專利名稱：一種牛肉質(zhì)相關(guān)基因cmya1的克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl的克隆及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著生活水平的不斷提高，人們對肉質(zhì)品質(zhì)的要求也越來越高。度量肉質(zhì)品質(zhì)的指標(biāo)主要包括PH值、系水力、肌內(nèi)脂肪含量、嫩度、肉色、肌纖維直徑、熟肉率、貯存損失等。肌內(nèi)脂肪含量(Intramuscular fat, IMF)是度量肉質(zhì)品質(zhì)的一個重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高肌內(nèi)脂肪含量將會使肉質(zhì)嫩度和多汁性得到改善，從而提高肉的品質(zhì)。牛肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等特點(diǎn)，營養(yǎng)豐富，一直是世界肉業(yè)發(fā)達(dá)國家肉類消費(fèi)的首選，我國的牛肉消費(fèi)量也在逐年上升。 動物體內(nèi)的肌肉可以分為三大類骨骼肌、心肌和平滑肌。骨骼肌占體重的40-60%，決定著家畜的產(chǎn)肉量。骨骼肌由大量的肌纖維(myofiber)組成，每個肌纖維就是一個肌細(xì)胞。肌纖維可根據(jù)代謝特點(diǎn)分為紅肌纖維(緩慢有氧收縮型)和白肌纖維(快速糖酵解收縮型)，另外還有一種肌纖維所含的酶系活性居于這兩類肌纖維之間，呈粉紅色，為中間型肌纖維。CMYA家族基因與動物的肌肉組織的組成具有密切的關(guān)系。骨骼肌的生長過程涉及大批基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄與翻譯水平的調(diào)控，不同個體或不同品種牛的產(chǎn)肉性狀差異與胚胎期和生后期基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。CMYA是原發(fā)性心肌癥相關(guān)蛋白(cardiomyopathy associated protein, CMYA),目前關(guān)于CMYA家族基因的研究主要集中于對該基因與肌蛋白的相互作用。為了探索中外牛種在肌肉生長以及肌肉品質(zhì)上表型差異的分子遺傳機(jī)制，我們的前期工作采用mRNA差異顯示技術(shù)對兩個代表品種成年夏洛來與成年蒙古牛背最長肌組織差異表達(dá)EST (表達(dá)序列標(biāo)簽)進(jìn)行分析，其中一條新EST在夏洛來中的表達(dá)量明顯高于蒙古牛。進(jìn)一步通過比對GenBank上人非冗余(non redundancy, nr)序列數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該EST對應(yīng)于人原發(fā)性心肌癥相關(guān)蛋白l(cardiomyopathy associatedI，CMYAl)基因。利用原位雜交和Northern雜交研究CMYAl基因的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)CMYAl基因的mRNA水平在發(fā)育的雞胚心臟組織中呈上調(diào)表達(dá)，隨后該基因被鑒定命名為“cXin”或“心”。有人利用cXin序列在EST公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)了小鼠上該基因的同源EST，并將該EST作為探針在小鼠骨骼肌cDNA文庫中進(jìn)行篩選、鑒定，此后將小鼠上該基因命名為mXin α，同時還利用cXin處理孵育的雞胚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞胚心臟形態(tài)發(fā)生異常，由此推斷cXin在心臟發(fā)育中有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)mXina在人上的同源基因?yàn)镃MYA1，通過放射雜交將該基因定位在3p21. 2-p21. 3，基因組DNA測序結(jié)果顯示該基因位于3p22. 2。用cXin cDNA序列作為探針，與鼠的基因組DNA進(jìn)行低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腟outhern雜交，發(fā)現(xiàn)了另外一個mXin^的存在，人上πιΧ ηβ又叫CMYA3基因，位于人的2q24. 3。CMYAl是一類新的肌動蛋白結(jié)合基序，在橫紋肌中特異表達(dá)，肌動蛋白(actin)、肌I丐蛋白C(troponinC)、肌I丐蛋白T(troponin T)以及肌動蛋白凝膠溶素(gelsolin)是它的互作蛋白，它編碼的產(chǎn)物位于成年動物心臟閏盤的連接處，可能參與了心臟閏盤的形成以及維持肌原纖維的完整性。
在實(shí)際工作中，人們試圖尋找一種簡便的活體評定胴體品質(zhì)的方法，以減少屠宰帶來的經(jīng)濟(jì)損失，因此大量研究致力于尋找胴體組成的最佳預(yù)測指標(biāo)。而目前DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為胴體品質(zhì)的快速評定開辟了新途徑。分子遺傳標(biāo)記則可能克服這一缺點(diǎn)而較早地對種牛進(jìn)行選擇，因此合適的遺傳標(biāo)記對于開展標(biāo)記輔助選擇，加快遺傳進(jìn)展，并最終實(shí)現(xiàn)分子育種是極其重要的。另外，研究突變位點(diǎn)在群體中的多態(tài)性，并進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因功能的一個強(qiáng)有力的手段。在群體中通過性狀關(guān)聯(lián)分析尋找與牛重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因，進(jìn)行分子育種始終是育種工作者的一項(xiàng)重要而艱巨的任務(wù)。CMYAl基因是一個重要的肌肉生長發(fā)育相關(guān)基因，將該基因用在分子輔助標(biāo)記選擇中具有重要意義，分離克隆牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl并進(jìn)行其多態(tài)性與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析，可以開發(fā)用于檢測牛肉質(zhì)指標(biāo)的新技術(shù)，為牛的標(biāo)記輔助育種提供了新的標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于分離牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl，獲得CMYAl基因mRNA序列，實(shí)現(xiàn)對 牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl的克隆，通過對克隆基因的RFLP多態(tài)性檢測，RFLP多態(tài)性與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析，建立RFLP多態(tài)性用于檢測牛肉質(zhì)指標(biāo)的技術(shù)，并為牛的標(biāo)記輔助育種提供新的標(biāo)記。本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYA1，該CMYAl基因mRNA序列如SEQ ID NO: I所述，該CMYAl基因蛋白質(zhì)序列如SEQ ID N0:2所述。而且，CMYAl基因的第2外顯子1058bp處有一個SNP標(biāo)記位點(diǎn)，為C/T突變，在第2外顯子2168bp處有一個SNP標(biāo)記位點(diǎn)，為C/T突變。一種牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl的克隆，制備步驟如下第一步，通過查詢 NCBI 數(shù)據(jù)庫(http: //www. ncbi. nlm. nih. rov/Ruide/)和Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://asia. ensembl. org/index, html)利用t匕較基因組學(xué)方法結(jié)合RT-PCR技術(shù)獲得CMYAl基因mRNA序列⑴通過查詢數(shù)據(jù)庫獲得Homo sapiens cardiomyopathy-associated proteinI (CMYAl), mRNA 序列 ΝΜ_194293· 2 和 Mus musculus cardiomyopathy -associatedproteinI (CMYAl)，mRNA 序列 ΝΜ_011724· 3 ；⑵利用NCBI BLAST 工具用 Highly similar sequences (megablast)比對牛表達(dá)序列標(biāo)簽EST，選取同源性大于80%的表達(dá)序列標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)RT-PCR弓丨物，填補(bǔ)表達(dá)序列標(biāo)簽之間的空缺；(3)利用 TRlzol. Reagent (Invitrogen, USA)提取牛心臟和肌肉總 RNA,RevertAidTM Premium Reverse Transcriptase (Fermentas)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 擴(kuò)增相應(yīng)空缺，將RT-PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(Solarbio, China)回收連接進(jìn)入pUCM_T載體測序。第二步，根據(jù)CMYAl基因mRNA序列，利用比對的方法進(jìn)行CMYAl基因的染色體定位以及基因結(jié)構(gòu)分析和蛋白特點(diǎn)分析第三步，找出CMYAl基因的兩個SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的基因組DNA ⑴找出CMYAl基因的兩個SNP位點(diǎn)；⑵根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出待測SNP所在的核苷酸片段；
第四步，RFLP-PCR多態(tài)性檢測。而且，所述制備步驟第三步的第⑵步中設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出待測SNP所在的核苷酸片段的引物序列如SEQ ID N0:3 6所示。一種牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl的應(yīng)用，將基因CMYAl中與牛肉質(zhì)相關(guān)的SNP標(biāo)記作為西門塔爾牛牛肉分子育種遺傳標(biāo)記。而且，將基因CMYAl中與牛肉質(zhì)相關(guān)的SNP標(biāo)記作為牛肉分子育種遺傳標(biāo)記的步驟如下第一步，牛CMYAl基因Hin6I_RFLP基因型與部分性狀的關(guān)聯(lián)分析；第二步，牛CMYAl基因ApaI-RFLP基因型與部分性狀的關(guān)聯(lián)分析；
第三步，確定基因CMYAl及其SNP位點(diǎn)用于檢測個體肌間脂肪含量和皮重等胴體性狀。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果是I、本發(fā)明分離牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl，利用比較基因組學(xué)方法結(jié)合RT-PCR技術(shù)獲得CMYAl基因mRNA序列，并確定CMYAl基因的染色體定位以及基因的結(jié)構(gòu)，可以為牛基因組數(shù)據(jù)庫提供新的信息，為優(yōu)質(zhì)性狀基因利用提供參考。2、CMYAl基因是一個重要的肌肉生長發(fā)育相關(guān)基因，將該基因用在分子輔助標(biāo)記選擇中具有重要意義，本發(fā)明選取CMYAl基因的兩個SNP位點(diǎn)，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出待測SNP所在的核苷酸片段，分別用Hin6I和ApaI進(jìn)行RFLP-PCR。在分析的牛群中，利用兩對引物針對不同突變位點(diǎn)，通過PCR-RFLP檢測各SNP位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率。并用130頭13個月大F3代西門塔爾牛進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析，確認(rèn)可用的牛肉分子育種遺傳標(biāo)記，可以開發(fā)用于檢測牛肉質(zhì)指標(biāo)的新技術(shù)，為牛的標(biāo)記輔助育種提供了新的標(biāo)記。


圖I是本發(fā)明中使用在線軟件http://cn. expasy. orR/tools/預(yù)測CMYAl蛋白功能域預(yù)測結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明C1058-T1058位點(diǎn)和C2186-T2186位點(diǎn)PCR擴(kuò)增及基因型顯示圖，其中圖 2(a)為 C1058-T1058 位點(diǎn) PCR 及 Hin6I-RFLP 基因型顯示圖，圖 2(b)為 C2186-T2186位點(diǎn)PCR及ApaI-RFLP基因型顯示圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)一步說明，其具體實(shí)施方案應(yīng)該理解為僅為舉例說明，不是限定性的，不能以下述舉例說明來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的技術(shù)路線為牛肌組織總RNA提取、RT-PCR獲得全長cDNA序列、獲得CMYAl基因的mRNA序列、利用比對的方法進(jìn)行CMYAl基因的染色體定位以及基因結(jié)構(gòu)分析和蛋白特點(diǎn)分析、設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的基因組DNA、RFLP多態(tài)性檢測、RFLP多態(tài)性與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析，確認(rèn)可以用作牛肉分子育種遺傳標(biāo)記SNP位點(diǎn)。一種牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl的克隆步驟如下第一步，通過查詢 NCBI 數(shù)據(jù)庫(http: //www. ncbi. nlm. nih. rov/Ruide/)和Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://asia. ensembl. org/index, html)利用t匕較基因組學(xué)方法結(jié)合RT-PCR技術(shù)獲得CMYAl基因mRNA序列⑴通過查詢數(shù)據(jù)庫獲得Homo sapiens cardiomyopathy-associated proteinI (CMYAl)，mRNA 序列 NM—194293. 2 和 Mus musculus cardiomyopathy -associatedproteinI (CMYAl)，mRNA 序列 ΝΜ_011724· 3 ；⑵利用NCBI BLAST 工具用 Highly similar sequences (megablast)比對牛表達(dá)序列標(biāo)簽EST，選取同源性大于80%的表達(dá)序列標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)RT-PCR弓丨物，填補(bǔ)表達(dá)序列標(biāo)簽之間的空缺；(3)利用 TRlzoUD Reagent (Invitrogen, USA)提取牛心臟和肌肉總 RNA，RevertAidTM Premium Reverse Transcriptase (Fermentas)反轉(zhuǎn)錄成 CDNA 擴(kuò)增相應(yīng)空缺，將RT-PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(Solarbio, China)回收連接進(jìn)入I3UCM-T載體測序；其具體步驟為
①RNA抽提利用實(shí)驗(yàn)室保存的西門塔爾牛心臟和肌肉組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增CMYAl基因；取50_100mg組織液氮研磨至粉末狀,加入Iml Trizol,待Trizol試劑和組織融化成液體狀，將混合物至于玻璃勻漿器中勻漿10分鐘后，加入I. 5ml離心管中，室溫靜置5min ； 12000rpmX 5min 4°C離心,取上清放入一個新的離心管中；加入O. 2ml氯仿,劇烈振蕩15s，靜置3min ;4°C離心，12000rpmX lOmin，取上清；加入O. 5ml異丙醇，混勻，冰上靜置20_30min。4°C離心，12000rpmX IOmin,棄上清；加入Iml 75%乙醇，洗漆沉淀2次。4°C,7500gX5min,棄上清；室溫放置晾干或超凈臺中吹干5min左右,加入20微升的Rnase-freeH20溶解；電泳檢測-RNA電泳結(jié)果；②反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成在O. 2_ml PCR 管中加入以下試劑5 μ I total RNA, 50pmol of random primer,50pmol of oligo (dT) primer, I μ L dNTPs (I OmM each), 70。C 溫浴 5min。冰浴IOsec,離心加入下列試劑4· 0 μ I 5*Reaction Buffer, I. 0 μ I dNTP Mix(10mmol/L)，I.0 μ I RNA 酶抑制劑(20U/μ 1)，2.O μ I RevertAidTM PremiumReverseTranscriptase, 20. O μ I Total volume, 37° C 溫浴 5min ;42° C 溫浴 60min;70° C溫浴lOmin。終止反應(yīng)；將上述溶液-20° C保存；③RT-PCR反應(yīng)體系和步驟反應(yīng)體系1·25 μ L(50ng)of cDNA, I μ L of each primer (10 μ M)(如表 I )，0. 5 μ LdNTPs (IOmM) ,2. 5μ L of 10XPCR buffer with I. 5mM MgC12,0. 625unitsof Taq DNApolymerase(Cff, BioTech Co. Ltd,China), and 18. 625 μ L nuclease-freewater,25 μ Lreaction mixture containing Total volume ；PCR反應(yīng)步驟94度預(yù)變性5min，94度變性30s，(TmF+TmR/2)度30s，72度延伸(延伸時間根據(jù)PCR產(chǎn)物大小lKb/min) 35個循環(huán)，72度延伸15分鐘；表I. CMYAl RT-PCR 引物
權(quán)利要求
1.一種牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl，其特征在于該CMYAl基因mRNA序列如SEQ ID NO: I所述，該CMYAl基因蛋白質(zhì)序列如SEQ ID N0:2所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl，其特征在于在CMYAl基因的第2外顯子1058bp處有一個SNP標(biāo)記位點(diǎn)，為C/T突變，在第2外顯子2168bp處有一個SNP標(biāo)記位點(diǎn)，為C/T突變。
3.—種牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl的克隆，其特征在于制備步驟如下 第一步，通過查詢NCBI 數(shù)據(jù)庫(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/guide/)矛P Ensembl 數(shù)據(jù)庫(http://asia. ensembl. org/index, html)利用比較基因組學(xué)方法結(jié)合RT-PCR技術(shù)獲得CMYAl基因mRNA序列 ⑴通過查詢數(shù)據(jù)庫獲得 Homo sapiens cardiomyopathy-associated proteinI (CMYAl), mRNA 序列 ΝΜ_194293· 2 和 Mus musculus cardiomyopathy -associatedproteinI (CMYAl)，mRNA 序列 ΝΜ_011724· 3 ； ⑵利用 NCBI BLAST 工具用 Highly similar sequences (megablast)比對牛表達(dá)序列標(biāo)簽EST，選取同源性大于80%的表達(dá)序列標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)RT-PCR弓丨物，填補(bǔ)表達(dá)序列標(biāo)簽之間的空缺； ⑶利用TRIzol Reagent (Invitrogen, USA)提取牛心臟和肌肉總 RNA，RevertAidTMPremium Reverse Transcriptase (Fermentas)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 擴(kuò)增相應(yīng)空缺，將 RT-PCR 產(chǎn)物用膠回收試劑盒(Solarbio, China)回收連接進(jìn)入pUCM_T載體測序。
第二步，根據(jù)CMYAl基因mRNA序列，利用比對的方法進(jìn)行CMYAl基因的染色體定位以及基因結(jié)構(gòu)分析和蛋白特點(diǎn)分析 第三步，找出CMYAl基因的兩個SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的基因組DNA ⑴找出CMYAl基因的兩個SNP位點(diǎn)； ⑵根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出待測SNP所在的核苷酸片段； 第四步，RFLP-PCR多態(tài)性檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl的克隆，其特征在于所述制備步驟第三步的第⑵步中設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出待測SNP所在的核苷酸片段的引物序列如SEQ IDNO:3^6 所示。
5.—種牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl的應(yīng)用，其特征在于將基因CMYAl中與牛肉質(zhì)相關(guān)的SNP標(biāo)記作為西門塔爾牛牛肉分子育種遺傳標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYAl的應(yīng)用，其特征在于將基因CMYAl中與牛肉質(zhì)相關(guān)的SNP標(biāo)記作為牛肉分子育種遺傳標(biāo)記的步驟如下 第一步，牛CMYAl基因Hin6I-RFLP基因型與部分性狀的關(guān)聯(lián)分析； 第二步，牛CMYAl基因ApaI-RFLP基因型與部分性狀的關(guān)聯(lián)分析； 第三步，確定基因CMYAl及其SNP位點(diǎn)用于檢測個體肌間脂肪含量和皮重等胴體性狀。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛肉質(zhì)相關(guān)基因CMYA1的克隆及應(yīng)用，克隆的CMYA1基因mRNA序列如SEQ ID NO:1所述，其蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO:2所述，在CMYA1基因的第2外顯子1058bp處有一個SNP標(biāo)記位點(diǎn)，為C/T突變，在第2外顯子2168bp處有一個SNP標(biāo)記位點(diǎn)，為C/T突變，用于檢測SNP標(biāo)記的引物序列如SEQ ID NO:3~6所示。將基因CMYA1中與牛肉質(zhì)相關(guān)的SNP標(biāo)記作為西門塔爾牛牛肉分子育種遺傳標(biāo)記。本發(fā)明為?；蚪M數(shù)據(jù)庫提供新的信息，為優(yōu)質(zhì)性狀基因利用提供了參考，本發(fā)明公開的SNP多態(tài)性位點(diǎn)的應(yīng)用為檢測牛肉質(zhì)提供了新的技術(shù)指標(biāo)，為牛的標(biāo)記輔助育種提供了新的標(biāo)記。
文檔編號C12N15/12GK102943076SQ20121046246
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月15日
發(fā)明者郭宏, 丁向彬, 聶永偉, 葛秀國, 劉新峰 申請人:天津農(nóng)學(xué)院