專利名稱：一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)魚類深加工利用的方法，特別是一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一種源自于生物體內(nèi)的氧自由基清除劑，它能夠維持生物體內(nèi)超氧陰離子的動態(tài)平衡，防止因體內(nèi)O2 ■ ·濃度過高而引起的不良反應(yīng)，被譽為“人體垃圾清道夫”，在抗衰老、抗炎癥、抗氧化、抗輻射和防治腫瘤等方面顯示出了獨特的功能，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和日用化工等行業(yè)。目前，國內(nèi)外利用陸生動植物(特別是豬、牛、羊血液和大蒜)和微生物開發(fā)SOD的研究較多，而有關(guān)從水生生物如魚、蝦等中開發(fā)SOD的研究甚少，特別是利用羅非魚血液提純SOD的研究未見報道。
中國是世界上最大的羅非魚養(yǎng)殖生產(chǎn)國家，羅非魚加工廠將羅非魚血作為廢物排放，每年向環(huán)境中排放的羅非魚血達(dá)I. 2X IO4噸。而羅非魚血中富含如超氧化物歧化酶、血紅蛋白等多種有效成分，實現(xiàn)羅非魚血的綜合利用不僅可以避免環(huán)境污染，而且能夠顯著地增加企業(yè)的附加值，優(yōu)化企業(yè)的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)。常見的SOD提純技術(shù)有熱變性法、鹽析法、有機溶劑法和層析法等，但是迄今報道的眾多關(guān)于不同原材料的SOD提純工藝和參數(shù)不盡相同，因此，開發(fā)一條適合羅非魚血綜合利用的SOD提純工藝路線顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，從而使這些廢棄羅非魚血液資源得到高值化利用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下實施方案來實現(xiàn)的一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，其步驟包括a.紅細(xì)胞破碎將收集到的潔凈羅非魚血紅細(xì)胞用廣2倍體積的雙蒸水稀釋后，在超聲功率30(T400W條件下作用15 20min進(jìn)行紅細(xì)胞破碎處理，然后5000 Xg離心15min，收集上層紅細(xì)胞液；b.乙醇、氯仿沉淀先后加入無水乙醇和氯仿到紅細(xì)胞液中，邊加邊攪拌，攪拌20min后，靜置30min，然后10000 Xg離心15min，收集上清液；再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿；c.熱變性處理將步驟b所得上清液在60°C條件下恒溫水浴15 20min，冷卻后10000 X g離心15min,收集上清液；d.陰離子交換將步驟c所得上清液在多功能蛋白快速純化液相色譜系統(tǒng)輔助下，采用陰離子交換法，制得SOD液。本發(fā)明還將得到的SOD液用可截留分子量為IOKDa的膜系統(tǒng)離心超濾，進(jìn)行脫鹽和濃縮，收集濃縮液，并在-20°C條件下封存。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的效果
(I)本發(fā)明首次從羅非魚血液中提純S0D，為羅非魚血液的綜合利用提供了一條有效的途徑，使這些原本廢棄的資源得到高效利用，從而可以大大提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，還能帶來莫大的社會效益。(2)本發(fā)明首先是利用超聲技術(shù) 進(jìn)行有效的細(xì)胞破碎，然后采用乙醇、氯仿沉淀實現(xiàn)SOD與血紅蛋白的同步分離，再利用SOD耐熱性好的特點，通過熱變性處理去除雜蛋白；并使用多功能蛋白快速純化液相色譜系統(tǒng)對陰離子交換過程進(jìn)行控制，最后用離心超濾進(jìn)行脫鹽和濃縮后得到SOD ;這樣SOD純化過程變得非常簡捷、高效。結(jié)果表明，本發(fā)明制備的SOD比活力為7541U/mg，回收率為50. 8%，純化倍數(shù)為1832，經(jīng)PAGE鑒定為一條帶，達(dá)到了電泳純，SOD分子量為32KDa。(3)本發(fā)明工藝過程簡單，生產(chǎn)周期短，條件穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)，可向食品、醫(yī)藥和日用化工等行業(yè)提供價格低廉、安全可靠的SOD產(chǎn)品。
具體實施例方式實例一取潔凈羅非魚血紅細(xì)胞100ml，加入IOOml雙蒸水輕輕混勻，放入超聲儀中，將功率調(diào)至300W，作用15min，5000Xg離心15min，收集上層紅細(xì)胞液。先后緩慢加入15ml的無水乙醇和IOml的氯仿到紅細(xì)胞液中，邊加邊攪拌，攪拌15min后，靜置30min，10000Xg離心15min，收集上清液，再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿。將上步所得上清液在60°C條件下恒溫水浴15min，迅速冷卻后IOOOOXg離心15min,再次收集上清液。配制500ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液作為離子交換起始緩沖液(A液)，配制1000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含lmol/L NaCl)作為離子交換洗脫緩沖液(B液)，在多功能蛋白快速純化液相色譜系統(tǒng)控制下(系統(tǒng)可選用AKTA purifier 10品牌產(chǎn)品)，用A液將再次收集的上清液加載到離子交換柱上(離子交換柱可選用和上述品牌配套的HiTrap DEAE FF產(chǎn)品)，用B液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集活性峰，即得高純度SOD 液。實例二取潔凈羅非魚血紅細(xì)胞100ml，加入200ml雙蒸水輕輕混勻，放入超聲儀中，將功率調(diào)至400W，作用20min，5000Xg離心15min，收集上層紅細(xì)胞液。先后緩慢加入IOml的無水乙醇和15ml的氯仿到紅細(xì)胞液中，邊加邊攪拌，攪拌20min后，靜置30min，10000Xg離心15min，收集上清液，再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿。將上步所得上清液在60°C條件下恒溫水浴20min，迅速冷卻后IOOOOXg離心15min,再次收集上清液。配制500ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液作為離子交換起始緩沖液(A液)，配制500ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含lmol/L NaCl)作為離子交換洗脫緩沖液(B液)，用A液將再次收集的上清液加載到離子交換柱上，用B液進(jìn)行分步洗脫，收集活性峰，即得高純度SOD液。將得到的SOD液用可截留分子量為IOKDa的膜系統(tǒng)離心超濾，進(jìn)行脫鹽和濃縮，收集濃縮液，即為純凈的SOD終產(chǎn)品，將其在_20°C條件下封存。
實例三取潔凈羅非魚血紅細(xì)胞1000ml，加入2000ml雙蒸水輕輕混勻，放入超聲儀中，將功率調(diào)至400W，作用20min，5000Xg離心15min，收集上層紅細(xì)胞液。先后緩慢加入IOOml的無水乙醇和IOOml的氯仿到紅細(xì)胞液中邊加邊攪拌，攪拌20min后,靜置30min, 10000 Xg離心15min,收集上清液,再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿。將上步所得上 清液在60°C條件下恒溫水浴15min，迅速冷卻后IOOOOXg離心15min,再次收集上清液。配制5000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液作為離子交換起始緩沖液(A液)，配制5000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含lmol/L NaCl)作為離子交換洗脫緩沖液(B液)，用A液將上述再次收集到的上清液加載到離子交換柱上，用B液進(jìn)行分步洗脫，收集活性峰，即得高純度SOD液。將得到的SOD液用可截留分子量為IOKDa的膜系統(tǒng)離心超濾，進(jìn)行脫鹽和濃縮，收集濃縮液，將濃縮液在_20°C條件下急凍后，進(jìn)行真空冷凍干燥，即得SOD干粉終產(chǎn)品。本發(fā)明的實施方式不限于此，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，均落在本發(fā)明權(quán)利保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，其特征在于包括以下步驟 a.紅細(xì)胞破碎將收集到的潔凈羅非魚血紅細(xì)胞用廣2倍體積的雙蒸水稀釋后，在超聲功率30(T400W條件下作用15 20min進(jìn)行紅細(xì)胞破碎處理，然后5000 Xg離心15min，收集上層紅細(xì)胞液； b.乙醇、氯仿沉淀先后加入無水乙醇和氯仿到紅細(xì)胞液中，邊加邊攪拌,攪拌20min后，靜置30min，然后10000Xg離心15min，收集上清液；再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿； c.熱變性處理將步驟b所得上清液在60°C條件下恒溫水浴15 20min，冷卻后10000 X g離心15min,收集上清液； d.陰離子交換將步驟c所得上清液在多功能蛋白快速純化液相色譜系統(tǒng)輔助下，采用陰離子交換法，制得SOD液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，其特征在于將得到的SOD液用可截留分子量為IOKDa的膜系統(tǒng)離心超濾，進(jìn)行脫鹽和濃縮，收集濃縮液，并在-20°C條件下封存。
3.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述的步驟b中先后按羅非魚血紅細(xì)胞體積比加入1(Γ15%的無水乙醇和1(Γ15%的氯仿。
4.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，其特征在于步驟d中多功能蛋白快速純化液相色譜系統(tǒng)中，配制1000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液作為離子交換起始緩沖液；配制1000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液并內(nèi)含lmol/L NaCl作為離子交換洗脫緩沖液；用起始緩沖液將上清液加載到離子交換柱上，用洗脫緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集活性峰，即得高純度SOD液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶(SOD)的方法，包括以下步驟將收集到的潔凈羅非魚血紅細(xì)胞用雙蒸水稀釋后，經(jīng)超聲波輔助細(xì)胞破膜處理；依次加入無水乙醇和氯仿沉淀雜蛋白，離心，收集上清液，并用氮吹儀去除有機溶劑；將收集到的上清液在60℃條件下加熱處理，離心，收集上清液；采用多功能蛋白快速純化液相色譜系統(tǒng)控制，將經(jīng)上述步驟得到的SOD液用陰離子交換進(jìn)行純化，得到的高純度SOD液。本發(fā)明提純方法耗時短，操作單元精簡，適合于工業(yè)化生產(chǎn)；能較好地解決羅非魚血排放造成的環(huán)境污染問題，并能夠顯著地增加企業(yè)的附加值。
文檔編號C12N9/02GK102888386SQ20121043409
公開日2013年1月23日 申請日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日
發(fā)明者李來好, 岑劍偉, 楊賢慶, 郝淑賢, 劉在軍, 吳燕燕, 黃卉, 魏涯, 林婉玲, 鄧建朝, 周婉君, 石紅 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所