專利名稱：豬流行性腹瀉S₁蛋白融合基因及重組巨大芽孢桿菌和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗原融合基因以及含有該抗原融合基因的重組菌株，尤其涉及豬流行性腹瀉S1蛋白融合基因以及含有該融合基因的表達(dá)載體，本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有該表達(dá)載體的重組巨大芽孢桿菌菌株以及它們?cè)谥苽浞乐呜i流行性腹瀉疫苗中的應(yīng)用，屬于豬流行性腹瀉的防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬流行性腹瀉(PEDV)是由冠狀病毒引起豬的一種急性高度接觸性傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征，該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，危害嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。病毒主要通過(guò)腸道感染豬，具有明顯的腸道組織嗜性的特點(diǎn)，在抗PEDV感染免疫過(guò)程中除體液免疫和細(xì)胞免疫外，局部腸粘膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮著不可替代的作用。PEDV具有典型的冠狀病毒結(jié)構(gòu)，由4種主要結(jié)構(gòu)蛋白組成，分別為磷酸化的核衣殼蛋白(N)、膜蛋白(M)、糖基化的纖突蛋白(S)和小囊膜蛋白(E)其中S糖蛋白攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的重要結(jié)構(gòu)蛋白，因此，S蛋白對(duì)病毒感染、發(fā)揮其致病性和決定宿主細(xì)胞親嗜性方面起關(guān)鍵作用。PEDV感染具有明顯的嗜腸性，分泌型IgA抗體是保護(hù)豬體不受PEDV感染和免于發(fā)病的關(guān)鍵因素，口服免疫后，在腸液和血清中均可檢出slgA抗體，而非口服途徑接種則檢測(cè)不到slgA。仔豬可通過(guò)初乳獲得母源slgA，產(chǎn)生對(duì)流行性腹瀉的被動(dòng)免疫保護(hù)。常規(guī)的滅活疫苗和弱毒疫苗在防治這兩種疾病中起到了積極作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些問(wèn)題，如滅活疫苗免疫原性差，不能有效誘導(dǎo)slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接種后的動(dòng)物機(jī)體排散病毒、病毒毒力可能返強(qiáng)等，另外必須通過(guò)注射途徑免疫。針對(duì)豬流行性腹瀉的特點(diǎn)，采用口服免疫是較為理想的預(yù)防途徑，但是如何避免胃腸道對(duì)抗原的破壞并有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答成為關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種豬流行性腹瀉S1蛋白抗原融合基因及其編碼的蛋白；本發(fā)明的目的之二是提供含有上述豬流行性腹瀉S1蛋白抗原融合基因的表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之三提供含有上述表達(dá)載體的重組宿主菌株。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種由PEDV糖蛋白S的S1抗原位點(diǎn)與化膿鏈球菌細(xì)胞壁錨定序列(CWAm6)連接得到的融合基因，其多核苷酸序列為SEQID N0.1所示。本發(fā)明根據(jù)Genbank登錄的PEDV全基因序列AF353511，找出編碼S糖蛋白的22-505aa段序列，通過(guò)柔性的Linker ((GGGGS) 3)將PEDV的S1抗原位點(diǎn)基因和細(xì)胞壁錨定序列(CWAm6)連接起來(lái)，將該序列命名為MLS1 (SEQ ID N0.1)?？紤]到巨大芽孢桿菌密碼子的偏嗜情況，本發(fā)明為了提高異源基因在宿主菌中的表達(dá)，并保證翻譯后的氨基酸不變的情況下，對(duì)稀有密碼子蘇氨酸(ACG)、組氨酸(CAC)、精氨酸(CGG、CGA)、丙氨酸(GCG)和亮氨酸(CTC、CTG)等進(jìn)行改變。此外，在MLS1的上游和下游分別引入Bgl II酶切位點(diǎn)和SphI酶切位點(diǎn)。本發(fā)明的另一方面是提供由SEQ ID N0.1所示融合基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。。本發(fā)明的又一方面是提供含有所述豬流行性腹瀉S1蛋白融合基因的表達(dá)載體；例如，將本發(fā)明SEQ ID N0.1所示的抗原融合基因與表達(dá)載體PHIS1525進(jìn)行可操作性的連接，得到可以在巨大芽孢桿菌的外表面或其細(xì)胞壁表達(dá)融合基因的分泌表達(dá)載體。針對(duì)PEDV經(jīng)黏膜感染和slgA在抵抗疾病中具有重要作用的特點(diǎn)，本發(fā)明構(gòu)建了表達(dá)PEDV S1蛋白的重組巨大芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，作為一種口服疫苗，通過(guò)刺激腸道黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的特異性slgA，達(dá)到阻止病原感染的目的。由此，本發(fā)明的再一方面是提供一株表達(dá)豬流行性腹瀉SI蛋白融合基因的重組巨大芽孢桿菌菌株，能夠用其制備成防治豬流行性腹瀉的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本發(fā)明將SEQ ID N0.1所示的融合基因與分泌表達(dá)載體pHIS1525進(jìn)行雙酶切、連接并經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入宿主菌巨大芽孢桿菌WH320細(xì)胞，獲得含有重組質(zhì)粒的重組巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌株(WH320-PHIS1525-MLSJ ;其微生物保藏號(hào)是:CCTCC No:M2011445 ;分類命名是:巨大芽孢桿菌 WHSZO-pHISlSZS-MLSi (Bacillusmegaterium WH320-PHIS1525-MLSD ;保藏時(shí)間是2011年12月5日；保藏單位是:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址是:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。進(jìn)一步的，本發(fā)明將重組巨大芽孢桿菌菌株(WH320-PHIS1525-MLSJ用加入終濃度為0.2%木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，使融合基因在菌體表面進(jìn)行表達(dá)；免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，所表達(dá)的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發(fā)生反應(yīng)，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性，能夠用于制備成防治豬流行性腹瀉的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。間接免疫熒光檢測(cè)也證實(shí)表達(dá)蛋白存在于菌體上，誘導(dǎo)表達(dá)后的活菌體免疫突光試驗(yàn)表明，所表達(dá)的蛋白初步定位于菌體的表面，存在菌體表面的目的蛋白，為抗原物質(zhì)有效刺激免疫系統(tǒng)，提高抗體水平奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上以阻斷腸道傳染病疾病病原感染的第一道防線為目的，使用安全無(wú)毒的巨大芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，巨大芽孢桿菌不產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)毒素，不產(chǎn)胞外堿性蛋白酶，有利于所表達(dá)蛋白的穩(wěn)定積累，質(zhì)粒穩(wěn)定，可以穩(wěn)定高效地表達(dá)蛋白，比較適合工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。同時(shí)芽孢桿菌在腸道定植后，能消耗大量的游離氧，造成厭氧環(huán)境，可減少需氧菌對(duì)腸道的定植。也有利于乳酸桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌的生長(zhǎng)，致使體內(nèi)的有益菌增加而致病菌減少，保持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡。
為了檢驗(yàn)本發(fā)明重組巨大芽孢桿菌或該重組巨大芽孢桿菌所表達(dá)的融合蛋白MLSJt為防治豬傳染性胃腸炎口服疫苗的可行性，本發(fā)明將構(gòu)建的重組巨大芽孢桿菌WH320-PHIS1525-MLS! 口服免疫小鼠，不同時(shí)間測(cè)定腸道糞便中特異性抗體slgA的水平；試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組巨大芽孢桿菌ΙΗ320-ρΗΙ31525-ΜΙΑ在連續(xù)3次免疫后誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了明顯的抗PEDV-S蛋白的分泌性slgA抗體反應(yīng)。重組菌組后期采樣抗體一直上升，各時(shí)間點(diǎn)采樣抗體水平均明顯高于免疫之初及對(duì)照菌(免疫空載體轉(zhuǎn)化菌WH320-pHIS1525)組和PBS組(p〈0.05)，重組菌組38d時(shí)抗體水平達(dá)到頂峰(p〈0.05)，之后下降，至60d時(shí)抗體水平仍明顯高于對(duì)照組(P〈0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所構(gòu)建的重組巨大芽孢桿菌或所表達(dá)的融合蛋白MLS1能有效的刺激小鼠腸道免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，能將其制備成防治豬傳染性胃腸炎的口服疫苗。本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。術(shù)語(yǔ)“重組宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚 合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA(肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過(guò)產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子取代(Batzeret al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al., J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985) ;Rossolini et al.,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”為外源基因在宿主中的轉(zhuǎn)錄或/和翻譯。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。SP，針對(duì)多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述術(shù)語(yǔ)適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術(shù)語(yǔ)涵蓋任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，其包括全長(zhǎng)蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經(jīng)由共價(jià)肽鍵連接。


圖1PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果；1-3、MLS1PCR 產(chǎn)物；M、DL2000。圖2表達(dá)質(zhì)粒pHIS1525的酶切檢測(cè)；1-2、質(zhì)粒pHIS1525酶切產(chǎn)物；M、DL2000。圖3PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；1_3 =BglII和SphI雙酶切，得到的片段分別約為7500bp、1920bp ；M1:DL2000 ；M2:DL15000。圖4表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western-blot分析；M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；I:重組巨大芽孢桿菌WH320-pHIS1525誘導(dǎo)后的蛋白質(zhì)；2_4、重組巨大芽孢桿菌1320-ρΗΙ51525-ΜΙΑ$導(dǎo)后的蛋白質(zhì)；5:重組巨大芽孢桿菌WH320-PHIS1525-MIA誘導(dǎo)后的蛋白質(zhì)的免疫印跡。圖5表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光檢測(cè)(X40);A:WH320-pHIS1525-MLS1重組菌的IFA試驗(yàn)結(jié)果，菌體細(xì)胞散發(fā)了強(qiáng)烈的黃綠色熒光；B:WH320-pHIS1525重組菌的IFA試驗(yàn)結(jié)果，沒(méi)有熒光，菌體呈紅色。圖6重組巨大芽孢桿菌免疫小鼠后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠糞便特異性slgA測(cè)定結(jié)果。圖7重組巨大芽孢桿菌免疫小鼠后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠糞便特異性slgA測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1 MLS1基因巨大芽孢桿菌分泌表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定I抗原表位序列MLS1的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Genbank登錄的PEDV全基因序列AF353511，找出編碼S糖蛋白的22_505aa段序列，通過(guò)柔性的Linker ((GGGGS) 3)將PEDV的S1抗原位點(diǎn)基因和細(xì)胞壁錨定序列(CWAm6)連接起來(lái)，該序列命名為MLS1 (SEQ ID N0.1)。對(duì)稀有密碼子蘇氨酸(ACG)、組氨酸(CAC)、精氨酸(CGG、CGA)、丙氨酸(GCG)和亮氨酸(CTC、CTG)等進(jìn)行改變，但不改變其所編碼的氨基酸。在MLS1的上游和下游分別引入Bgl II酶切位點(diǎn)和SphI酶切位點(diǎn)。將設(shè)計(jì)好的MLS1序列進(jìn)行人工合成，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PMD18-MIA。pMD18-T Simple Vector 購(gòu)自 TaKaRa (大連)公司，pMDlS-MI^ 的具體構(gòu)建過(guò)程如下:PCR擴(kuò)增目的基因，在PCR反應(yīng)管中按照表I所示加入試劑和溶液。表IMLS1的PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.豬流行性腹瀉S1蛋白抗原融合基因，其特征在于:其多核苷酸序列為SEQIDN0.1所示
2.由權(quán)利要求1所述融合基因編碼的蛋白，其特征在于:其氨基酸序列為SEQIDN0.2所示。
3.含有權(quán)利要求1所述融合基因的重組表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求3所述重組表達(dá)載體的重組宿主株。
5.按照權(quán)利要求4所述的重組宿主株，其特征在于:所述的重組宿主株是重組巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)菌株，其微生物保藏號(hào)是:CCTCC No:M2011445。
6.權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉SI蛋白抗原融合基因在制備防治豬流行性腹瀉疫苗中的用途。
7.權(quán)利要求2所述的蛋白在制備防治豬流行性腹瀉疫苗中的用途。
8.權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體在制備防治豬流行性腹瀉疫苗中的用途。
9.權(quán)利要求4或5所述的重組宿主株在制備防治豬流行性腹瀉疫苗中的用途。
10.按照權(quán)利要求6-9所述的用途，其特征在于:所述的疫苗是粘膜免疫活菌疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬流行性腹瀉S1蛋白融合基因及重組巨大芽孢桿菌和應(yīng)用。本發(fā)明將豬流行性腹瀉病毒S糖蛋白的S1抗原位點(diǎn)和細(xì)胞壁錨定序列連接得到SEQ ID No.1所示的抗原融合基因。本發(fā)明進(jìn)一步的構(gòu)建了含有該抗原融合基因的分泌表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化到巨大芽孢桿菌中在其細(xì)胞壁或其表面表達(dá)重組蛋白。免疫印跡試驗(yàn)表明，所表達(dá)的重組蛋白能夠與PEDV免疫血清發(fā)生反應(yīng)，表明本發(fā)明所制備的重組蛋白與PEDV天然抗原一樣具有相同的抗原性。誘導(dǎo)表達(dá)后的活菌體免疫熒光試驗(yàn)表明，所表達(dá)的重組蛋白定位于菌體的表面。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的重組蛋白能夠用于制備成防治豬流行性腹瀉的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103194472SQ20121052365
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者張金林, 馬立保, 胡曉芬 申請(qǐng)人:武漢華揚(yáng)動(dòng)物藥業(yè)有限責(zé)任公司