專(zhuān)利名稱：一種白僵菌as-70菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物農(nóng)藥制劑，具體的說(shuō)是一種白僵菌AS-70菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，植物病蟲(chóng)害對(duì)其抗藥性也越來(lái)越明顯，隨之也帶來(lái)了環(huán)境污染、人畜中毒與三致(致癌、致畸、致突變)等問(wèn)題。近年來(lái)，因化學(xué)農(nóng)藥殘留而導(dǎo)致的“綠色壁壘”嚴(yán)重制約著我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的出口，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)也面臨著更大的風(fēng)險(xiǎn)與挑戰(zhàn)。而與傳統(tǒng)的化學(xué)合成農(nóng)藥相比，微生物源農(nóng)藥具有對(duì)人畜和非靶標(biāo)生物安全，環(huán)境兼容性好，不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)。白僵菌(Beauveria)是一類(lèi)寄主范圍廣、致病性與適應(yīng)性很強(qiáng)的昆蟲(chóng)病原真菌，對(duì)昆蟲(chóng)致病機(jī)制獨(dú)特。應(yīng)用其防治植物病蟲(chóng)害具有對(duì)人畜無(wú)害，環(huán)境友好，無(wú)農(nóng)藥殘留等優(yōu)點(diǎn)，符合未來(lái)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種白僵菌AS-70菌株及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種白僵菌AS-70菌株，白僵菌AS-70 (Beauveria felina)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期2012年9月29日，保藏號(hào)為CGMCC6643。將所述白僵菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置或搖床發(fā)酵培養(yǎng)15-50天，發(fā)酵產(chǎn)物待用。所述發(fā)酵培養(yǎng)基比例為大米100g、蛋白胨O. 6g，天然海水100mL。白僵菌AS-70菌株的應(yīng)用，所述白僵菌經(jīng)發(fā)酵培 養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑。將所述白僵菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置或搖床發(fā)酵培養(yǎng)15-50天，發(fā)酵產(chǎn)物待用。將發(fā)酵產(chǎn)物用溶劑提取，提取物進(jìn)行柱層析分離，分離產(chǎn)物用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑。所述溶劑為石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇或水中的一種或幾種。所述發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行柱層析分離，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集石油醚-乙酸乙酯體積比5:1與2:1梯度的洗脫組分I與II用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑；以氯仿-甲醇進(jìn)行梯度洗脫進(jìn)行柱層析分離，收集氯仿-甲醇體積比50:1與20:1梯度的洗脫組分III與IV用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑。所述柱層析可采用硅膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析及大孔吸附樹(shù)脂柱層析中的一種或幾種。所述石油醚-乙酸乙酯洗脫梯度為100:1至1:1 ;氯仿-甲醇洗脫梯度為100:1至1:1。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明所述的白僵菌AS-70菌株分離自福建蘇澳島采集的苔蘚蟲(chóng)，通過(guò)測(cè)定其ITS1-5. 8S-1TS2序列，并與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株相應(yīng)序列信息比較，其與菌株Beauveria felina (Accession number :AY261369)的相似度為 99%。該菌株發(fā)酵產(chǎn)物具有較好殺蟲(chóng)活性，可用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、周期短、產(chǎn)品成本低及環(huán)境友好等特點(diǎn)，具有較好開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式為闡明對(duì)本發(fā)明特征的理解，下面結(jié)合一些非限定性的實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。本發(fā)明所述白僵菌(Beauveria felina),保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2012年9月29日，保藏號(hào)為CGMCC6643 ;保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路。實(shí)施例1 :海洋來(lái)源白僵菌(Beauveria felina) AS-70菌株分類(lèi)。I)菌種培養(yǎng)按照微生物的常規(guī)培養(yǎng)方法，挑取少量保存于瓊脂一麥芽膏培養(yǎng)基的白僵菌(Beauveria felina) AS-70，接種于PDA平板表面，28°C培養(yǎng)7天，初期菌落呈平茸狀，后期形成乳白色分生孢子梗。2)菌種初步鑒定按照文獻(xiàn)方法(J. Nat. Prod. 2006，69，1622.)，通過(guò)克隆真菌核糖體rDNA基因轉(zhuǎn)錄間隔序列(ITS1-5. 8S-1TS2全長(zhǎng)序列)、測(cè)序，并與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株相應(yīng)序列信息比較，其與菌株 Beauveria felina(Accessionnumber :AY261369)的相似度為 99%。序列信息如下CTCCTTTGTG·ACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGGTCCGTCCCGGAGCTGGCAGTGCACGGCCAGCCCCGGAACCAGACGCCCGCCGAGGACCCCAAACTCTTGTTTTTATAGTGGATCTTCTGAGTCTTATACAAAATAAATTAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTACTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGGCCCGTCCGCGGGACCTGGCGTTGGGGATCGGCTGCCCCTGGCGGCTGCCGGCCCTGAAATACAGTGGCGGTCTCTTCGCGACCTCCCCTGCGTAGTAGTGATACCTCGCAGCCGGATAGCGGAGCGGCCACGCCGTAAAACCCCCTACTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGMTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATMGCGGAGGAA。實(shí)施例2:白僵菌(Beauveria felina) AS-70菌株的發(fā)酵培養(yǎng)I)發(fā)酵培養(yǎng)菌種培養(yǎng)按照微生物的常規(guī)培養(yǎng)方法，挑取少量保存于瓊脂一麥芽膏培養(yǎng)基的白僵菌(Beauveria felina) AS-70，接種于PDA平板表面，28°C培養(yǎng)3天，作為規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的菌種，待用。切取上述PDA平板表面的菌種適量，接種至已滅菌的、盛有大米培養(yǎng)基的錐形瓶中，室溫靜置培養(yǎng)30天后采用乙酸乙酯滅菌，待用。所述大米培養(yǎng)基為大米IOOg/瓶，蛋白胨O. 6g/瓶，天然海水IOOmL/瓶。2)發(fā)酵產(chǎn)物分離與純化將上述白僵菌經(jīng)大米培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)物用乙酸乙酯超聲提取3次，合并提取液，減壓蒸餾得浸膏。按照洗脫液極性遞增順序，分別以石油醚-乙酸乙酯(體積比100:1至1:1)和氯仿-甲醇(體積比100:1至1:1)為梯度洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析分離。分別收集以石油醚-乙酸乙酯為洗脫液的體積比5:1與2:1梯度的洗脫組分I與II，用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑；收集以氯仿-甲醇為洗脫液的體積比50:1與20:1梯度的洗脫組分III與IV，用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑。
實(shí)施例3 :殺蟲(chóng)活性試驗(yàn)鹵蟲(chóng)(brine shrimp)也稱鹽水豐年蟲(chóng),分類(lèi)上屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)，甲殼綱,無(wú)甲目，鹽水豐年蟲(chóng)科，鹵蟲(chóng)屬。鹵蟲(chóng)作為一種殺蟲(chóng)劑篩選模型，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道，王再?gòu)?qiáng)等[農(nóng)藥，2011，50 (4) :261 - 263]以鹵蟲(chóng)作為模型生物評(píng)價(jià)了 14種常見(jiàn)殺蟲(chóng)劑的殺蟲(chóng)活性，結(jié)果表明用鹵蟲(chóng)篩選具有殺蟲(chóng)活性的化合物，方法簡(jiǎn)便，且對(duì)多種不同作用機(jī)制的殺蟲(chóng)劑敏感；胡志鈺等[海洋通報(bào)，2000，19(4):36-41]以鹵蟲(chóng)作為指示生物，快速篩選海洋放線菌中具有殺蟲(chóng)活性的化合物；Blizzard Τ. Α.等[J. Antibiot，1989，42 (8) : 1304-1307]以鹵蟲(chóng)快速篩選殺蟲(chóng)劑阿維菌素的類(lèi)似物。總之，鹵蟲(chóng)作為殺蟲(chóng)活性測(cè)定的模型生物具有來(lái)源廣泛、操作簡(jiǎn)單、所需化合物的量少等優(yōu)勢(shì)，可以提高篩選效率，對(duì)新農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑的研發(fā)具有重要意義。I)鹵蟲(chóng)卵的孵化取鹵蟲(chóng)卵IOOmg置于500mL燒杯中，加入人工海水400mL，用充氣泵緩緩充氣，室溫孵化24h，除去卵殼及未孵化的卵，鹵蟲(chóng)繼續(xù)培養(yǎng)24h，備用。2)樣品溶液的制備將上述實(shí)施例分離純化的發(fā)酵產(chǎn)物組分1-1V分別以DMSO溶解，配制為4mg/mL溶液，并依此稀釋至2，I與O. 5mg/mL溶液，備用。3)試驗(yàn)方法

按照Solis 改良法(Bioorg.Med. Chem. Lett. 2010，20:5677-5680)，取 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加195μ L含10-15個(gè)鹵蟲(chóng)的人工海水液，制成測(cè)試培養(yǎng)板?？瞻讓?duì)照組和各濃度樣品組各設(shè)三個(gè)平行孔，空白對(duì)照組加5 μ L人工海水，樣品組加5 μ L所需濃度的樣品液。室溫培養(yǎng)24小時(shí)后，在雙目解剖鏡下檢測(cè)計(jì)數(shù)鹵蟲(chóng)死亡個(gè)體數(shù)目。鹵蟲(chóng)致死活性用校正死亡率表示，計(jì)算公式如下校正死亡率=(對(duì)照組存活率一處理組存活率)/對(duì)照組存活率X 100%，并計(jì)算半數(shù)致死率LD5tl值。試驗(yàn)結(jié)果為組分1-1V的LD50值分別為21. 96、17. 27,4. 56與11. 67 μ g/mL,具有較好殺蟲(chóng)活性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明所涉及的發(fā)酵產(chǎn)物具有較好殺蟲(chóng)活性，它們可用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑。
權(quán)利要求
1.一種白僵菌AS-70菌株,其特征在于白僵菌AS-70 (Beauveria felina)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期2012年9月29日，保藏號(hào)為=CGMCC 6643。
2.按權(quán)利要求1所述的白僵菌AS-70菌株，其特征在于將所述白僵菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置或搖床發(fā)酵培養(yǎng)15-50天，發(fā)酵產(chǎn)物待用。
3.按權(quán)利要求2所述的白僵菌AS-70菌株，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基比例為大米100g、蛋白胨0. 6g，天然海水100mL。
4.一種權(quán)利要求1所述的白僵菌AS-70菌株的應(yīng)用，其特征在于所述白僵菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑。
5.按權(quán)利要求4所述的白僵菌AS-70菌株的應(yīng)用，其特征在于將所述白僵菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置或搖床發(fā)酵培養(yǎng)15-50天，發(fā)酵產(chǎn)物待用。
6.按權(quán)利要求4所述的白僵菌AS-70菌株的應(yīng)用，其特征在于將發(fā)酵產(chǎn)物用溶劑提取，提取物進(jìn)行柱層析分離，分離產(chǎn)物用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑。
7.按權(quán)利要求6所述的白僵菌AS-70菌株的應(yīng)用，其特征在干所述溶劑為石油醚、こ酸こ酷、氯仿、丙酮、甲醇、こ醇、正丁醇或水中的ー種或幾種。
8.按權(quán)利要求6所述的白僵菌AS-70菌株的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行柱層析分離，以石油醚-こ酸こ酯梯度洗脫，收集石油醚-こ酸こ酯體積比5:1與2:1梯度的洗脫組分I與II用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑；以氯仿-甲醇進(jìn)行梯度洗脫進(jìn)行柱層析分離，收集氯仿-甲醇體積比50:1與20:1梯度的洗脫組分III與IV用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑。
9.按權(quán)利要求8所述的白僵菌AS-70菌株的應(yīng)用，其特征在干所述柱層析可采用硅膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析及大孔吸附樹(shù)脂柱層析中的ー種或幾種。
10.按權(quán)利要求8所述的白僵菌AS-70菌株的應(yīng)用，其特征在于所述石油醚-こ酸こ酯洗脫梯度為100:1至1:1 ;氯仿-甲醇洗脫梯度為100:1至1:1。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物農(nóng)藥制劑，具體的說(shuō)是一種白僵菌AS-70菌株及其應(yīng)用。白僵菌AS-70(Beauveria felina)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期2012年9月29日，保藏號(hào)為CGMCC NO.6643。所述白僵菌的發(fā)酵產(chǎn)物用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑。本發(fā)明菌株分離自福建蘇澳島采集的苔蘚蟲(chóng)，通過(guò)測(cè)定其ITS1-5.8S-ITS2序列，并與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株相應(yīng)序列信息比較，其與菌株Beauveria felina(Accession number:AY261369)的相似度為99%。該菌株發(fā)酵產(chǎn)物可用于制備農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、周期短、產(chǎn)品成本低等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/14GK103045488SQ201210512308
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者王斌貴, 杜豐玉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所