專利名稱：一種牛屠宰性狀相關(guān)基因cmya4的克隆及應(yīng)用的制作方法
—種牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4的克隆及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4的克隆及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
動(dòng)物體內(nèi)的肌肉可以分為三大類骨骼肌、心肌和平滑肌。骨骼肌占體重的 40-60%，決定著家畜的產(chǎn)肉量。骨骼肌由大量的肌纖維(myofiber)組成，每個(gè)肌纖維就是一個(gè)肌細(xì)胞。肌纖維可根據(jù)代謝特點(diǎn)分為紅肌纖維(緩慢有氧收縮型)和白肌纖維(快速糖酵解收縮型)，另外還有一種肌纖維所含的酶系活性居于這兩類肌纖維之間，呈粉紅色，為中間型肌纖維。CMYA家族基因與動(dòng)物的肌肉組織的組成具有密切的關(guān)系。骨骼肌的生長(zhǎng)過(guò)程涉及大批基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄與翻譯水平的調(diào)控，不同個(gè)體或不同品種牛的產(chǎn)肉性狀差異與胚胎期和生后期基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。CMYA是原發(fā)性心肌癥相關(guān)蛋白 (cardiomyopathy associated protein, CMYA),目前關(guān)于CMYA家族基因的研究主要集中于對(duì)該基因與肌蛋白的相互作用。
CMYA4 基因又名 UNC-45B (unc_45homolog B)或骨豁肌 UNC-45 (Skeletalmuscle UNC-45)。通過(guò)遺傳實(shí)驗(yàn)得出該基因與粗絲的組裝有關(guān)，發(fā)現(xiàn)其具有分子伴侶的作用。線蟲 UNC-45分子量大小為107kDa，氨基端含有34個(gè)氨基酸的重復(fù)序列，大約400個(gè)氨基酸殘基的中心區(qū)域以及UNC-45/Cro 1/She4p (UCS)結(jié)構(gòu)域。UNC-45在肌肉組織中表達(dá)，并且免疫熒光染色顯示它與重鏈肌球蛋白共定位于軀干肌肉A-帶粗絲。研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有2種UNC-45蛋白，分別為GC UNC-45和SM UNC-45?？傮w上這兩種蛋白質(zhì)氨基酸的同源性74%左右，而小鼠和人最高，分別達(dá)到95%和98%。分別檢測(cè)了它們?cè)诔赡晷∈蟛煌M織的分布情況顯示GC UNC-45廣泛表達(dá)于各組織，而SM UNC-45只在骨骼肌和心肌中表達(dá)，并利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)了它們?cè)谂咛ゲ煌l(fā)育時(shí)期的表達(dá)，結(jié)果顯示SM UNC-45基因在小鼠胚胎發(fā)育的第8. 75天開(kāi)始僅在心臟中表達(dá)，而GC UNC-45基因在胚胎發(fā)育的第8天就開(kāi)始廣泛表達(dá)。在培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞系中，GC-UNC45基因在增殖期表達(dá)量最高，而SM UNC-45 在分化階段表達(dá)，參與肌細(xì)胞的成熟以及肌管的形成。通過(guò)以上結(jié)果作者得出SM UNC-45 在肌肉發(fā)育中起著重要作用。對(duì)斑馬魚敲除SM UNC-45基因后出現(xiàn)癱瘓以及心臟功能的異常，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)癱瘓是由于軀干肌肉肌小節(jié)中肌球蛋白絲的缺乏。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了 SM UNC-45在肌肉發(fā)育中的重要作用。
在實(shí)際工作中，人們?cè)噲D尋找一種簡(jiǎn)便的評(píng)定胴體品質(zhì)的方法，以減少經(jīng)濟(jì)損失， 因此大量研究致力于尋找胴體組成的最佳預(yù)測(cè)指標(biāo)。而目前DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為胴體品質(zhì)的快速評(píng)定開(kāi)辟了新途徑。分子遺傳標(biāo)記則可能克服這一缺點(diǎn)而較早地對(duì)種牛進(jìn)行選擇，因此合適的遺傳標(biāo)記對(duì)于開(kāi)展標(biāo)記輔助選擇，加快遺傳進(jìn)展，并最終實(shí)現(xiàn)分子育種是極其重要的。另外，研究突變位點(diǎn)在群體中的多態(tài)性，并進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因功能的一個(gè)強(qiáng)有力的手段。在群體中通過(guò)性狀關(guān)聯(lián)分析尋找與牛重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因，進(jìn)行分子育種始終是育種工作者的一項(xiàng)重要而艱巨的任務(wù)。
CMYA4基因是一個(gè)重要的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因，將該基因用在分子輔助標(biāo)記選擇中具有重要意義，分離克隆牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4并進(jìn)行其多態(tài)性與屠宰性狀的關(guān)聯(lián)分析，可以開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)牛屠宰性狀指標(biāo)的新技術(shù)，為牛的標(biāo)記輔助育種提供了新的標(biāo)記。
通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)公開(kāi)專利文獻(xiàn)的檢索，未檢索到與牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4技術(shù)的相關(guān)專利文獻(xiàn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于分離牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4，獲得CMYA4基因mRNA序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4的克隆，通過(guò)對(duì)克隆基因的RFLP多態(tài)性檢測(cè)，RFLP多態(tài)性與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析，建立RFLP多態(tài)性用于檢測(cè)牛屠宰性狀指標(biāo)的技術(shù)，并為牛的標(biāo)記輔助育種提供新的標(biāo)記。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4，在CMYA4基因的第8外顯子1092bp處有一個(gè)與牛屠宰性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記位點(diǎn)，為T/C突變。
一種牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4的克隆，制備步驟如下
第一步，通過(guò)查詢 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www. ncb1. nlm. nih. gov/guide/)和 Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(http://asia. ensembl. org/index, html)利用I；匕較基因組學(xué)方法獲得 CMYA4基因mRNA序列
⑴查詢數(shù)據(jù)庫(kù)獲得Homo sapiens cardiomyopathy-associated protein 4 (CMYA4), mRNA 序列 ΝΜ_173167· 2 和 Mus musculus cardiomyopathy -associatedprotein 4 (CMYA4)，mRNA 序列 NM_178680. 4 ；
⑵利用NCBI BLAST 工具利用 Highly similar sequences (megablast)比對(duì)牛表達(dá)序列標(biāo)簽EST，選取同源性大于80%的表達(dá)序列標(biāo)簽序列.EDY048664.1, EE373716.1, EE 381791.1, EE376524.1, DV933195.1, DV930911.1, DV797178.1, CB438141. 1，通過(guò) DNAstar (Madison, WI, USA)程序拼接獲得 CMYA4mRNA 全長(zhǎng)序列 3430bp ；
第二步，根據(jù)CMYA4基因mRNA序列，利用比對(duì)的方法進(jìn)行CMYA4基因的染色體定位以及基因結(jié)構(gòu)分析和蛋白特點(diǎn)分析
第三步，找出CMYA4基因的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)弓丨物擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的基因組DNA ；
⑴找出CMYA4基因的一個(gè)SNP位點(diǎn)；
⑵根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出待測(cè)SNP所在的核苷酸片段；
第四步，RFLP-PCR多態(tài)性檢測(cè)。
而且，所述制備步驟第三步的第⑵步中設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出待測(cè)SNP所在的核苷酸片段的引物序列如SEQ ID N0:3 4所示。
一種牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4的應(yīng)用，是將基因CMYA4中與牛屠宰性狀相關(guān)的 SNP標(biāo)記作為牛肉分子育種遺傳標(biāo)記。
而且，將基因CMYA4中與牛屠宰性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記作為牛分子育種遺傳標(biāo)記的步驟如下
第一步，牛CMYA4基因HindII1-RFLP基因型與部分性狀的關(guān)聯(lián)分析；
第二步，確定基因CMYA4及其SNP位點(diǎn)用于檢測(cè)個(gè)體毛重、胴體重、胴體長(zhǎng)、胴體深、皮重等胴體性狀。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果是
1、本發(fā)明分離牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4，利用比較基因組學(xué)方法獲得CMYA4基因mRNA序列，并確定CMYA4基因的染色體定位以及基因的結(jié)構(gòu)，可以為?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)提供新的信息，為優(yōu)質(zhì)性狀基因利用提供參考。
2、CMYA4基因是一個(gè)重要的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因，將該基因用在分子輔助標(biāo)記選擇中具有重要意義，本發(fā)明選取CMYA4基因的一個(gè)SNP位點(diǎn)，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出待測(cè)SNP所在的核苷酸片段，用HindIII進(jìn)行RFLP-PCR。在分析的牛群中，利用一對(duì)引物針對(duì)突變位點(diǎn)，通過(guò)PCR-RFLP檢測(cè)SNP位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率。并用130頭13個(gè)月大F3代西門塔爾牛進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析，確認(rèn)可用的牛分子育種遺傳標(biāo)記，可以開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)牛屠宰性狀指標(biāo)的新技術(shù)，為牛的標(biāo)記輔助育種提供了新的標(biāo)記。


圖1是本發(fā)明中使用在線軟件http://cn. expasy. org/tools/預(yù)泖丨CMYA4蛋白功能域預(yù)測(cè)結(jié)果圖2是本發(fā)明T1092-C1092位點(diǎn)基因型顯示圖。
具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，其具體實(shí)施方案應(yīng)該理解為僅為舉例說(shuō)明，不是限定性的，不能以下述舉例說(shuō)明來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的技術(shù)路線為通過(guò)查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)利用比較基因組學(xué)方法獲得CMYA4基因mRNA序列、利用比對(duì)的方法進(jìn)行CMYA4基因的染色體定位以及基因結(jié)構(gòu)分析和蛋白特點(diǎn)分析、設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的基因組DNA、RFLP多態(tài)性檢測(cè)、RFLP多態(tài)性與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析，確認(rèn)可以用作牛肉分子育種遺傳標(biāo)記SNP位點(diǎn)。
一種牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4的克隆步驟如下
第一步，通過(guò)查詢 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www. ncb1. nlm. nih. rov/Ruide/)和 Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(http:"asia. ensembl. orR/index. html)利用I；匕較基因組學(xué)方法獲得 CMYA4基因mRNA序列
⑴查詢數(shù)據(jù)庫(kù)獲得Homo sapiens cardiomyopathy-associated protein 4 (CMYA4), mRNA 序列 ΝΜ_173167· 2 和 Mus musculus cardiomyopathy -associatedprotein 4 (CMYA4)，mRNA 序列 NM_178680. 4 ；
⑵利用NCBI BLAST 工具利用 Highly similar sequences (megablast)比對(duì)牛表達(dá)序列標(biāo)簽EST，選取同源性大于80%的表達(dá)序列標(biāo)簽序列。EDY048664.1, EE373716.1, E E381791. 1，EE376524. 1,DV933195. 1,DV930911. 1,DV797178.1, CB438141.1,通過(guò) DNAstar (Madison, WI, USA)程序拼接獲得CMYA4mRNA全長(zhǎng)序列3430bp，序列如SEQ ID NO:1所示，
CMYA4mRNA 序列SEQ ID NO:1 如下
ctgggggttcacacacagaggagccgcaccccaggaggactgaccgagaacattgtccttgagagaaaa tggccgaggcggaagcgatgcagctgaaggagga
ggggaatcagcatttccagctccaggactacaaggctgccaccaaaagctacagccaggccctgaagct gaccaaggataaggccctgctggccacactctatcg
gaaccgggcggcctgtggcctgaaaatggagagctatgttcaggcggcttctgatgcctcaagagccat tgatatcaactcctcggacatcaaggctctgtaccggc
gatgccaggcactggagcacctgggcaagctggaccaggccttcaaggatgtgcagcgctgtgccactc tggagccacagaaccagagcttccaggagacactg
aggaggctcaataccagcatccaggagaagctccgtgtgcagttctccactgactcgagggttcagacg atgtttgagattctcctggacagaaacagtgaagcggat
aaactagagaaggccgccaacaacctcattgtcctcagccgtgaggaagcgggggccgagaggatcttc cagaacaacggcgtggccctgctgatgcagcttttg
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agaccgaatctgcagcctcatggcggtggagagcgaggagatgtctctggccgtctgcaacctgctgca gggcatcatcgacgctctgtctggagaggacaaacag
gagcatcgggggaaggaagaggccctggttctggactccaagaaggacctgaagcagatcaccaaccac ctgctcgacatgctggtcagtaagaaggtgtctggc
cagggtagggatcaggccctgaacctgctcaataagaacgtccccaggaaggacctcgccattcacgac aactcccgcaccatctacgtggttgataacggcctaa
ggaagatcctgaaggtggtgggacaggtcccagatctgccgtcctgcctgcccttgaccgacaacaccc gcatgctggcctcaatcctcatcaacaagctttacgac
gacctgcgctgtgaccccgagcgcgaccacttccgcaagatctgcgaggagcacatcacgggcacgttt gacccccaggacatggacaagaatgtgattgccatcc
agacggtgtcggggatcctgcagggcccctttgacctgggcaatcagctgctgggactgaaaggtgtga tggagatgatggtggctctgtgcggctcggagcgtga
gacggaccagctggtggccgtggaggccctcatccacgcctccaccaagctcagccgtgccacctteat catcaccaacggtgtgtcactgctcaaagagatctaca
agaccaccaaaaacgagaagatcaagatccgcgcactggtgggactctgtaaacttggctcggcgggcg gcacagattacgctctcaggcagtttgctgaaggctc
aacagaaaagctggccaaacagtgtcgcaagtggctgtgcaatgcatccatagacacccggacccggaa atgggcagtggagggcctggcctacctcacgctgg
acgccgacgtgaaggacgactttgttcaggacatccctgccctgcaggccatgttcgagctggccaaga cccccgacaagaccatcctgtactcggtggccaccac
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accaaagagctgctggccagggtattcctggcactgtgtgacaacccaaaggaccgaggcaccattgtg gctcaaggtggtggtaaggccctgattcccctggcttt
ggagggcacagacgtgggcaaggtgaaggcagcccacgccctagcgaagatcgccgcggtctccaacccagacatcgccttccccggggagcgggtgtacga
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ggtgaacaaggaggtacaggagaggttcctggccgatggcaacgaccggctgaagctggtggtgctgct ctgtggcgaggatgacgacaagctgcagaacgcgg
ctgcgggggccctggccatgctgacagcagcgcataagaagctgtgcttcaagatgactgaagtgacaa ctcagtggttggagattctacagcggctttgcttgcatg
accggctgtcagttcaacaccggggcctggtcattgcctacaacctgctggcggctgatgctgagttgg ctaagaagctggtggagagtgagctgctggagatcctg
acggtggtgggcaagcaagagccggacgagaagcgggcagcagtggttcagacagctcgggaatgtctc atcaaatgcatggattatggcttcattaaaccagtgg
cttagacaggggcccagagggagactggggctgctcctgtaactgtgcagagttccgaactgagaactc ttggggtgtcagttccattagggatcattgcaaccacga
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gttgcagaaattcctagaataattttcatctgtgattaggaagacaggttggataattctttctgtacc cattccaaaggccgggataatgggctggagttctttacattttgg
aaaatagattgtgtggtgaagtaggagctaacaggtcctactttaaatatgtaaagtagtgtgactata aagtttagtgctggtgtacctggatgctgatctgtctggttttta
tatcctgtttcccctgctgtttgactgcggctgcctggaaatgcatgtttcagcagcagtgcccgtccc agacgcgtgcgcattcctttcacttaactatgatggaaataca
gctgatgttcagt
第二步，根據(jù)CMYA4基因mRNA序列，利用比對(duì)的方法進(jìn)行CMYA4基因的染色體定位以及基因結(jié)構(gòu)分析和蛋白特點(diǎn)分析
牛的基因組草圖已經(jīng)繪制完成，我們得到了 CMYA4基因mRNA序列，所以我們利用了比對(duì)的方法進(jìn)行CMYA4基因的染色體定位以及基因的結(jié)構(gòu)分析；
⑴CMYA4 位于染色體 Chromosome 19:15233409_15265756bp，有十九個(gè)外顯子十八個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)3430bp氨基酸序列長(zhǎng)929residues,推導(dǎo)出來(lái)的蛋白質(zhì)等電點(diǎn) (Isoelectric point) :7· 7698,分子量(Molecular weight) : 103，549. 83g/mol。CMYA4 蛋白序列序列如SEQ ID N0:2所示，CMYA4蛋白序列SEQ ID NO:2如下MAEAEAMQLKEEGNQHFQLQDYKAATKSYSQALKLTKDKALLATLYRNRAACGLKMESYVQAASDAS RAIDINSSDIKALYRRCQALEHLGKLDQAFKDVQRCATLEPQNQSFQETLRRLNTSIQEKLRVQFSTDS
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⑵使用在線軟件http: //cn. expasy. org/tools/預(yù)測(cè)CMYA4蛋白功能域
如圖1所示，基因結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示CMYA 4蛋白含有一個(gè)TPR-1ike超家族結(jié)構(gòu)域， 一個(gè)ARM重復(fù)超家族結(jié)構(gòu)域，一個(gè)肌漿球蛋白結(jié)合中心結(jié)構(gòu)域。
第三步，找出CMYA4基因的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)弓丨物擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的基因組DNA ；
⑴找出CMYA4基因的兩個(gè)SNP位點(diǎn)
通過(guò)查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)選取CMYA4基因的一個(gè)SNP位點(diǎn)SNP :rs 109057450，位于Chromosome 19:15250730bp, CMYA4基因第8外顯子1092bp,為T/C同義突變位點(diǎn) (T1092-C1092)；
⑵根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出待測(cè)SNP所在的核苷酸片段
①引物序列如下
SEQ ID N0:37450_F GCTGACGGTGCCGTTTCTGTG
SEQ ID N0:47450_R GGCCGGCATCTTACGCTTGCT
②PCR擴(kuò)增條件
PCR 反應(yīng)總體積 20 μ L，其中?；蚪M DNA 約 lOOng，含 I Xbuffer (Promega)，I 5mmol/L MgC12，dNTP 終濃度為 150 μ mol/L，引物終濃度為 O :2 μ mol/L，2U Taq DNA聚合酶 (Promega)0 PCR 擴(kuò)增程序是94°C 4min，循環(huán) 5 次 94°C 45s, 62°C 45s, 72°C lmin，然后再循環(huán)30次94°C 45s, 57°C 45s, 72°C lmin，最后72°C延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到467bp長(zhǎng)的目的片段；
第四步，RFLP-PCR多態(tài)性檢測(cè)
⑴針對(duì)SNP位點(diǎn)選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶進(jìn)行RFLP-PCR
T1092-C1092位點(diǎn)用HindIII進(jìn)行RFLP-PCR，PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是15 μ L，其中I X buffer1. 5 μ L，PCR產(chǎn)物3 5 μ L，限制性內(nèi)切酶為0. 5 μ L (5U)，用H2O補(bǔ)足15 μ L，將樣品混勻后離心，37°C水浴4h，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照，T1092-C1092位點(diǎn)基因型如圖2所示；
⑵對(duì)單核苷酸多態(tài)性在牛群中的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)
在分析的牛群中，利用一對(duì)引物針對(duì)突變位點(diǎn)，通過(guò)PCR-RFLP檢測(cè)SNP位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表I所示；
表1. SNP rsl09057450 (T1092-C1092)等位基因基因頻率
權(quán)利要求
1.一種牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4，其特征在于在CMYA4基因的第8外顯子1092bp 處有一個(gè)與牛屠宰性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記位點(diǎn)，為T/C突變。
2.一種牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4的克隆，其特征在于制備步驟如下第一步,通過(guò)查詢 NCBI(http: //www. ncb1. nlm. nih. gov/guide/)和 Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(http://asia. ensembl. org/index, html)利用比較基因組學(xué)方法獲得CMYA4基因 mRNA序列⑴查詢數(shù)據(jù)庫(kù)獲得 Homo sapiens cardiomyopathy-associated protein 4 (CMYA4), mRNA 序列 ΝΜ_173167· 2 和 Mus musculus cardiomyopathy -associatedprotein 4 (CMYA4)，mRNA 序列 NM_178680. 4 ；⑵利用 NCBI BLAST 工具利用 Highly similar sequences (megablast)比對(duì)牛表達(dá)序列標(biāo)簽EST，選取同源性大于80%的表達(dá)序列標(biāo)簽序列.EDY048664.1, EE373716.1, EE3 81791.1, EE376524.1, DV933195.1, DV930911.1, DV797178.1, CB438141. 1，通過(guò) DNAstar (Madison, WI, USA)程序拼接獲得 CMYA4mRNA 全長(zhǎng)序列 3430bp。第二步，根據(jù)CMYA4基因mRNA序列，利用比對(duì)的方法進(jìn)行CMYA4基因的染色體定位以及基因結(jié)構(gòu)分析和蛋白特點(diǎn)分析第三步，找出CMYA4基因的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的基因組DNA ⑴找出CMYA4基因的一個(gè)SNP位點(diǎn)；⑵根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出待測(cè)SNP所在的核苷酸片段；第四步，RFLP-PCR多態(tài)性檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4的克隆，其特征在于所述制備步驟第三步的第⑵步中設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出待測(cè)SNP所在的核苷酸片段的引物序列如SEQ ID NO: 3^4 所示。
4.一種牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4的應(yīng)用，其特征在于將基因CMYA4中與牛屠宰性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記作為西門塔爾牛牛肉分子育種遺傳標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4的應(yīng)用，其特征在于將基因 CMYA4中與牛屠宰性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記作為牛肉分子育種遺傳標(biāo)記的步驟如下第一步，牛CMYA4基因HindII1-RFLP基因型與部分性狀的關(guān)聯(lián)分析；第二步，確定基因CMYA4及其SNP位點(diǎn)用于檢測(cè)個(gè)體毛重、胴體重、胴體長(zhǎng)、胴體深、皮重等胴體性狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛屠宰性狀相關(guān)基因CMYA4的克隆及應(yīng)用，在CMYA4基因的第8外顯子1092bp處有一個(gè)與牛屠宰性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記位點(diǎn)，為T/C突變，基因CMYA4的克隆制備步驟包括獲得CMYA4基因mRNA序列；CMYA4基因的染色體定位以及基因結(jié)構(gòu)分析和蛋白特點(diǎn)分析；設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的基因組DNA；RFLP-PCR多態(tài)性檢測(cè)，將基因CMYA4中與牛屠宰性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記作為西門塔爾牛牛肉分子育種遺傳標(biāo)記。本發(fā)明為?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)提供新的信息，為優(yōu)質(zhì)性狀基因利用提供了參考，本發(fā)明公開(kāi)的SNP多態(tài)性位點(diǎn)的應(yīng)用為檢測(cè)牛屠宰性狀提供了新的技術(shù)指標(biāo)，為牛的標(biāo)記輔助育種提供了新的標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102994511SQ201210462180
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月15日
發(fā)明者郭宏, 葛秀國(guó), 聶永偉, 丁向彬, 劉新峰 申請(qǐng)人:天津農(nóng)學(xué)院