專利名稱：一種基于簡易大規(guī)模pcr高效制備線性dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大規(guī)模PCR (polymerase chain reaction,聚合酶鏈式反應(yīng))低成本、高速率制備線性DNA的方法，屬于工業(yè)微生物應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
PCR (polymerase chain reaction,聚合酶鏈式反應(yīng))是 Kary B.Mullis (NobelLaureate for procedure to replicate DNA, science, 1985)首次發(fā)明的體外擴增線性DNA的技術(shù)，是現(xiàn)代分子生物學最重要的基本研究手段之一。PCR模擬于DNA的自然復制過程，它利用人工合成引物介導的DNA聚合酶促反應(yīng)，引物按照堿基配對與DNA模板互補結(jié)合以后，在DNA聚合酶的作用下，按照堿基配對的原則從引物開始合成與模板DNA互補的DNA鏈。經(jīng)變性、退火、延伸等一次循環(huán)，DNA鏈的數(shù)量增加一倍，模板在以后進行的循環(huán)，新合成的DNA可再次成為模板。如此循環(huán)一次，DNA拷貝數(shù)便增加一倍。經(jīng)多次循環(huán)，可以將目的DNA的量擴增IO6-1O7倍。PCR技術(shù)因其具有操作簡單、快速、特異性好、靈敏度高等特點而廣泛應(yīng)用于分子生物學、免疫學、醫(yī)學等領(lǐng)域。最近的研究表明，PCR方法不僅是一種分子生物學的研究手段，而且在生產(chǎn)實際中的應(yīng)用越來越廣泛，如利用PCR方法獲得線性DNA疫苗的研究方法隨著部分DNA疫苗的上市越來越受到研究者的親睞。隨著研究的深入，PCR技術(shù)日趨完善，但若將傳統(tǒng)的PCR方法應(yīng)用于生產(chǎn)實際仍存在著極大的局限性，如生產(chǎn)成本高和生產(chǎn)規(guī)模小等問題，具體可歸納為:(I) 一般情況下，常規(guī)PCR擴增都是基于造價昂貴PCR儀和售價高的DNA聚合酶，因此，若通過常規(guī)PCR模式在短時間內(nèi)獲得大量的PCR產(chǎn)物，成本極高；(2)目前的常規(guī)PCR儀有以下幾種規(guī)格:a、
0.2mLX25 孔，b、0.2mLX96 孔，c、0.2mLX384 孔，d、0.5 mLX20 孔，e、0.5mLX60 孔。其中單次PCR產(chǎn)量最大的儀器是0.2mLX 384孔`，在不計損耗的情況下進行一次PCR最多只可得到76.8mL產(chǎn)物。因此，若需要獲得大量的PCR產(chǎn)物，需要將樣品分裝，逐個收集并純化，操作繁瑣且容易污染；(3)若制備大量線性DNA，需要進行反復多次PCR操作才能獲得，周期長、效率低。目前，鑒于DNA疫苗的相繼上市以及線性DNA疫苗受到研究者親睞的原因，世界科研機構(gòu)和疫苗生產(chǎn)公司也相繼把目光集中在線性DNA的生產(chǎn)方法上。但是，他們?nèi)匀恢饕捎脗鹘y(tǒng)的PCR方式生產(chǎn)線性DNAjB Vandalia公司研發(fā)出的一種大體系PCR平臺可以達到每天12L的產(chǎn)量，但由于生產(chǎn)成本高和生產(chǎn)速率慢等原因仍然無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的需要。為此，本發(fā)明在低成本獲得性能優(yōu)異的DNA聚合酶(專利名稱:一種利用畢赤酵母高效表達DNA聚合酶的方法，專利號:ZL201010229160.5)的基礎(chǔ)上，建立了一種大規(guī)模PCR低成本、高效生產(chǎn)線性DNA的方法，為解決線性DNA疫苗工業(yè)生產(chǎn)的瓶頸問題奠定基礎(chǔ)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了改進上述常規(guī)PCR儀器設(shè)備和DNA聚合酶費用高、獲得線性DNA產(chǎn)量少、效率低等缺點，提供了一種大規(guī)模PCR技術(shù)高效、低成本大量制備線性DNA的方法，擬為進一步利用該方法高效快速制備線性DNA疫苗應(yīng)對新發(fā)傳染病奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明中大規(guī)模簡易PCR制備大量的線性DNA的具體方法，包括以下步驟:I)制備種子DNA聚合酶，簡稱RKOD用專利(ZL201010229160.5)制備菌株，接種于50mLBMGY培養(yǎng)基中，以150_250r/min的轉(zhuǎn)速在250C _30°C培養(yǎng)40-50小時，至OD600為6-10,于室溫3000-6000r/min離心5min,收集菌體。將菌體轉(zhuǎn)移至25mLBMMY培養(yǎng)基中，以150_250r/min的轉(zhuǎn)速在25°C -30°C培養(yǎng)，每隔24小時補加一次甲醇(每次加培養(yǎng)基體積的0.5%), 72小時收集上清，即為下步所需的DNA聚合酶；該聚合酶具有5’ 一3’和3’ 一5’核酸外切酶活性，其錯配率為1.1 X 10_6，具有每分鐘延伸3kbp、耐高溫特性；所述的LBMMY培養(yǎng)基配方:2%Trypto ne，l%YeastExtract, 0.34%YNB, 1%(NH4)2S04,lOOmmol/L磷酸鉀緩沖液，pH6.0,1%甘油；2)設(shè)計正反引物根據(jù)待擴增目的靶基因序列(實例中分別是流感病毒HINl的HA基因和豬鏈球菌的sao基因，已構(gòu)建到pcDNA3.1 (+)載體中)利用Genetool分析軟件按照堿基互補配對的原則設(shè)計獲得目的基因兩端20-50nt的正反向引物序列，并用化學方法合成；3)配制反應(yīng)體系按照大小不同配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系具體成分按下表選擇表1:大規(guī)模PCR反應(yīng)體系具體成分
總體系50 μ L 5mL 2OmL 6OmL 120mL
IOXBuffer5 μ L 500 μ L 2mL 6mL 12mL
dNTPs (2.5mM)4μ L 400 μ L1.6mL 4.8mL 9.6mL
Primer F(IOuM) IuL 100 μ L 0.4mL1.2mL 2.4mL Primer R(IOuM) IuL 100 μ L 0.4mL1.2mL 2.4mL 質(zhì)粒模板0.05 Ug 5 μ g 20 μ g 60 μ g 120 μ g
H2O39 μ L 3.9mL 15.6mL 46.8mL 93.6mL
RKOD 酶0.5U 50U 200U 600U 1200U選擇確定具體反應(yīng)體系后，在聚乙烯封口袋中依次加入H20、PCR buffer、dNTPs、正反引物、質(zhì)粒模板和DNA聚合酶等體系成分，然后用封口器將封口袋制備成一個簡易的密閉容器；混勻PCR反應(yīng)混合物，各成分的最終濃度分別為:dNTPs的濃度為0.2mM、正、反引物的濃度為0.2 μ Μ、質(zhì)粒模板的濃度I μ g/mL、包含2mM Mg2+的I X反應(yīng)buffer反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶10U/mL ;反應(yīng)體系的規(guī)模是按5mL、20 mL、60 mL、120 mL依次遞增進行的，或者更多；4)水浴 PCR事先調(diào)制好98°C和72°C兩個恒溫水浴鍋，然后將裝有PCR反應(yīng)混合物的密閉聚乙烯封口袋順次置于a) 98°C水浴0.5min，b ) 72°C水浴lmin，c)將步驟a)和b)依次進行40 45個循環(huán)，收集PCR產(chǎn)物；5)檢測PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，線性DNA的濃度可達300 μ g/mL。本發(fā)明的大規(guī)模PCR體系與常規(guī)PCR體系相同，包括DNA高溫聚合酶、質(zhì)粒模板、dNTPs、正反向寡聚核苷酸引物、包含2mM Mg2+的反應(yīng)緩沖液。本發(fā)明與普通的PCR方式相比具有的優(yōu)勢:一、本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系中所用的DNA聚合酶為利用專利ZL201010229160.5制
備的性能優(yōu)異DNA聚合酶，確保了該方法生產(chǎn)成本低，同時該方法具備生產(chǎn)規(guī)模大、生產(chǎn)工藝簡單的特點，為進一步大規(guī)模PCR方法的建立提供了有力的技術(shù)保障。使用普通PCR方法制備的線性DNA聚合酶，產(chǎn)量低、成本高、工藝繁瑣。二、本發(fā)明提出的利用聚丙烯材料制備的封口袋作為PCR反應(yīng)容器，同時只需兩臺恒溫水浴鍋，避免了普通PCR所需的儀器費用高、存放空間大、收集困難、容易污染等一系列的問題。三、本發(fā)明中提出的簡易的兩步循環(huán)法PCR(只需98°C和72°C兩個步驟進行循環(huán))，可直接用于線性DNA現(xiàn)場制備，攜帶方便。`四、本發(fā)明提出的大規(guī)模PCR制備線性DNA的方法，便于進行規(guī)?；⒐I(yè)化生產(chǎn)，如該方法可為針對新發(fā)傳染病快速大規(guī)模制備線性DNA疫苗奠定堅實的基礎(chǔ)。


:圖1為5mL體系PCR擴增豬鏈球菌表面膜蛋白(SA0)編碼基因產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M:A-EcoT14 I digest DNA Marker,上樣體積為2 μ L ;泳道1-5:上樣體積依次為2 μ L，4 μ L，6 μ L，8 μ L，10 μ L ;泳道6:常規(guī)PCR產(chǎn)物，上樣體積為4 μ L。圖2為5mL大量擴增HA基因盒式表達單元DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。M: λ -EcoT14 I digest DNA Marker,上樣體積為 2 μ L ;泳道 1-5:上樣體積依次為2 μ L，4 μ L，6 μ L，8 μ L，10 μ L ;泳道6:常規(guī)PCR產(chǎn)物，上樣體積為4 μ L。圖3為20mL大量擴增HA基因盒式表達單元DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。M: λ -EcoT14 I digest DNA Marker,上樣體積為 2 μ L ;泳道 1-5:上樣體積依次為2 μ L，4 μ L，6 μ L，8 μ L，10 μ L ;泳道6_7:常規(guī)PCR產(chǎn)物，上樣體積依次為2 μ L，4 μ L ;泳道8為LA Taq酶擴增的PCR產(chǎn)物，上樣體積為2 μ L。圖4為60mL大量擴增HA基因盒式表達單元DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。M: λ -EcoT14 I digest DNA Marker,上樣體積為 2 μ L ;泳道 1-5:上樣體積依次為2 μ L，4 μ L，6 μ L，8 μ L，10 μ L ;泳道6:常規(guī)PCR產(chǎn)物，上樣體積為4 μ L。圖5為120mL大量擴增HA基因盒式表達單元DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。M: λ -EcoT14 I digest DNA Marker,上樣體積為 2 μ L ;泳道 1-5:上樣體積依次為2 μ L，4 μ L，6 μ L，8 μ L，10 μ L ;泳道6:常規(guī)PCR產(chǎn)物，上樣體積為4 μ L。
具體實施例方式實施例1、大量擴增豬鏈球菌表面膜蛋白編碼基因(sao)線性DNAsao 基因序列為:atgcaaccagatggcggtcaagctacttctaaggctgtgaacgtcaaaattccagccgttgttagattatttggcagagaattgttggaaaacgaatttaagttcgaattgagagaagctaacggtgaagaattgccagttttggatactgctcaaaacactaaggaaggtcaggttcgtttcaagaacttgtcttttgataagccaggaaagtactggtacactatttcagaagtgaaggatgaattgggtggtatagaatacgattctaagtacattgttgccaaaattacggtagaggataggaacggtcaattgcaagctatgattgagtttattgacaacgataacgtatttaacaacttttacactccagccccagctgctgcctctttgtctattaagaaggtcttggaaggtagaactttgaacactggtgagtttgaatttgttttaaagaacgagaagggtgatgaaattgaaaaggtctctaaccaagctgatggttctgttaacttttctgccttgactttcacaaaagagggtacctacacttacactgtttctgaagttgacggtggtttgggagatatcatttacgataagtctgatattaaggctactgtcacagtaaaggataacaaccatggacaattggtttctactgttacctacgaaaactcagaccagatttttgaaaacattttgaacccaggtaagttgattgctccaactactgattcagtaatcacggacaacgaagttagtaaggaggctatgtaa采用本發(fā)明中的方法，將該基因線性DNA進行大量擴增，包括以下步驟:a、利用專利ZL201010229160.5制備菌株，接種于50mLBMGY培養(yǎng)基中，制備耐高溫特性的DNA聚合酶RKOD ；b、根據(jù)豬鏈球菌表面膜蛋白編碼基因(sao)DNA特異性序列，利用Genetool分析軟件設(shè)計合成一對PCR引物，兩條引物的長度分別為28、42個堿基；正反向寡核苷酸引物分別為:SAO-F: 5， atgcaaccagatggcggtcaagctactt 3，

SAO-R: 5’ ttacatagcctccttactaacttcgttgtccgtgattactga 3’C、按5mLPCR體系選擇PCR中各原料的成分進行加樣，反應(yīng)液裝入聚乙烯封口袋中。各成分的終濃度為:0.2mM dNTPs.0.2μΜ正反向寡核苷酸引物、I μ g/mL質(zhì)粒模板、I X反應(yīng)緩沖液(包含2mM Mg2+)、RKOD DNA高溫聚合酶10U/mL ；d、將裝有反應(yīng)液的聚乙烯封口袋，首先置于98°C水浴0.5min，72°C水浴lmin，然后依次循環(huán)進行40次；e、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，線性DNA的濃度可達到300 μ g/mL (圖1)。實施例2、大體系擴增流感病毒HlNl HA蛋白編碼基因的DNAHA 基因序列為:atgaaggcaaacctactggtcctgttatgtgcacttgcagctgcagatgcagacacaatatgtataggctaccatgcgaacaattcaaccgacactgttgacacagtactagagaagaatgtgacagtgacacactctgttaacctgctcgaagacagccacaacggaaaactatgtagattaaaaggaataaccccactacaattggggaattgtaacatcgccggatggctcttgggaaacccagaatgcgacccactgcttccagtgagatcatggtcctacattgtagaaacaccaaactctgagaatggaatatgttatccaggagatttcatcgactatgaagaactgagggagcaattgagetcagtgtcatcattcgaaagattcgaaatatttcccaaagaaagctcatggcccaaccacaacacaaacaaaggagtaacggcagcatgctcccatgcggggaaaagcagtttttacagaaatttgctatggctgacggagaaggagggctcatacccaaagctgaaaaattcttatgtgaacaagaaagggaaggaagtccttgtactgtggggtattcatcacccgtctaacagtaaggaacaacagaatctctatcagaatgaaaatgcttatgtctctgtagtgacttcaaattataacaggagatttaccccggaaatagcagaaagacccaaagtaagagatcaagctgggaggatgaactattactggaccttgctaaaacccggagacacaataatatttgaggcaaatggaaatctaatagcaccaaggtatgctttcgcactgagt
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tgcagcggatcaaaaaagcacacaaaatgccatttga采用本發(fā)明中的方法，將該基因線性DNA進行大量擴增，包括以下步驟:·
a、利用專利ZL201010229160.5制備菌株，接種于50mLBMGY培養(yǎng)基中，制備耐高溫特性的DNA聚合酶RKOD ；b、根據(jù)HA基因盒式表達單元DNA特異性序列,利用Genetool分析軟件設(shè)計合成一對PCR引物，兩條引物的長度分別為23、22個堿基；正反向寡核苷酸引物分別為:HA-F: 5， tgcttcgcgatgtacgggccaga 3，HA-R: 5’ agcccaccgcatccccagcat 3’C、按5mL、20 mL、60 mL、120 mL分別選擇PCR中各原料的成分進行加樣，反應(yīng)液裝入聚乙烯封口袋中，每個聚乙烯封口袋體積為5mL、20 mL、60 mL、120 mL。各成分的終濃度分別為:0.2mM dNTPs.0.2μΜ正反向寡核苷酸引物、I μ g/mL質(zhì)粒模板、I X反應(yīng)緩沖液(包含 2mM Mg2+)、RKOD DNA 高溫聚合酶 10U/mL ；；d、將裝有反應(yīng)液的聚乙烯封口袋，首先置于98°C水浴0.5min，72°C水浴lmin，然后依次循環(huán)進行40次；e、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，線性DNA的濃度可達到300 μ g/Ml，電泳檢測檢測結(jié)果見圖2、3、4、5。
權(quán)利要求
1.一種基于簡易大規(guī)模PCR高效制備線性DNA的方法，其特征在于制備步驟為: 1)利用專利ZL201010229160.5制備菌株，接種于50mLBMGY培養(yǎng)基中，制備耐高溫特性DNA聚合酶RKOD ； 所述的 LBMMY 培養(yǎng)基配方:2%Tryptone, l%Yeast Extract,0.34%YNB, 1% (NH4) 2S04,lOOmmol/L磷酸鉀緩沖液，pH6.0,1%甘油； 2)根據(jù)待擴增目的靶基因序列，利用Genetool分析軟件按照堿基互補配對的原則設(shè)計獲得目的基因兩端20-50nt的正反向引物序列，并用化學方法合成； 3)按下表配制大小不同反應(yīng)體系
2.按照權(quán)利要求1所述一種基于簡易大規(guī)模PCR高效制備線性DNA的方法，其特征在于制備步驟2)為:待擴增目的靶基因序列是流感病毒HINl的HA基因，利用Genetool分析軟件設(shè)計合成的正、反向寡核苷酸引物分別為:HA-F: 5’ tgcttcgcgatgtacgggccaga 3’HA-R: 5’ agcccaccgcatccccagcat 3’ 。
3.按照權(quán)利要求1所述一種基于簡易大規(guī)模PCR高效制備線性DNA的方法，其特征在于制備步驟2)為:待擴增目的靶基因序列是豬鏈球菌的基因，利用Genetool分析軟件設(shè)計合成的正、反向寡核苷酸引物分別為:SAO-F: 5’ atgcaaccagatggcggtcaagctactt 3’SAO-R: 5’ ttacatagcctccttactaacttcgttgtccgtgattactga 3’ 。
4.按照權(quán)利要求1所述一種基于簡易大規(guī)模PCR高效制備線性DNA的方法，其特征在于步驟4 )中的PCR程序是簡易的98 °C、72 °C兩個溫度循環(huán)水浴的PCR程序。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種大規(guī)模PCR快速制備線性DNA的方法，它是在中國專利(ZL201010229160.5)低成本獲得高特性DNA聚合酶RKOD的基礎(chǔ)上，利用優(yōu)化的PCR程序建立了高于常規(guī)PCR體積50-1200倍的大規(guī)模PCR方法，利用本發(fā)明獲得PCR產(chǎn)物的濃度可達300μg/mL。在該發(fā)明中，PCR體系中的dNTPs、引物和PCRbuffer參照常規(guī)PCR濃度加樣，質(zhì)粒模板的濃度為1μg/mL，DNA聚合酶的用量為10U/mL，大規(guī)模PCR步驟為(1)將反應(yīng)體系置于98℃水浴0.5min；(2)72℃水浴1min；(3)將步驟(1)(2)進行40個循環(huán)，回收PCR產(chǎn)物。利用本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)線性DNA低成本、高速率、大規(guī)模的生產(chǎn)，可為進一步低成本、高效快速制備線性DNA疫苗應(yīng)對新發(fā)傳染病奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/10GK103074328SQ20121051927
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者余曉嵐, 馬立新, 卞璐, 廖峰, 金梅林, 王飛, 趙慧, 陳全嬌 申請人:湖北大學, 北京偉嘉人生物技術(shù)有限公司