一種熒光檢測dna殘留量實驗中dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種熒光檢測DNA殘留量實驗中DNA提取方法，其特點是：(1)磁珠法提取樣品中殘留DNA提取，A消化蛋白酶反應，B磁珠綁定DNA，C清洗DNA，D稀釋樣品DNA；(2)酚—異丙醇法提取DNA；(3)picogreen檢驗。本發(fā)明采用磁珠提取，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酚氯仿法提取疫苗中的殘留DNA，并用PicoGreen試驗驗證此磁珠提取技術可以降低了污染物質，如酚?異丙醇、氯化鈉等，對熒光信號的影響，從而得到相對準確的檢驗結果。
【專利說明】—種熒光檢測DNA殘留量實驗中DNA提取方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物制備中的實驗方法，特別是涉及一種生物制品中宿主細胞DNA殘留量檢測及微量基因組DNA提取的熒光檢測DNA殘留量實驗中DNA提取方法。
【背景技術】
[0002]細胞基質作為主要原材料，其質量的優(yōu)劣，直接影響疫苗等生物制品的質量和產(chǎn)量，尤其是生物制品的安全性。一般認為，細胞基質存在的潛在危險因素包括:促生長蛋白及細胞殘留蛋白、潛在病毒、細胞DNA。其中殘余DNA—直是人們關注的熱點。由于連續(xù)傳代細胞(continuous cell lines)調控生長的基因失調，使得傳代細胞系具有無限的壽命。因此，理論上認為傳代細胞系的DNA具有使其他細胞生長失控和產(chǎn)生致瘤活性的潛在能力，需要對其DNA殘留量進行質量控制。
[0003]DNA提取技術是分子生物學研究的基礎技術。DNA提取技術是DNA檢驗的第一步驟，也是最關鍵的步驟。能否成功地定量進行DNA檢驗，完全取決于能否從樣品中獲得全量的DNA。DNA提取技術的優(yōu)劣，將直接關系到最終檢驗結果。
[0004]殘余DNA分析需要對mg級樣本中pg水平的DNA進行準確定量。樣本本身，無論是蛋白還是其他化學成份，都可能產(chǎn)生基質效應從而影響檢測過程，因此需要對有干擾樣本進行前期處理。蛋白樣本通常需要進行蛋白酶消化。傳統(tǒng)的DNA抽提方法是分子生物學中常用的酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法，但這種抽提方法通常回收率較低，因此像糖原等載體分子的應用對于回收率的提高是必不可少的。美國藥典USP32中推薦了一種商品化DNA提取試劑盒，它是利用離液劑(碘化鈉)和表面活性劑(N月桂酰肌氨酸鈉)來破壞DNA和樣本的結合，然后DNA和載體分子糖原共同被異丙醇沉淀下來。
[0005]磁珠抽提DNA的方法是利用糖原、酵母tRNA將樣本中殘余DNA吸附于磁珠微粒上，利用磁力架進行DNA抽提，該方法的回收率能達到80%~100%。
[0006]樣本提取是一個額外的處理步驟，可能會引起殘余DNA不完全回收或引入環(huán)境中外源性DNA，因此在樣本處理的每一步都需要格外細心，同時增加回收率試驗進行評價。USP32中指出加標回收率在80%~120%是殘余DNA檢測中可以接受的標準。當樣本中存在干擾因素或抽提過程達不到這一回收率范圍時，可以通過加標回收率校正DNA檢測結果。
[0007]在采用picogreen或Q-PCR等以熒光方式檢測疫苗中宿主DNA殘留量實驗中，對樣品中殘留DNA的提取條件要求苛刻，不僅在樣品回收率方面，在整個提取過程中引入外來試劑的殘留都會對熒光信號產(chǎn)生影響。進而影響最終結果。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術的上述不足，公開一種熒光檢測DNA殘留量實驗中DNA提取方法。 [0009]本發(fā)明采用一種新的DNA提取技術(磁珠提取)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酚氯仿法提取疫苗中的殘留DNA。并用PicoGreen試驗驗證此技術(磁珠提取)可以降低了污染物質(如酚異丙醇、氯化鈉等)對熒光信號的影響，從而得到相對準確的檢驗結果。
[0010]本發(fā)明給出的技術方案是:這種熒光檢測DNA殘留量實驗中DNA提取方法，其特征在于有以下步驟:
[0011](I)磁珠法提取樣品中殘留DNA提取
[0012]A、消化蛋白酶反應
[0013]在1.5ml離心管中加入樣品100 μ 1，加入0.2%蛋白酶K溶液20 μ 1，加入蛋白酶K緩沖液200 μ 1，56°C培養(yǎng)30min,培養(yǎng)后每管加肝素40 μ g、2 μ g tRNA ；
[0014]B、磁珠綁定DNA
[0015]將磁珠重懸、震蕩混勻后，每管加15 μ I磁珠；再加入200 μ I無水乙醇、倒轉2次、鏇潤混勻5min、spinl5s、磁力架靜止5min,吸除懸浮液體；
[0016]C、清洗 DNA
[0017]I)從磁力架取下，加500 μ I緩沖液(如磁珠貼管壁，應緩慢沖洗)、倒轉2次、漩潤混合5 s ；
[0018]2) spin 15s ;在磁力架靜止Imin ;吸出懸浮液體(不要接觸磁珠)；
[0019]3)從磁力架取下， 加500 μ I洗液(如磁珠貼管壁，應緩慢沖洗)、倒轉2次、漩渦混合5 s ；
[0020]4) spin 15s、磁力架靜止Imin吸出懸浮液體(不要接觸磁珠)；
[0021]5)從磁力架取下，加500 μ I洗液(如磁珠貼管壁，應緩慢沖洗)、倒轉2次、漩渦混合5 s ；
[0022]6) spin 15s、磁力架靜止Imin ;吸出懸浮液體(不要接觸磁珠)(盡量吸取干凈)；
[0023]7)空氣干燥5min (去除殘留乙醇干擾)；
[0024]D、稀釋樣品DNA
[0025]I)每管加100 μ I TE (洗脫液)(吸頭反復吹打);
[0026]2)高速漩渦混合10s、培養(yǎng)70°C、7min。在此期間混合2_3次，有助于懸?。?br> [0027]3) spinl5s、磁力架靜止2min、將含有DNA的洗脫液全部轉移至新管,用于檢測；
[0028](2)酚-異丙醇法提取DNA
[0029]在1.5ml離心管中加入樣品100 μ I ;加入2%蛋白酶K溶液I微升；加入蛋白酶K緩沖液12 μ I ;37°C培養(yǎng)4小時Spin后，上述樣品管加入等體積的Tris飽和酚，劇烈混合30秒,冰浴中放置5min。15000g離心IOmin ;小心移取上層液體至新管中，每管加入3mol/L乙酸鈉溶液60 μ 1，再加入600 μ I預冷異丙醇，顛倒混合，-20°c過夜；15000g離心15min，棄去上清；加入500μ I 75%冰冷乙醇洗滌沉淀，15000g離心15min，棄去上清；沉淀在熱蒸干器中干燥，直至管內液體全部蒸后，加IOOyl TE buffer溶解DNA;
[0030](3) picogreen 檢驗
[0031]I)使用前恢復室溫，染料用TE緩沖液200倍稀釋；使用塑料容器；需避光，防止染料見光分解；制備后幾小時內使用；
[0032]2)將稀釋后的標準品與樣品與等體積的染料混合，每孔中加入200微升。測定各孔熒光值。
[0033]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0034]1.能夠自動化操作,代替手工操作,避免人為的干擾。[0035]2.節(jié)省大量核酸提取時間，適用于在線監(jiān)測。
【具體實施方式】:
[0036]下面結合實施例對本發(fā)明給出的技術方案做出進一步說明。
[0037]在提取樣品前中加入了 IOng DNA，檢測其在提取樣品中的回收率；證明此提取方法對殘留DNA是否損失。檢驗當采取兩種提取方法處理的同一樣品時，最終檢測結果是否相同。
[0038]這種熒光檢測DNA殘留量實驗中DNA提取方法有以下步驟:
[0039]一磁珠法提取樣品中殘留DNA提取
[0040]A、消化蛋白酶反應
[0041]在1.5ml離心管中加入樣品100μ I ;加入0.2%蛋白酶K溶液20μ I ;加入蛋白酶K緩沖液200 μ I。56°C培養(yǎng)30min。培養(yǎng)后每管加肝素40 μ g、2 μ g tRNA。
[0042]B、磁珠綁定DNA
[0043]將磁珠重懸、震蕩混勻后，每管加15 μ I磁珠；再加入200 μ I無水乙醇、倒轉2次、鏇潤混勻5min、spinl5s、磁力架靜止5min,吸除懸浮液體。
[0044]C、清洗 DN A
[0045]I從磁力架取下，加500 μ I緩沖液(如磁珠貼管壁，應緩慢沖洗)、倒轉2次、漩渦混合5s。
[0046]2spin 15s ;在磁力架靜止Imin ;吸出懸浮液體。(不要接觸磁珠)
[0047]3從磁力架取下，加500 μ I洗液(如磁珠貼管壁，應緩慢沖洗)、倒轉2次、漩渦混合5s。
[0048]4spin 15s、磁力架靜止Imin吸出懸浮液體。(不要接觸磁珠)
[0049]5從磁力架取下，加500 μ I洗液(如磁珠貼管壁，應緩慢沖洗)、倒轉2次、漩渦混合5s。
[0050]6spin 15s、磁力架靜止Imin ;吸出懸浮液體(不要接觸磁珠)(盡量吸取干凈)
[0051]7空氣干燥5min。(去除殘留乙醇干擾)
[0052]D、稀釋樣品DNA
[0053]I每管加100 μ I TE (洗脫液)(吸頭反復吹打)
[0054]2高速漩渦混合10s、培養(yǎng)70°C、7min。在此期間混合2_3次，有助于懸浮。
[0055]3spinl5s、磁力架靜止2min、將含有DNA的洗脫液全部轉移至新管,用于檢測。
[0056]二酚-異丙醇法提取DNA
[0057]在1.5ml離心管中加入樣品100 μ I ;加入2%蛋白酶K溶液I微升；加入蛋白酶K緩沖液12 μ I。37°C培養(yǎng)4小時Spin后，上述樣品管加入等體積的Tris飽和酚，劇烈混合30秒，冰浴中放置5min。15000g離心lOmin。小心移取上層液體至新管中。每管加入3mol/L乙酸鈉溶液60 μ 1，再加入600 μ I預冷異丙醇，顛倒混合，_20°C過夜。15000g離心15min，棄去上清。加入500μ1 75%冰冷乙醇洗滌沉淀。15000g離心15min，棄去上清。沉淀在熱蒸干器中干燥，直至管內液體全部蒸后，加IOOyl TE buffer溶解DNA。
[0058]三picogreen 檢驗
[0059]I使用前恢復室溫，染料用TE緩沖液200倍稀釋；使用塑料容器；需避光，防止染料見光分解；制備后幾小時內使用。
[0060]2將稀釋后的標準品與樣品與等體積的染料混合。每孔中加入200微升。測定各孔熒光值
[0061]檢驗結果
[0062]
【權利要求】
1.一種熒光檢測DNA殘留量實驗中DNA提取方法，其特征在于有以下步驟: (1)磁珠法提取樣品中殘留DNA提取 A、消化蛋白酶反應 在1.5ml離心管中加入樣品100 μ I，加入0.2 %蛋白酶K溶液20 μ I，加入蛋白酶K緩沖液200 μ 1，56°C培養(yǎng)30min,培養(yǎng)后每管加肝素40 μ g、2 μ g tRNA ； B、磁珠綁定DNA 將磁珠重懸、震蕩混勻后,每管加15 μ I磁珠；再加入200 μ I無水乙醇、倒轉2次、漩渦混勻5min、spinl5s、磁力架靜止5min,吸除懸浮液體； C、清洗DNA 1)從磁力架取下，加500μ I緩沖液(如磁珠貼管壁，應緩慢沖洗)、倒轉2次、漩渦混合5s ； 2)spin 15s ;在磁力架靜止Imin ;吸出懸浮液體(不要接觸磁珠)； 3)從磁力架取下，加500μ I洗液(如磁珠貼管壁，應緩慢沖洗)、倒轉2次、漩渦混合5s ； 4)spin 15s、磁 力架靜止Imin吸出懸浮液體(不要接觸磁珠)； 5)從磁力架取下，加500μ I洗液(如磁珠貼管壁，應緩慢沖洗)、倒轉2次、漩渦混合5s ； 6)spin 15s、磁力架靜止Imin ;吸出懸浮液體(不要接觸磁珠)； 7)空氣干燥5min(去除殘留乙醇干擾)； D、稀釋樣品DNA 1)每管加100μ I TE洗脫液(吸頭反復吹打); 2)高速漩渦混合10s、培養(yǎng)70°C、7min，在此期間混合2_3次，有助于懸??； 3)spinl5s、磁力架靜止2min、將含有DNA的洗脫液全部轉移至新管,用于檢測； (2)酚-異丙醇法提取DNA 在1.5ml離心管中加入樣品100μ I ;加入2%蛋白酶K溶液I微升；加入蛋白酶K緩沖液12 μ I ;37°C培養(yǎng)4小時Spin后，上述樣品管加入等體積的Tris飽和酚，混合30秒，冰浴中放置5min, 15000g離心IOmin ;小心移取上層液體至新管中，每管加入3mol/L乙酸鈉溶液60 μ 1，再加入600 μ I預冷異丙醇，顛倒混合，-20°C過夜；15000g離心15min，棄去上清；加入500 μ I 75%冰冷乙醇洗滌沉淀，15000g離心15min，棄去上清；沉淀在熱蒸干器中干燥，直至管內液體全部蒸后，加100 μ I TE緩沖液溶解DNA ； (3)picogreen檢驗 1)使用前恢復室溫，染料用TE緩沖液200倍稀釋；使用塑料容器；需避光，防止染料見光分解；制備后0.5小時內使用； 2)將稀釋后的標準品與樣品與等體積的染料混合，每孔中加入200微升。測定各孔熒光值。
【文檔編號】C12N15/10GK103773754SQ201210397631
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月18日 優(yōu)先權日:2012年10月18日
【發(fā)明者】高旭哲 申請人:遼寧成大生物股份有限公司