一種產(chǎn)β-胡蘿卜素基因工程菌的構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)β-胡蘿卜素基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：A）構(gòu)建基因表達(dá)模塊，所述基因表達(dá)模塊包括β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子和所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子；B）將所述基因表達(dá)模塊共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中。本發(fā)明的方法具有簡(jiǎn)單快速高效的優(yōu)點(diǎn)，避免了多級(jí)的克隆，也不需要依賴(lài)酶切位點(diǎn)，多片段共同轉(zhuǎn)化，同源重組效率高，可以明顯縮短工程菌構(gòu)建時(shí)間。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種產(chǎn)β-胡蘿卜素基因工程菌的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種產(chǎn)β-胡蘿卜素基因工程菌的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]迄今為止，已報(bào)道了 600多種類(lèi)胡蘿卜素，來(lái)源細(xì)菌、藻類(lèi)、酵母和植物兼有，β_胡蘿卜素是其中之一。β_胡蘿卜素作為維生素A的前體之一，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)認(rèn)定的A類(lèi)全營(yíng)養(yǎng)食品強(qiáng)化劑，同時(shí)已被世界上52個(gè)國(guó)家和地區(qū)批準(zhǔn)使用，并被美國(guó)食品化學(xué)品添加劑典范(FCC)收載。此外，作為藥物，胡蘿卜素已被美國(guó)藥典(USP) 1990版、1995版，歐洲藥典1997版，英國(guó)藥典(BP)1998版正式收載，中國(guó)衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)也已收載本品，中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公布的第一批非處方藥目錄亦收載本品(S.J.Chem.β_胡蘿卜素國(guó)內(nèi)市場(chǎng)分析，精細(xì)與專(zhuān)用化學(xué)品，2003，8:8-9)
[0003]目前，全世界β_胡蘿卜素的需求量每年以7%~9%的速度增長(zhǎng)，美國(guó)的需求量近年以10%~15%的速度增長(zhǎng)，全世界的β-胡蘿卜素的年需求量1000t左右，在我國(guó)銷(xiāo)售量約rst (朱秀靈等.β_胡蘿卜素生理功能及提取技術(shù)的研究進(jìn)展，西華大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，1:71-76)。2000年我國(guó)β -胡蘿卜素產(chǎn)量約為10t，其中40%用于出口，國(guó)內(nèi)消費(fèi)60%，其中70%的用于食品工業(yè)，20%用于保健品，10%用于藥品生產(chǎn)，2001年約為22t，其中約75%是利用發(fā)酵法生產(chǎn)(S.J.Chem.β _胡蘿卜素國(guó)內(nèi)市場(chǎng)分析，精細(xì)與專(zhuān)用化學(xué)品，2003，8:8-9)。
[0004]β -胡蘿卜素的 分子式為C4tlH56,分子量為536.88,其有全反式、9_順式和15-順式3種結(jié)構(gòu)。目前生產(chǎn)β -胡蘿卜素的方法主要有天然物提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。羅氏公司1954年最先使用化學(xué)合成法生產(chǎn)β-胡蘿卜素，1972年BASF公司也開(kāi)始使用化學(xué)合成法生產(chǎn)，天然β_胡蘿卜素是反式和順式的混合構(gòu)型，而化學(xué)合成的則為全反式構(gòu)型，并且隨著時(shí)間的推移和研究深入，人們發(fā)現(xiàn)采用化學(xué)法合成的β_胡蘿卜素由于不能完全被人體吸收，并對(duì)人體產(chǎn)生一定程度的毒副作用，長(zhǎng)期服用還會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的病變，因此化學(xué)合成的β_胡蘿卜素在西方國(guó)家已被禁止用作食品添加劑。此外，β-胡蘿卜素可以從胡蘿卜，沙棘，番茄，馬鈴薯，枸杞和玉米等天然植物中提取，但是天然物中β_胡蘿卜素含量很低，提取工藝復(fù)雜，成本高，產(chǎn)品純度低，而且大量種植需要耗費(fèi)很多的土地資源，種植周期較長(zhǎng)。相對(duì)來(lái)講，生物發(fā)酵法生產(chǎn)β_胡蘿卜素則克服了以上兩種方法的缺點(diǎn)，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、周期短、成本低、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌中如光合細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)等，酵母如紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous),膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、紅酵母(Rhodotorula glutinis)、深紅酵母(Rhodotorula rubra)等，霉菌如三抱布拉氏霉(Blakeslea trispro),布拉克須霉(Phycomycesblakesleeanus)和卷枝毛霉(Mucorcircinel1ides)等和藻類(lèi)如杜氏藻(DunalielIa)等都可以合成并在胞內(nèi)積累類(lèi)胡蘿卜素(張闖等.不同微生物生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的研究現(xiàn)狀，2011，32(2):179-183)，總類(lèi)胡蘿卜素中均含有不同比例的β_胡蘿卜素。
[0006]杜氏藻(Dunaliella)和三孢布拉氏霉(Blakeslea trispro)的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)比較成熟，均已經(jīng)進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)，其中三孢布拉氏霉(Blakeslea trispro)培養(yǎng)5天β -胡蘿
卜素產(chǎn)量可高達(dá)80(T900mg/L，杜氏藻(Dunaliella)的發(fā)酵，β-胡蘿卜素在干菌體中的含量可高達(dá)10%。但是三孢布拉氏霉由于霉菌的生殖方式等原因，其性狀易發(fā)生衰退，藻類(lèi)養(yǎng)殖條件要求苛刻，這些不足限制了其發(fā)展，所以尋求優(yōu)良菌株變得尤為重要。
[0007]模式菌如大腸桿菌，釀酒酵母等已經(jīng)被證明是良好的基因工程菌宿主。目前，已從細(xì)菌、真菌、藻類(lèi)和植物等生物中鑒定了 150多個(gè)參與類(lèi)胡蘿卜素合成酶基因。類(lèi)胡蘿卜素均通過(guò)類(lèi)異戊二烯化合物或萜類(lèi)化合物途徑合成，人們已經(jīng)鑒定了紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)的類(lèi)胡蘿卜素合成途徑(Gil-HwanAn et al., Monocyclic carotenoid biosynthetic pathway in the yeastPhaffiarhodozyma(Xanthophyllomyces dendrorhous), 1999, 88(2):189-193 ； Jan C.Verdoes etal.， Metabolic Engineering of the Carotenoid Biosynthetic Pathway inthe YeastXanthophyllomyces dendrorhous (Phaffiar hodozyma).APPLIED ANDENVIR0NMENTALMICROBIOLOGY，2003，69 (7):3728-3738)(圖1)。
[0008]酵母的同源重組效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)菌或是其他的高等真核生物，酵母已作為一種工程菌操作平臺(tái)，在途徑工程和代謝工程領(lǐng)域被廣泛用于生物化學(xué)途徑的異源表達(dá)，同時(shí)染色體重組獲得工程菌，具有遺傳穩(wěn)定，避免外源基因丟失的優(yōu)點(diǎn)。Verwaal R等使用釀酒酵母作為宿主菌，整合型質(zhì)粒YEplacl95包含crtYB、crtl和crtE基因轉(zhuǎn)化，始產(chǎn)β -胡蘿卜素 141ug/g DCW (Verwaal Rj Wang Jj MeijnenJP et al.High-level productionof Beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae bysuccessive transformationwith carotenogenic genes from Xanthophyllomycesdendrorhous.Appl EnvironMicrobiol，2007，73:4342-4350)。Guo-1iang Yan等使用釀酒酵母作為宿主菌，整合型質(zhì)粒YIplac211包含crtYB、crtl和`crtE基因轉(zhuǎn)化，始產(chǎn)β -胡蘿卜素2.57mg/g DCW (Guo-liang Yan et al., Important Role of Catalasein the Production ofb-carotene by Recombinant Saccharomyces cerevisiae underH202 Stress, CurrMicrobiol，2011，62:1056-1061)。然而，這種β _胡蘿卜素基因工程菌構(gòu)建的方法需要依次將β-胡蘿卜素表達(dá)相關(guān)的基因整合于酵母菌染色體上，涉及多級(jí)克隆，且依賴(lài)于合適的酶切位點(diǎn)選擇，操作繁瑣，周期長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明旨在提供一種產(chǎn)β-胡蘿卜素基因工程菌的構(gòu)建方法。
[0010]本發(fā)明的產(chǎn)β-胡蘿卜素基因工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0011]Α)構(gòu)建基因表達(dá)模塊，所述基因表達(dá)模塊包括β_胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述β_胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子和所述β_胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子；
[0012]B)將所述基因表達(dá)模塊共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中。[0013]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟A)中所述基因表達(dá)模塊還包括抗性基因、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子和所述抗性基因下游的終止子。
[0014]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟A)中所述構(gòu)建基因表達(dá)模塊包括以下步驟:
[0015]Al)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述抗性基因片段、所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子片段、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子片段、所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子片段和所述抗性基因下游的終止子片段；
[0016]Α2)以所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述抗性基因片段、所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子片段、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子片段、所述β_胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子片段和所述抗性基因下游的終止子片段為模板，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增獲得基因表達(dá)模塊。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述步驟Α)中所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因?yàn)閏rtE、crtYB 和 crtL.[0018]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例,所述crtE、crtYB和crtl來(lái)源于紅發(fā)夫酵母。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述步驟A)中所述啟動(dòng)子選自ADHlp、TEFlp、TPIlp和PGKlp。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述啟動(dòng)子來(lái)源于釀酒酵母。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述步驟A)中所述終止子選自TKLlt、ADHlt、EN02t和TDH2t。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述終止子來(lái)源于釀酒酵母。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述抗性基因?yàn)閎le基因。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述抗性基因來(lái)源于pGAPZ α A。
[0025]本發(fā)明的有益效果:將外源基因片段同時(shí)轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，利用酵母自身胞內(nèi)生物質(zhì)系統(tǒng)一步將各片段組裝，并進(jìn)一步同源整合到設(shè)計(jì)的染色體位置，具有簡(jiǎn)單快速高效的優(yōu)點(diǎn)，避免了多級(jí)的克隆，也不需要依賴(lài)酶切位點(diǎn)，多片段共同轉(zhuǎn)化，同源重組效率高，f 2周即可獲得工程菌株，這種良好的酵母基因工程方法可以明顯縮短工程菌構(gòu)建時(shí)間。按照本發(fā)明的方法獲得的基因工程菌的β_胡蘿卜素的發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)到大約6mg/gDCW，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)的β-胡蘿卜素合成途徑不意圖，其中，S.c代表釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae), X.d代表紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous), BTS1, crtE 代表四異戍二烯焦憐酸合成酶，crtl 代表八青番茄紅素脫氫酶，crtYB代表八青番茄紅素合酶/番茄紅素環(huán)化酶。
[0027]圖2為各基因模塊在染色體上的整合組裝順序示意圖。
[0028]圖3為β-胡蘿卜素生產(chǎn)菌的PCR鑒定結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。[0030]實(shí)施例1、實(shí)驗(yàn)方案及引物設(shè)計(jì)
[0031]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)如下:
[0032]在釀酒酵母BY4742 (購(gòu)自 EUR0SCARF，編號(hào) Y10000，菌株信息:MAT a ；his3 Δ I ；Ieu2 Δ O ；lys2 Δ O ；ura3 Δ O)中表達(dá)來(lái)自于紅發(fā)夫酵母ATCC24202的β-胡蘿卜素合成途徑的 3 個(gè)基因 crtE (GenBank:DQ016502.1)、crtYB (GenBank:AY177204.1)和 crtl(GenBank:AY177424.1)，并同時(shí)表達(dá)ble基因(Zeocin抗性基因)作為篩選標(biāo)記，選擇酵母染色體δ位點(diǎn)作為整合位點(diǎn)，各基因模塊在染色體上的整合組裝順序如圖2所示。將各啟動(dòng)子和基因分別編號(hào)，如表1所示。
[0033]表1、各啟動(dòng)子和基因編號(hào)
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)β-胡蘿卜素基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: Α)構(gòu)建基因表達(dá)模塊，所述基因表達(dá)模塊包括β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子和所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子； B)將所述基因表達(dá)模塊共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟Α)中所述基因表達(dá)模塊還包括抗性基因、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子和所述抗性基因下游的終止子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟Α)中所述構(gòu)建基因表達(dá)模塊包括以下步驟: Al)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述抗性基因片段、所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子片段、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子片段、所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子片段和所述抗性基因下游的終止子片段； Α2)以所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述抗性基因片段、所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子片段、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子片段、所述β_胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子片段和所述抗性基因下游的終止子片段為模板，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增獲得基因表達(dá)模塊。
4.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述步驟Α)中所述β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)的基因?yàn)閏rtE、crtYB和crtl。
5.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于，所述crtE、crtYB和crtl來(lái)源于紅發(fā)夫酵`母。
6.如權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟A)中所述啟動(dòng)子選自ADHlp, TEFlp, TPIlp 和 PGKlp0
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述啟動(dòng)子來(lái)源于釀酒酵母。
8.如權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟A)中所述終止子選自TKLlt、ADHlt、EN02t 和 TDH2t。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述終止子來(lái)源于釀酒酵母。
10.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述抗性基因?yàn)閎le基因。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述抗性基因來(lái)源于PGAPZα A。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103865817SQ201210525553
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月7日
【發(fā)明者】蔣宇, 朱麗, 高書(shū)良, 羅敏玉, 戈梅, 楊晟 申請(qǐng)人:上海來(lái)益生物藥物研究開(kāi)發(fā)中心有限責(zé)任公司, 上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心