專利名稱：一種用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種纖維素酶的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維素是地球上分布最廣和含量最豐富的可再生有機(jī)資源，它經(jīng)過水解可以制得單糖，然后單糖經(jīng)微生物發(fā)酵可進(jìn)一步生產(chǎn)低聚糖、單細(xì)胞蛋白、酒精和有機(jī)酸等有機(jī)原料和燃料。因此纖維素資源作為能源物質(zhì)開發(fā)具有很大前景。纖維素，木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，半纖維素和纖維素微纖維間以氫鍵聯(lián)接，形成的空間結(jié) 構(gòu)是植物細(xì)胞壁的主體框架，而木質(zhì)素內(nèi)部除了有強(qiáng)大的氫鍵連接外，還與半纖維素通過共價鍵形成穩(wěn)定的木質(zhì)素碳水化合物復(fù)合體。由于復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征，木質(zhì)纖維素的纖維素酶解率很低。纖維素酶是復(fù)合酶，也是誘導(dǎo)酶，必須在誘導(dǎo)劑的作用下才能大量的表達(dá)。不同的誘導(dǎo)劑對里氏木霉表達(dá)纖維素酶的誘導(dǎo)效果和使用價值是不同的，誘導(dǎo)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的物質(zhì)主要是一些糖類，包括多聚糖、寡糖和單糖等。其中以纖維素、槐糖的誘導(dǎo)效果最好，乳糖和纖維二糖的誘導(dǎo)效果次之，山梨糖獨特的誘導(dǎo)能力有著特殊的價值。然而這些單糖或寡糖誘導(dǎo)物成本較高，難于應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。商品纖維素酶的生產(chǎn)是以纖維素作為誘導(dǎo)物，其合成的纖維素酶系相對簡單，對于有著復(fù)雜結(jié)構(gòu)的天然木質(zhì)纖維素的降解率很低。目前纖維素酶的生產(chǎn)中誘導(dǎo)底物主要采用微晶纖維素，現(xiàn)有工藝生產(chǎn)的纖維素酶對于單純的纖維素降解能力較強(qiáng)，但是對于天然植物纖維的降解能力很差，主要是因為生產(chǎn)過程中采用的誘導(dǎo)方法和誘導(dǎo)底物選擇方面的不足。因此，如果可以采用有效的誘導(dǎo)模式和合適的誘導(dǎo)底物，則可以大大提高天然植物纖維的轉(zhuǎn)化率和生物質(zhì)能源的產(chǎn)率。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可工業(yè)化生產(chǎn)用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法。技術(shù)方案本發(fā)明所述用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法，包括如下步驟
(1)底物選取取特定植物纖維作為底物；
(2)纖維素酶產(chǎn)生菌的活化培養(yǎng)將纖維素酶產(chǎn)生菌接種至含有活化培養(yǎng)基的器皿中靜置培養(yǎng)制得纖維素酶產(chǎn)生菌的活化培養(yǎng)液；
(3)纖維素酶的誘導(dǎo)將步驟(I)的底物作為誘導(dǎo)物，制備產(chǎn)酶培養(yǎng)基；將步驟(2)的纖維素酶產(chǎn)生菌的活化培養(yǎng)液接種到所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)酶，在25 30°C，轉(zhuǎn)速為100 180 r/min條件下培養(yǎng)，發(fā)酵時間為3 7 d，得到發(fā)酵液；
其中，所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配方為誘導(dǎo)物2 6 g/L，葡萄糖I 3 g/L，微晶纖維素2 3g/L，蛋白胨 I 2 g/L, (NH4)2SO4 2 3 g/L, KH2PO4 3 4 g/L，尿素 O. 4 O. 6 g/L,CaCl2 · 2H20 O. 6 I. O g/L, MgSO4 · 7H20 0· 4 0. 8g/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 0· 04 g/L,MnSO4 · H2O 0· 001 O. 004 g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 002 0· 004 g/L, CoCl2 · 6Η20 O. 004
O.008 g/L,吐溫 80 0· 3 0· 5 g/L，其余為水，pH 5. O ；
(4)發(fā)酵液的鹽析和透析將發(fā)酵液分別進(jìn)行鹽析和透析處理，得到用于特定植物纖維素水解的纖維素酶。本發(fā)明方法中，采用的特定植物纖維不同，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的纖維素酶酶系組成和降解植物纖維的能力也有差異。比如，桑葉誘導(dǎo)制備的纖維素酶，降解桑葉的能力較強(qiáng)；而桑葉誘導(dǎo)制備的纖維素酶對于其他天然植物纖維的降解能力較差。同理，桑葉誘導(dǎo)制備的纖維素酶，降解桑葉的能力較強(qiáng)；而桑葉誘導(dǎo)制備的纖維素酶對于其他天然植物纖維的降解能力較差。為了增強(qiáng)誘導(dǎo)物的活性，增加纖維素酶的產(chǎn)量，比較優(yōu)選的，步驟(I)中，先對底物 進(jìn)行粉碎至60目，然后60°C烘干至恒重。步驟(I)中，所述特定植物纖維一般可選擇為桑葉和紙漿，當(dāng)然也可以選擇其他特定的植物纖維。步驟(2)中，所述纖維素酶產(chǎn)生菌為黑曲霉、里氏木霉、綠色木霉或康寧木霉。纖維素酶產(chǎn)生菌的活化培養(yǎng)可以按照通常的方法進(jìn)行，可以單獨進(jìn)行固態(tài)活化培養(yǎng)或液態(tài)活化培養(yǎng)，但是，為了增強(qiáng)纖維素酶產(chǎn)生菌的活性，優(yōu)選的，對步驟(2)中纖維素酶產(chǎn)生菌的活化培養(yǎng)通過如下兩步完成
(2-1)纖維素酶產(chǎn)生菌的固態(tài)培養(yǎng)活化
在無菌條件下，將纖維素酶產(chǎn)生菌接種至PDA固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫靜置培養(yǎng)3-4d，然后4 °C儲存；
(2-2)纖維素酶產(chǎn)生菌的液態(tài)培養(yǎng)活化
將纖維素酶產(chǎn)生菌的斜面培養(yǎng)基取出，在無菌條件下挑取一環(huán)孢子，并接種至裝有液態(tài)活化培養(yǎng)基的錐形瓶中，在28 °C下靜置培養(yǎng)2 d。步驟(4)中，所述鹽析過程為，將發(fā)酵液取出常溫常壓過濾，在4°C和磁力攪拌器勻速攪拌條件下進(jìn)行鹽析，添加硫酸銨的飽和度達(dá)50%，攪拌充分混合30min。為了進(jìn)一步增強(qiáng)固液分離效果，鹽析后再在10000 r/min條件下離心10 min。步驟(4)中，所述透析過程為，將鹽析后的發(fā)酵液注入透析袋中，在pH為4. 8、溫度為4°C的O. 05M的檸檬酸一朽1檬酸鈉緩沖液中透析24 h。有益效果本發(fā)明方法用來誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶的材料廉價而且來源豐富，解決目前纖維素酶的生產(chǎn)過程中酶活性低的難題，有助于解決生物質(zhì)能源生產(chǎn)中的瓶頸問題。本發(fā)明方法操作簡便，工藝簡單，而且對于特定植物纖維的水解率高。
具體實施例方式下面對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所述實施例。實施例I :底物的選取和處理
用粉碎機(jī)將桑葉和紙漿粉碎至60目，最后于60°C烘至恒重。
實施例2 :誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素酶 按照如下步驟進(jìn)行
一、黑曲霉的活化培養(yǎng)
I、黑曲霉的固態(tài)培養(yǎng)活化
在無菌條件下，將黑曲霉干粉接種至PDA培養(yǎng)基上，28°C恒溫靜置培養(yǎng)6 d，然后儲存于4 °C環(huán)境中制備成斜面培養(yǎng)基。
PDA培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、水1000 mL、瓊脂20 g。2、對黑曲霉的液態(tài)培養(yǎng)活化
將儲存于4 °C冰箱中的黑曲霉的斜面培養(yǎng)基取出，在無菌條件下挑取一環(huán)孢子，并接種至裝有50 mL活化培養(yǎng)基的錐形瓶中。最后在28 °C下靜置培養(yǎng)2 d。液態(tài)活化培養(yǎng)基的配方為葡萄糖10g/L，蛋白胨I g/L，吐溫80 0.5 g/L,(NH4)2SO4 I. 4 g/L, KH2PO4 2 g/L，尿素 O. 3 g/L, CaCl2. H2O O. 4 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3 g/L，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 0.005 g/L，MnSO4 · H2O 0.0016 g/L, ZnSO4 · 7H20 0.0014 g/L, CoCl2 · 6H200. 0037 g/L, pH 5. 0 ;最后在 121°C下滅菌 20 min。二、纖維素酶的誘導(dǎo)
分別取O. 3g經(jīng)實施例I粉碎的桑葉和紙漿為誘導(dǎo)物制備產(chǎn)酶培養(yǎng)基，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。在無菌條件下，量取5 mL上述制備的黑曲霉活化培養(yǎng)液至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，發(fā)酵總體積為50 mL，最后于28°C，180 r/min下培養(yǎng)5 d，然后將發(fā)酵液取出并過濾，濾液即為粗酶液。產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配方為誘導(dǎo)物(分別為桑葉和紙漿)6 g/L，葡萄糖I. 5 g/L，微晶纖維素 3 g/L，蛋白胨 2 g/L, (NH4)2SO4 2. 8 g/L，KH2PO4 4 g/L，尿素 O. 6 g/L，CaCl2 · H2O 0.8g/L, MgSO4 · 7H20 0. 6 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 010 g/L, MnSO4 · H2O 0. 0032 g/L, ZnSO4 · 7H200. 0028 g/L, CoCl2 · 6H20 0. 0074 g/L,吐溫 80 0. 5 g/L, pH 5. 0 ;最后在 121°C下滅菌 20min。三、發(fā)酵液的鹽析和透析
鹽析將發(fā)酵液取出常溫常壓過濾，在4°C和磁力攪拌器勻速攪拌條件下進(jìn)行鹽析，緩慢添加經(jīng)干燥和研磨的硫酸銨粉末至粗酶液中，使酶液中硫酸銨的飽和度達(dá)50%，攪拌充分混合30min ;然后再在10000 r/min條件下離心10 min。透析袋的處理采用50%的乙醇慢慢煮沸透析袋數(shù)小時，再分別用50%乙醇、
O.01mol/L碳酸氫鈉溶液和O. 001mol/L的DETA溶液依次洗滌，最后用蒸餾水浸洗三次。透析將鹽析后的發(fā)酵液注入處理好的透析袋內(nèi)，留一半左右的空間。扎緊透析袋頂部，然后將透析袋進(jìn)入盛有0.05M pH 4. 8檸檬酸一梓檬酸鈉緩沖液的燒杯中，4°C透析24h，每隔Ih換緩沖液，4次左右收集透析液。實施例3 :特定植物纖維的水解 特定植物纖維為桑葉粉和紙漿。以實施例2粉碎的桑葉與紙漿共2種底物誘導(dǎo)制備的纖維素酶，分別水解這2種特定植物纖維，即分別用每一種底物誘導(dǎo)制備的纖維素酶去降解這2種特定植物纖維。實驗步驟如下I、向10 mL血清瓶中各加入0.04 g的特定植物纖維，I mL O. 05 M檸檬酸鈉緩沖液及
5mL適度稀釋的酶液在50°C恒溫振蕩搖床上，以180 r/min振蕩48 h，同時，分別以失活的酶液作為空白對照。2、反應(yīng)完后，取出并煮沸失活，然后10000 r/min，離心5 min，取0.5 mL上清液，
并用SBA — 40D生物傳感分析儀測量葡萄糖的含量，測量結(jié)果見表I。表I特定植物纖維誘導(dǎo)纖維素酶降解內(nèi)源性底物產(chǎn)生的葡萄糖
權(quán)利要求
1.一種用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟 (1)底物選取取特定植物纖維作為底物； (2)纖維素酶產(chǎn)生菌的活化培養(yǎng)將纖維素酶產(chǎn)生菌接種至含有活化培養(yǎng)基的器皿中靜置培養(yǎng)制得纖維素酶產(chǎn)生菌的活化培養(yǎng)液； (3)纖維素酶的誘導(dǎo)將步驟(I)的底物作為誘導(dǎo)物，制備產(chǎn)酶培養(yǎng)基；將步驟(2)的纖維素酶產(chǎn)生菌的活化培養(yǎng)液接種到所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)酶，在25 30°C，轉(zhuǎn)速為100 180 r/min條件下培養(yǎng)，發(fā)酵時間為3 7 d，得到發(fā)酵液； 其中，所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配方為誘導(dǎo)物2 6 g/L，葡萄糖I 3 g/L，微晶纖維素2 3 g/L，蛋白胨 I 2 g/L, (NH4)2SO4 2 3 g/L, KH2PO4 3 4 g/L，尿素 O. 4 O. 6 g/L,CaCl2 · 2H20 O. 6 I. O g/L, MgSO4 · 7H20 O. 4 O. 8g/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 0· 04 g/L,MnSO4 · H2O O. 001 O. 004 g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 002 0· 004 g/L, CoCl2 · 6Η20 O. 004 O.008 g/L,吐溫 80 0· 3 0· 5 g/L，其余為水，pH 5. O ； (4)發(fā)酵液的鹽析和透析將發(fā)酵液分別進(jìn)行鹽析和透析處理，得到用于特定植物纖維素水解的纖維素酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(I)中，先對底物粉碎至60目，然后烘干至恒重。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(I)中，所述特定植物纖維為桑葉粉和紙漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(2)中，所述纖維素酶產(chǎn)生菌為黑曲霉、里氏木霉、綠色木霉或康寧木霉。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(2)中，纖維素酶產(chǎn)生菌的活化培養(yǎng)包括如下步驟 (2-1)纖維素酶產(chǎn)生菌的固態(tài)培養(yǎng)活化 在無菌條件下，將纖維素酶產(chǎn)生菌接種至PDA固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫靜置培養(yǎng)3-4d，然后4 °C儲存； (2-2)纖維素酶產(chǎn)生菌的液態(tài)培養(yǎng)活化 將纖維素酶產(chǎn)生菌的斜面培養(yǎng)基取出，在無菌條件下挑取一環(huán)孢子，并接種至裝有液態(tài)活化培養(yǎng)基的錐形瓶中，在28 °C下靜置培養(yǎng)2 d。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述鹽析過程為，將發(fā)酵液取出常溫常壓過濾，在4°C和磁力攪拌器勻速攪拌條件下進(jìn)行鹽析，添加硫酸銨的飽和度達(dá)50%，攪拌充分混合30min ;然后再在10000 r/min條件下離心10 min。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述透析過程為，將鹽析后的發(fā)酵液注入透析袋中，在pH為4. 8、溫度為4°C的O.05M的檸檬酸一梓檬酸鈉緩沖液中透析24 h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶的生產(chǎn)方法，纖維素酶產(chǎn)生菌經(jīng)過活化培養(yǎng)后，分別以甘蔗渣等天然植物纖維作為底物，將纖維素酶產(chǎn)生菌接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行纖維素酶的誘導(dǎo)，發(fā)酵產(chǎn)酶，取出發(fā)酵液，過濾、鹽析、透析獲得粗酶液。天然植物纖維的組成不同，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的纖維素酶酶系組成和降解天然植物纖維的能力也有差異。比如，甘蔗渣誘導(dǎo)制備的纖維素酶，降解甘蔗渣的能力較強(qiáng)；而甘蔗渣誘導(dǎo)制備的纖維素酶對于其他天然植物纖維的降解能力較差。本發(fā)明提供的一種用于特定植物纖維高效水解的纖維素酶生產(chǎn)方法，具有操作簡便，工藝簡單，可為天然植物纖維降解酶的工業(yè)生產(chǎn)提供了指導(dǎo)性原則。
文檔編號C12R1/885GK102899301SQ201210434660
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者李強(qiáng), 谷緒頂, 季更生, 費娟娟, 馮圓圓 申請人:江蘇科技大學(xué)