增如下采用20 y L的cDNA合成體系置于0. 2mL反應管中，取溶于DEPC處理水中的AIV RNA樣品9iiL，分別加入上游引物3 y L，5倍RT-PCR緩沖液 4 ii L, dNTPs (IOmmoI/L) 2. 5 u L, RNA 酶抑制劑 0. 5 y L, AMV 反轉錄酶 2 y L,用無 RNase的超純水加至總體積為20 u L,置于PCR儀中進行cDNA合成，以30°C IOmin, 42°C 60min,進入PCR擴增。PCR反應體系IOOiiL:在PCR反應管中分別加入cDNAlOiiL，上、下游引物各3u L(20pmol/u L), 10XLA PCR BufferlOu L, dNTPs (2. 5mmol/L) 10 y L, MgCl2 (25mmol/L) 8 u L, LA Taq DNA聚合酶0. 5 y L (5U/ u L)，滅菌超純水加至100 u L,置于PCR儀中進行PCR擴增。首先95°C預變性2min，然后進行以94°C 30s，55°C 60s (HA，PB1，M，NP這4個基因的退火溫度為55°C，PB2, NS, PA, NA的退火溫度為52°C )，72°C 180s的PCR循環(huán)，進行40個循環(huán)后于72°C延伸lOmin。2.4 8個基因片段的cDNA克隆、鑒定和測序RT_PCR產物電泳經凝膠回收后，按PMD18-T載體說明書進行連接、轉化，用EcoRI和HindIII進行雙酶切鑒定；鑒定為陽性克隆后送英駿生物有限公司測序。其具體實施步驟如下2.4.1 RT-PCR 產物電泳取RT-PCR產物加IOXloading buffer,在1%瓊脂糖凝膠(含0. lug/ml的溴化乙錠)中，以TAE緩沖液(0. 04M Tris-acetate, ImMEDTA)電泳0. 5hr，電泳結束后，在紫外線下觀察。2.4.2 RT-PCR 產物回收I)將目的片段切下； 2)先凍融，再搗碎；3)加 500ul 平衡酚混勻，置 _20°C，60min ；4)取出后立即離心，5000gX5min ;5)小心地將水相轉移至另一 EP管中；6)在原EP管內加200ulTE (PH8. 0),充分混勻。必要時可用玻棒再次搗碎，置-20°C,30min ；7)離心，500gX5min，將水相轉移并合并至含有上次水相的EP管中；8)加等體積酚、氯仿異戊醇各抽提一次；9)在轉移出的水相中加1/10體積3mol乙酸鈉(PH5. 2)和2. 5倍體積的無水乙醇置-20 0C 30min ；10)離心，12000gX 15min。棄上清，70%乙醇洗滌一次，真空干燥；11)沉淀用7ul TE緩沖液(PH8. 0)溶解，_20°C保存?zhèn)溆?；上述操作也可通過相關公司生產的膠回收試劑盒進行回收。2.4.3回收的產物與PMD18-T載體的連接SolutionI 5ul;pMD18_T Vector 0. 5ul;PCR Product: 4. 5ul;4°C 連接 12h_24h。2.4.4感受態(tài)細胞的制備I)劃平板，盡量形成單一菌落，使性質均一(一定要熟悉E. coli的顏色、大小、亮度，什么時候最好)，37°C過夜，16h。選擇分散、單個菌落，一般8h可見菌落，16h差不多；2)挑取單個菌落，接種到3-5mlLB培養(yǎng)過夜(37°C振搖，200_300rpm)；3)取 Iml 菌液到 LB 中，37°C，2-4h，200-300rpm 振蕩培養(yǎng)至 OD55tl=O. 3-0. 5，此時正好是E. coli對數生長期早期，生命力最好；4)放入冰水中，停止增殖，保持該狀態(tài)10_15min ；5)離心，棄上清，留沉淀于冰浴中(4°C，4000gX10min)；6) 0.1MCaCI2 (4°C預冷)，體積多一些沒關系，作用20_30min，時間可以長一些；7 ) 4°C，4000gX IOmin 離心，去 CaCI2 ；8)加CaCI2，量只有上一次的1/5到1/10 ；9)分裝 200ul 于 EP 管中。
置4°C冰箱，12-24h即可用于轉化。2. 4. 5細菌的轉化I)無菌操作取一定量的感受態(tài)細胞(200ul)置冰??；2)加入需1. 4. 3制備的連接物10ul，輕輕手腕旋轉或吹打以充分混勻；3)取出置42°C熱休克90S，不要搖動，立刻冰浴l_2min;4)每管加預熱的LB800ul，37°C振搖45min_lh，以復蘇抗性；5)稍離心一下,棄去部分上清,剩200ul左右全部涂板,帶有Amp抗性的平板；待液體被吸收后，置37°C培養(yǎng)12-18hr ；
6)觀察見有數個單、小菌落，繼續(xù)培養(yǎng)，挑選單菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中2. 4. 6重組質粒的提取及酶切鑒定I)從搖床中取出上述培養(yǎng)物，取1.5ml于EP管中，l，2000rpm，lmin ;2)棄上清，加預冷的溶液I lOOul，用槍吹起菌體；3)加新鮮配制溶液I I200ul，通過手腕混勻；4)加預冷溶液 III150ul,倒轉混勻，12000rpm, 5min ；5)上清移于另一 EP管中，加等體積酹/氯仿，混勻，12000rpm, 5min ；6)上清移于另一 EP管中，并加2倍體積冷無水乙醇-20°C沉淀一段時間，12000rpm，5min ；7)棄上清，加lml70%乙醇洗滌沉淀，棄去，完全干燥沉淀，并用20ul TE (ph8. 0，含20ug/mlRNase)重懸沉淀。用EcoRI和HindIII進行雙酶切鑒定。發(fā)現陽性克隆的送英駿公司測序(具體見序列表)。實施例3 HA基因氨基酸序列分析推導的氨基酸序列分析表明，三種基因型毒株均含有7個潛在的糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr, X為除Pro以外的任意氨基酸)，其中5個位于HAl部分(29aa 31aa、141aa 143aa、218aa 220aa、298aa 300aa、305aa 307aa),2 個位于 HA2 部分(492aa 494aa、551aa 553aa)。裂解位點序列分析發(fā)現，所有毒株均為RSSR丨GLF，對禽類為低致病力。構成受體結合位點的氨基酸(109aa、161aa、163aa、191aa、202aa、203aa)除198位氨基酸變化較大外，其它位點在所有毒株中都是相當保守的。此外本研究表明Ck/SH/Y1/06在HA基因226位點為Gln，證明為人類非易感性的H9亞型AIV，而其余2個毒株在該位點為Leu,表明有向人類感染的嗜性(如表I所示)。表I HA基因幾個關鍵位點的比較
權利要求
1.一種分離的H9N2禽流感病毒，其基因組由SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO 18, SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO 24 所示的RNA片段組成。
2.如權利要求1所述的一種分離的H9N2禽流感病毒，其保藏號為CGMCCNO :3119。
3.一種用于檢測權利要求1或2所述的分離的H9N2禽流感病毒的試劑盒，其特征在于含有權利要求1或2所述的分離的H9N2禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉錄反應液和含有引物的PCR反應液，所述的PCR反應液中的引物為HA 基因上游引物 P1: 5 ’ -CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3 ’ ，下游引物 P2: 5’ -GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’ ；M 基因上游引物 Pl :5’ -AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’，下游引物 P2: 5’ - CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’ ；NA 基因上游引物 Pl :5’ - AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’，下游引物 P2: 5’ - AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’ ；NP 基因上游引物 Pl :5’ - ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’，下游引物 P2: 5’ - GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’ ；NS 基因上游引物 Pl :5’ - ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’，下游引物 P2: 5’ - GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’ ；PA 基因上游引物 Pl :5’ - AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’，下游引物 P2: 5’ - ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’ ；PBl 基因上游引物 Pl :5’ - AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’，下游引物 P2: 5’ - AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’ ；PB2 基因上游引物 Pl :5’ - GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，下游引物 P2: 5’ - AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。
4.一種用于預防權利要求1或2所述的H9N2禽流感病毒的疫苗，其特征在于含有滅活的權利要求1或2所述的H9N2禽流感病毒。
5.權利要求4所述的用于預防H9N2禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟a)，一個疫苗抗原液制備及毒價測定的步驟，將權利要求1或2所述的 H9N2禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測定其毒價在 109 6-109 8ELD50，HA價在1:256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗合格后作為制備抗原液；C)，一個制備油相佐劑的步驟；d),一個制備疫苗水相的步驟；e),一個配制疫苗的步驟，將油相與水相預混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。
6.如權利要求5所述的用于預防H9N2禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。
7.如權利要求5所述的用于預防H9N2禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經高溫滅菌后，加入到己滅活抗原液中，吐溫-80的終濃度在2% - 5%之間，經充分溶解混合即為水相。
8.一種抗體，抗權利要求1或2所述的一種分離的H9N2禽流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及分離的禽流感病毒新毒株，本發(fā)明公開了一種分離的H9N2禽流感病毒。本發(fā)明還公開了一種檢測H9N2禽流感病毒的試劑盒，以及一種用于預防的H9N2禽流感病毒的疫苗，以及抗H9N2禽流感病毒的抗體。通過本發(fā)明的試劑盒，可以迅速的檢測或者排除是否是由本發(fā)明的這種基因型的H9N2禽流感病毒所致的禽流感，從而盡快的控制禽流感疫情。同時，接種本發(fā)明的疫苗，可以預防本發(fā)明的這種基因型的H9N2禽流感病毒的感染。并且本發(fā)明還可以為禽流感病毒監(jiān)測系統(tǒng)提供生物信息。
文檔編號C12Q1/70GK103013928SQ20121053759
公開日2013年4月3日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權日2010年6月4日
發(fā)明者劉佩紅, 周錦萍, 葛菲菲, 劉健, 張維誼, 鞠厚斌, 李凱航 申請人:上海市動物疫病預防控制中心